豬MMP9基因的多態性與產仔數性狀的關聯分析

劉林清,李慶崗,蘇世廣,周 梅,張 威,王重龍

(安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所,畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室,安徽合肥 230031)

MMPs作為一類活性依賴于鋅離子的肽鏈內切酶,在卵泡和子宮外組織的動態變化中發揮一定的調控作用。MMPs的合成與分泌與卵泡破裂卵子排出的生化反應有關,包括生長因子、細胞因子、孕酮、前列腺素和蛋白水解酶等。并且蛋白水解酶可以通過降解卵泡壁結締組織,從而促進排卵[1]。增強MMP的活性可加速降解卵泡細胞外基質,抑制MMP活性后,排卵過程某種程度上受到抑制[2-4]。MMP9作為MMPs的家族成員之一,參與降解IV型膠原底物,IV型膠原是基膜的主要成分且其他基膜元件也可通過IV型膠原相結合,從而在繁殖組織的發育和重塑過程中發揮重要作用[5-6]。研究發現,MMP9及其抑制因子TIMP2參與胚泡對子宮內膜的侵入[7]。Robker等[8]研究發現,在小鼠內源LH峰或hCG處理后,MMP9基因表達量上升。這些研究結果進一步暗示了MMP9 基因在卵泡的發育和排卵過程中發揮作用。

為此,筆者建立了MMP9 基因的PCR-SmaI-RFLP分型技術,并在淮豬新品系Ⅱ豬群中進行多態性分型,檢測該位點的多態性及其與產仔數性狀進行關聯分析,以期為提高豬產仔數提供一個有用的分子標記。

1 材料與方法

1.1 材料試驗地點在安徽省科鑫養豬育種有限公司;于2014年7月采集85頭淮豬新品系Ⅱ系豬的耳組織,放置于75%乙醇的離心管中,-20 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1DNA提取。采用苯酚-氯仿抽提法,TE溶解,-20 ℃冷凍保存。

1.2.2引物的設計與合成。根據MMP9基因DNA序列,應用Premier 5.0軟件在多態位點(第10內含子)兩側,設計一對引物,突變位點可用限制性內切酶SmaI識別,引物由上海生工生物公司合成。引物信息:MMP9基因的上游引物5′-TCATGTCCCCAGGAAGTAC -3′,下游引物5′-GGCCCAACTTATCCAGAC -3′,片段長度為559 bp,退火溫度為55.6 ℃。

1.2.3PCR擴增。PCR反應體系為25 μL,其中PCR 2×Taqmix 12.5 μL,10 mmol/μL的引物各0.5 μL,DNA模板1.0 μL(DNA約100 ng),加ddH2O至25 μL。PCR反應條件為第1步95 ℃變性5 min;第2步95 ℃變性45 s;第3步55.6 ℃復性40 s;第4步72 ℃延伸35 s;重復第2～4步35個循環,之后72 ℃延伸10 min,最后降溫至4 ℃保存。PCR擴增產物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳,核酸染料染色,凝膠成像系統中觀察,可見到片段大小為559 bp的清晰條帶。

1.2.4限制性內切酶酶切(RFLP)。MMP9基因的PCR產物用SmaI內切酶酶切,反應體系:10×Buffer 1.0 μL,SmaI酶0.3 μL(10 U/μL),加PCR產物至10 μL;37 ℃反應8～12 h;酶切產物在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳,核酸染料染色,凝膠成像系統中觀察。

1.3 數據分析

1.3.1統計分析的軟件。采用SAS 8.0統計軟件(SAS Institute Inc,Version 8 Edition)的GLM程序進行方差分析,并進行顯著性檢驗。

1.3.2基因效應統計分析模型。依據Liu[9]的方法建立的單標記回歸統計模型,除豬個體為隨機效應外,其他因素均為固定效應。所采用模型Y=平均值+基因型+胎次效應+殘差,其中Y為性狀表型值。

2 結果與分析

2.1 豬MMP9基因的多態位點檢測PCR擴增片段長度為559 bp,經SmaI酶切后產生3種基因型(圖1)。當多態位點為CC基因型時,則造成了SmaI酶切位點,PCR產物經SmaI消化后產生2個片段(464 bp+95 bp),記為等位基因C;當多態位點為TT基因型時,則酶切位點消失,PCR產物經SmaI消化后產生1個片段(559 bp),記作等位基因T。

圖1 豬MMP9基因SmaI酶切分型結果Fig.1 SmaI enzyme digestion results of porcine MMP9 gene

2.2 豬MMP9基因在淮豬新品系II系豬群體中的基因型和等位基因的頻率分布MMP9基因SmaI酶切位點在所檢測的豬群中,基因型TT、TC、CC頻率分別為0.05、0.39、0.56,C等位基因占優勢(0.76),T等位基因頻率為0.24。

2.3 豬MMP9基因SmaI多態位點基因型與豬產仔數性狀的關聯分析應用基因效應統計分析模型[9],采用SAS統計軟件的GLM程序在淮豬新品系II系豬群體中進行豬MMP9基因PCR-SmaI-RFLP多態位點與產仔數性狀的關聯分析。

在淮豬新品系II系豬群體中,所有胎次產仔數均呈TC>CC>TT的趨勢。其中,TC型個體的所有胎次產仔數顯著高于CC型個體0.776頭(P<0.05)(表1)。統計結果顯示,TC型和CC型母豬具有較高的產仔數,C等位基因為優勢等位基因。

表1 MMP9基因PCR-SmaI-RFLP基因型與淮豬新品系II產仔數性狀的統計分析

3 討論

淮豬新品系Ⅱ是以安徽省優良地方品種淮豬為母本,以國外優質瘦肉型品種長白豬、大白豬為父本,經過雜交育種組建基礎群,然后運用標記輔助選擇BLUP估計育種值進行群體繼代選育。MMPs作為一類活性依賴于鋅離子的肽鏈內切酶,在卵泡和子宮外組織的動態變化中發揮一定的調控作用。MMP9作為MMPs的家族成員之一,參與降解IV型膠原底物,在繁殖組織的發育和重塑過程中發揮重要作用[5-6]。且研究發現,在小鼠內源LH峰或hCG處理后,MMP9基因表達量上升[8,10]。此外,Dubois等[11]研究發現,MMP9基因敲除小鼠后,配種率下降,頭胎和經產產仔數均低于正常小鼠。這進一步暗示了MMP9 基因在卵泡的發育和排卵過程中發揮作用。

基因敲除試驗表明,MMP9基因敲除小鼠配種率下降,頭胎和經產窩產鼠數均低于正常小鼠[12]。結合MMP9在胚胎著床中的重要作用,推斷該基因對豬產仔數有重要影響。

該研究發現,MMP9基因SmaI酶切位點在淮豬新品系II系豬群體中檢測發現C等位基因占優勢,且在所有胎次產仔數呈TC>CC>TT的趨勢。其中,TC型個體的所有胎次產仔數顯著高于CC型個體0.776頭(P<0.05),表明TC型和CC型母豬具有較高的產仔數,C等位基因為優勢等位基因,因此在今后選育中可適當提高C等位基因的頻率。