人參皂苷Rh2對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響及機制Δ

劉瀅 ，譚輝 ，夏菁 ，熊偉 ，鄧雪松 #（1.重慶三峽醫藥高等?？茖W?；A醫學部，重慶 404120；2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程研究中心，重慶 404120；3.三峽庫區道地藥材開發利用重慶市重點實驗室，重慶 404120）

惡性膠質瘤多來源于低級別的星形細胞瘤細胞或正常的膠質細胞，其早期診斷和治療方法雖不斷發展，但患者易耐受，且復發率高、預后差、5年生存率低，現有手段的治療效果仍然有限[1—2]。因此，深入研究惡性膠質瘤的發病特征并開發新的治療方法，對改善膠質瘤患者的預后具有重要意義。

人參為傳統中草藥，是五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根，至今已有兩千多年的應用歷史?，F代藥理學研究表明，從人參根莖中提取的主要活性成分人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）具有抗菌、抗腫瘤等藥理作用[3—4]。本課題組前期研究初步證實，該成分對腫瘤細胞具有良好的體內外抑制活性[5]。有研究指出，人參皂苷Rh2能有效抑制大鼠C6膠質瘤細胞的增殖，并誘導其凋亡[6]?？梢?，該成分有望成為膠質瘤臨床輔助治療的候選藥物。

近年來的研究表明，組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylases，HDACs）的異常表達與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關[7]。人類高發惡性腫瘤的最新相關研究表明，HDAC1/醇脫氫酶1A（alcohol dehydrogenase 1A，ADH1A）軸在抑制非小細胞肺癌細胞遷移并促進其凋亡過程中具有重要作用[8]，其可通過干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）來調控HDAC1的表達，進而上調肝癌細胞標志物p21的表達并抑制細胞增殖[9]；同時，有學者在另一項膠質瘤研究中指出，HDAC1活性的增強可能是腫瘤細胞生長及耐藥的基礎[10]。本課題組前期基于中國腦膠質瘤基因組圖譜計劃數據庫（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA），利用在線分析工具（http：//www.cgga.org.cn）對數據庫中膠質瘤患者的臨床樣本進行分析后發現，HDAC1 mRNA在惡性膠質瘤（WHO病理分級為Ⅲ、Ⅳ級）患者體內呈高表達，且其表達水平與腫瘤惡性程度成正比，與患者生存率成反比?？梢?，HDAC1有望成為惡性膠質瘤的潛在治療靶點。本研究以人膠質瘤細胞為對象，擬分析人參皂苷Rh2對其增殖、凋亡的影響，并基于HDAC1初步探討上述作用的可能機制，以期為進一步研究該成分的藥理作用和開發惡性膠質瘤的治療藥物提供新的思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ChemiDoc Touch型凝膠成像系統、M450型酶標儀（美國Bio-Rad公司），Cyto-FLEX型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），TGL-185型臺式高速冷凍離心機（重慶平凡儀器儀表有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

人參皂苷Rh2原料藥（貨號78214-33-2，純度≥98%）購自成都曼思特生物科技有限公司；胎牛血清和DMEM高糖培養基均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8試劑盒（批號K1018）購自美國APExBIO公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（批號WLA010a）購自沈陽萬類生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0012）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（批號P0012A）、細胞裂解液（批號P0013K）、青-鏈霉素雙抗（批號C0222）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF；批號ST506）、小鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號AF0003）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（H+L）二抗（批號A0208）、HRP標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（批號A0216）均購自上海碧云天生物技術有限公司；小鼠抗人HDAC1單克隆抗體（批號5356T）、兔抗人B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體（批號3498T）、兔抗人Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）單克隆抗體（批號41162S）、兔抗人切割型胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）單克隆抗體（批號9664T）均購自美國CST公司；ECL化學發光顯色試劑（批號P10100）購自蘇州新賽美生物科技有限公司。

1.3 細胞

人膠質瘤U87、U251細胞由重慶醫科大學干細胞與組織工程研究室提供。

2 方法

2.1 細胞培養及藥液配制

U87、U251細胞用2倍以上體積的培養基混勻，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液；收集細胞，用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基（以下簡稱“完全培養基”）重懸于培養瓶中，于5% CO2、37 ℃培養箱中培養。

取人參皂苷Rh2原料藥20 mg，以二甲基亞砜（DMSO）200 μL充分溶解，配制成濃度為160 mmol/L的儲備液，于-20 ℃下保存。臨用前，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基稀釋成相應濃度的藥液（DMSO不能超過總體積的0.1%）。

2.2 細胞增殖檢測

采用CCK-8法進行檢測。取對數生長期的U87、U251細胞，按5 000個/孔接種于96孔板中。將細胞分為空白組（只加完全培養基）、對照組（不加藥物）和不同濃度人參皂苷Rh2組（10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L，濃度參考前期預實驗結果設置），每組設5個復孔。分別于培養24、48、72 h時，加入CCK-8試劑10 μL，孵育2 h后，使用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔的吸光度（A）值，按下式計算藥物作用48 h時的細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率＝（A對照組-A實驗組）/（A對照組-A空白組）；同時擬合人參皂苷Rh2的半數抑制濃度（IC50）。

2.3 細胞凋亡檢測

采用流式細胞術進行檢測。取對數生長期的U87、U251細胞，按50 000個/孔接種于6孔板中。將細胞分為對照組（不加藥物）和不同濃度人參皂苷Rh2組（30、50 μmol/L，濃度參考“2.2”項下結果設置，下同），每組設3個復孔。培養48 h后，收集各組細胞，按AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒說明書操作，使用流式細胞儀檢測其總凋亡率。

2.4 HDAC1和凋亡相關蛋白表達檢測

采用Western blot法進行檢測。取對數生長期的U87、U251細胞，按50 000個/孔接種于6孔板中。將細胞分為對照組（不加藥物）和不同濃度人參皂苷Rh2組（30、50 μmol/L），每組設3個復孔。培養48 h后，收集各組細胞并提取其總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度后作變性處理。取變性蛋白適量，經SDS-PAGE分離后轉移至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉于室溫下封閉0.5 h；加入HDAC1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；以TBST緩沖液洗膜3次，加入相應二抗（稀釋比例均為1∶1 000），于室溫下孵育1 h；以TBST緩沖液洗膜3次，加入ECL試劑顯色并置于凝膠成像系統下成像，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）的條帶灰度值比值作為目的蛋白的表達水平。

2.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 人參皂苷Rh2對人膠質瘤細胞增殖的影響

經不同濃度人參皂苷Rh2作用24、48、72 h后，各藥物組U87、U251細胞的增殖均受到明顯抑制，其增殖抑制率均較對照組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且有一定的濃度依賴趨勢。結果見圖1（對照組細胞的增殖抑制率為0，未在圖中展示）。人參皂苷Rh2對2種細胞作用48 h時的IC50分別為51.34、55.84 μmol/L，故后續將30、50 μmol/L作為該成分的干預濃度。

圖1 人參皂苷Rh2對人膠質瘤U87、U251細胞增殖的影響

3.2 人參皂苷Rh2對人膠質瘤細胞凋亡的影響

經30、50 μmol/L的人參皂苷Rh2作用48 h后，U87、U251細胞的總凋亡率均較對照組顯著升高（P＜0.01），且有隨藥物濃度增加而升高的趨勢。結果見圖2。

圖2 人參皂苷Rh2對人膠質瘤U87、U251細胞凋亡的影響

3.3 人參皂苷Rh2對人膠質瘤細胞中HDAC1蛋白表達的影響

經30、50 μmol/L的人參皂苷Rh2作用48 h后，U87、U251細胞中HDAC1蛋白的表達水平均較對照組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且表達水平有隨藥物濃度增加而降低的趨勢。結果見圖3。

圖3 人參皂苷Rh2對人膠質瘤細胞中HDAC1蛋白表達的影響

3.4 人參皂苷Rh2對人膠質瘤細胞凋亡相關蛋白表達的影響

經30、50 μmol/L的人參皂苷Rh2作用48 h后，U87、U251細胞中Bcl-2蛋白的表達水平均較對照組顯著降低，Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達水平均較對照組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖4。

4 討論

膠質瘤是人神經系統最常見且難治療的惡性腫瘤，其復發率高，現有治療方案效果有限，因此尋找安全、有效的治療藥物非常重要。中醫藥具有毒副作用小、藥效持久、靶點多及作用較安全等特點，在提高患者生活質量、延長生存期方面具有顯著優勢，頗受臨床關注[11]。挖掘具有膠質瘤臨床治療和患者預后改善潛力的中藥及活性成分是目前的研究方向之一。考慮到人參皂苷Rh2對腫瘤細胞的體內外抑制活性以及對大鼠膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響，本研究選擇了2種常用人膠質瘤細胞系——U87、U251細胞，初步評價了該成分的抗腫瘤活性。

有研究發現，人參皂苷Rh2能通過抑制HDAC1、HDAC2、HDAC6的表達而發揮抑制白血病細胞增殖的作用[12]，因此該成分可能是一種天然的HDAC抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）。已有研究表明，HDAC1在結腸癌、肝癌等多種腫瘤細胞中呈高表達，可參與組蛋白和非組蛋白的去乙?；?，并且與患者的不良預后存在密切關聯[13—14]。本研究在前期研究的基礎上，通過Western blot實驗檢測發現，人參皂苷Rh2可下調2種人膠質瘤細胞中HDAC1蛋白的表達，且這種作用有一定的濃度依賴趨勢。可見，HDAC1有望成為腫瘤治療的潛在靶點。

本研究采用CCK-8實驗、流式細胞術實驗檢測了人參皂苷Rh2對人膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響，結果顯示，人參皂苷Rh2能有效抑制2種人膠質瘤細胞增殖并促進其凋亡。為了進一步明確人參皂苷Rh2對膠質瘤細胞凋亡的影響機制，本研究針對經典的Bcl-2家族蛋白介導的細胞凋亡途徑進行了探索。在Bcl-2家族蛋白中，Bax是促凋亡關鍵蛋白，可促進腫瘤細胞凋亡；Bcl-2是抑制凋亡的關鍵蛋白，可抑制腫瘤細胞凋亡。現有研究表明，促凋亡蛋白Bax可增加線粒體外膜的通透性，有利于細胞色素C等介質被釋放到細胞質中，從而激活下游caspase-3，活化產物cleaved caspase-3可通過破壞細胞來促進細胞凋亡[15]；抑凋亡蛋白Bcl-2則可通過與Bax蛋白形成異二聚體而發揮凋亡抑制作用[16]。可見，細胞凋亡受Bax、Bcl-2蛋白的共同調控。Wang等[17]通過實驗證實，下調HDAC1可影響Bcl-2/caspase信號通路的表達，從而促進腫瘤細胞的凋亡。本研究Western blot實驗結果顯示，人參皂苷Rh2能顯著促進2種人膠質瘤細胞中Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達，抑制Bcl-2蛋白的表達。

綜上所述，人參皂苷Rh2能抑制人膠質瘤U87、U251細胞增殖并促進其凋亡，其作用可能與下調HDAC1蛋白的表達和激活Bcl-2家族蛋白介導的凋亡途徑有關。在后續研究中，本課題組擬構建HDAC1轉染細胞株，進一步對人參皂苷Rh2的上述作用進行驗證，以期為其分子機制的闡釋提供參考。