百草婦炎清栓對大鼠細菌性陰道炎的改善作用及機制 Δ

王棋 ，王鵬嬌 ，孫小東 ，張敏 ，袁敏艷 ，孟小夏 ，趙燕妮 ，張碩 ，高秀麗 #（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院/藥用植物功能與應(yīng)用國家重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)微生物與生化制藥工程中心，貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，貴陽 550025）

細菌性陰道炎（bacterial vaginitis，BV）是一種婦科常見傳染性疾病，因寄居于陰道的乳酸桿菌減少，而加德納菌等厭氧菌增多，陰道內(nèi)生態(tài)平衡系統(tǒng)受到破壞而引起[1]。BV患者若未接受及時治療，其局部免疫功能將會下降，進而繼發(fā)宮頸炎、盆腔炎等其他婦科疾病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。目前，抗菌藥物是臨床治療BV的主要選擇，但該類藥物會同時殺滅共生菌，導(dǎo)致菌群失調(diào)，還會因過度使用而致使病原體耐藥[2]。因此，尋找有效且副作用小的替代療法很有必要。百草婦炎清栓由苦參、百部、蛇床子、仙鶴草、紫珠葉、白礬、冰片、樟腦、硼酸組成，是基于我國傳統(tǒng)苗醫(yī)藥發(fā)展而成的一種中藥栓劑，民間用藥歷史悠久[3]。臨床實踐顯示，百草婦炎清栓用于BV的療效顯著[4]，但其具體作用機制尚不明確。

革蘭氏陰性菌是婦科炎癥感染的主要致病菌，其細胞壁主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是誘發(fā)炎癥的關(guān)鍵因素[5]。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）為Ⅰ型跨膜蛋白家族受體，在非特異性或先天免疫性疾病發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用[6]。研究指出，TLR2和TLR4可分別通過識別革蘭氏陽性菌細胞壁主要成分肽聚糖和革蘭氏陰性菌細胞壁主要成分LPS來調(diào)控下游細胞因子的合成和分泌，激活炎癥相關(guān)靶基因的表達[7]；同時，所有的TLR可共同激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，而NF-κB活化水平的升高會進一步導(dǎo)致促炎性細胞因子釋放的增加，從而造成相關(guān)組織損傷[8—9]。可見，TLR/NF-κB通路與BV等婦科炎癥性疾病有著密切關(guān)聯(lián)[10]。本研究擬通過建立大腸埃希菌感染的BV大鼠模型，探究百草婦炎清栓對大鼠BV的改善作用，并基于TLR/NF-κB通路初步探討其潛在作用機制，以期為該藥的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），Varioskan LUX型多功能酶標儀、HM325型病理切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司），BX43型正置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），JB-L5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠），MSX2型成像系統(tǒng)（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

百草婦炎清栓[國藥準字Z20026597，批號為06210401，規(guī)格為每粒重4 g（不包括棉棒重，相當(dāng)于飲片2 g）]購自貴州長生藥業(yè)有限責(zé)任公司；甲硝唑陰道泡騰片（陽性對照，國藥準字H20067252，批號220403，規(guī)格0.2 g）購自湖北東信藥業(yè)有限公司；苯甲酸雌二醇注射液（批號211126，規(guī)格2 mL∶4 mg）購自上海全宇生物技術(shù)（駐馬店）動物藥業(yè)有限公司；白細胞介素13（interleukin-13，IL-13）試劑盒（貨號F2961-B）購自上海泛柯實業(yè)有限公司；IL-1β、IL-2、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）試劑盒（貨號分別為ERC007、ERC001、IGA-2）均購自欣博盛生物科技有限公司；兔TLR4、NF-κB多克隆抗體（貨號分別為19811-1-AP、14220-1-AP）均購自美國Proteintech公司；兔TLR2多克隆抗體（貨號A20608）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（貨號T0004）購自美國Affinity公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗（貨號分別為PMK-014-090、PM-014-091）均購自武漢普美克生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒（貨號PC0020）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級雌性SD大鼠，體重180～200 g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心，動物使用許可證號為SYXK（黔）2018-0001。所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（60±5）%、光照12 h/黑暗12 h的動物房內(nèi)。本研究方案經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準（編號2000351），并按照實驗動物福利和動物實驗倫理的相關(guān)要求進行。

1.4 細菌

大腸埃希菌（貨號BNCC133264）購自商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將雌性SD大鼠隨機分為正常組，模型組，甲硝唑組，百草婦炎清栓低、中、高劑量組，每組8只。參考文獻方法[11—12]復(fù)制BV模型：所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，除正常組外其余各組大鼠均皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.2 g，每天1次，持續(xù)6 d，使大鼠處于假發(fā)情狀態(tài)；隨后，將大腸埃希菌懸液用空白培養(yǎng)基稀釋至2×108～3×108cfu/mL（cfu即菌落形成單位），取20 μL注入大鼠陰道，每天1次，持續(xù)6 d。每天觀察大鼠陰道口外觀，當(dāng)出現(xiàn)明顯充血紅腫，伴有大量白色黏性分泌物，且分泌物檢查結(jié)果示菌株生長旺盛，即表明大鼠陰道環(huán)境已被破壞，BV模型復(fù)制成功[12]。

參考百草婦炎清栓的成人日劑量（4 g），經(jīng)人與大鼠給藥劑量換算后確定其低、中、高劑量組的劑量分別為0.18、0.36、0.72 g/kg（對應(yīng)給藥體積分別為0.16、0.32、0.64 mL/kg），栓劑于37 ℃水浴中靜置，至流體狀態(tài)后使用注射器經(jīng)陰道給藥；甲硝唑陰道泡騰片的成人日劑量為0.4 g，經(jīng)人與大鼠給藥劑量換算后確定其劑量為0.03 g/kg，直接經(jīng)陰道給藥；正常組和模型組大鼠經(jīng)陰道給予生理鹽水0.32 mL/kg，每天1次，持續(xù)6 d。

2.2 指標檢測

2.2.1 大鼠陰道外觀評分

參考李福元等[13]建立的陰道外觀評分標準（表1），于末次給藥24 h后對各組大鼠陰道口紅腫情況和分泌物情況進行評分，所得評分越高，表明大鼠的陰道炎癥越嚴重。

表1 大鼠陰道外觀評分標準

2.2.2 大鼠陰道pH檢測

末次給藥24 h后，將pH試紙插入大鼠陰道口，待與陰道分泌物充分接觸后迅速取出，與標準比色卡比對并記錄其陰道pH。

2.2.3 大鼠陰道灌洗液中細胞因子檢測

測完pH后，所有大鼠均禁食、禁水過夜。次日，用生理鹽水100 μL清洗大鼠陰道3次，收集陰道灌洗液于-80 ℃保存，備用。取上述灌洗液，于室溫（24±2）℃下放置30 min，在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用雙抗體夾心法以酶標儀檢測其IL-1β、IL-2、IL-13、IgA水平，嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作。

2.2.4 大鼠子宮及附件形態(tài)觀察

收集完陰道灌洗液后，所有大鼠用2%戊巴比妥鈉（腹腔注射）麻醉，剖開腹腔，取出子宮及附件，進行形態(tài)觀察并拍照。

2.2.5 大鼠陰道組織病理學(xué)觀察

取各組大鼠陰道組織，部分組織置于4 ℃的4%多聚甲醛中固定，剩余組織于-80 ℃下凍存，備用。取上述固定于多聚甲醛中的大鼠陰道組織，經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋后切片（厚度3～5 μm），再經(jīng)蘇木精-伊紅染色、脫水透明后，以中性樹脂封片，使用光學(xué)顯微鏡觀察其陰道組織病理改變。

2.2.6 大鼠陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB蛋白表達檢測

（1）免疫組化實驗：取“2.2.5”項下正常組、模型組、百草婦炎清栓中劑量組大鼠（每組8只）的陰道組織切片，每10 min用二甲苯清洗1次（共4次），再依次用100%、95%、85%、75%乙腈梯度脫水2 min，用水清洗并浸泡5 min；用乙二胺四乙酸修復(fù)15 min后，用水沖洗；滴加山羊血清封閉液（以磷酸鹽緩沖液稀釋），室溫孵育60 min；滴加TLR2、TLR4、NF-κB一抗（稀釋比例均為1∶100），于4 ℃下孵育過夜；用磷酸鹽緩沖液沖洗3 min×3次后，滴加相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶200），于室溫下孵育30 min；用磷酸鹽緩沖液沖洗3 min×3次后，以DAB顯色；用水沖洗后，以蘇木精復(fù)染1～5 min；用水沖洗，固片；隨機選取3個視野，使用顯微鏡觀察上述蛋白的陽性表達情況（以黃色或棕黃色為陽性表達），并使用Image J軟件分析陽性表達的平均光密度值，以反映各蛋白的表達水平。

（2）Western blot實驗：取“2.2.5”項下正常組、模型組、百草婦炎清栓中劑量組大鼠（每組4只）凍存的陰道組織樣品，加入RIPA裂解緩沖液適量，于冰浴中裂解30 min，以6 000 r/min勻漿10 min，再以12 000 r/min于4 ℃下離心15 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度并作變性處理。取變性后的蛋白樣品40 μg，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h；加入TLR2、TLR4、NF-κB、GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶6 000），于4 ℃下孵育過夜；用TBST緩沖液清洗，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1∶6 000），于37 ℃下孵育1 h；以ECL化學(xué)發(fā)光法顯影后，于成像系統(tǒng)下成像。使用Image J軟件進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 23.0和GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和可視化展示。數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道外觀評分的影響

與正常組比較，模型組大鼠的陰道口紅腫評分和分泌物評分均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組大鼠上述評分均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠陰道外觀評分和pH比較（±s，n＝8）

表2 各組大鼠陰道外觀評分和pH比較（±s，n＝8）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

陰道口紅腫評分0.25±0.46 2.50±0.53a 1.13±0.64b 2.00±0.53c 0.88±0.64b 1.25±0.70b組別正常組模型組甲硝唑組百草婦炎清栓低劑量組百草婦炎清栓中劑量組百草婦炎清栓高劑量組陰道分泌物評分0.38±0.52 2.63±0.52a 0.88±0.35b 1.75±0.46b 1.00±0.53b 1.25±0.46b陰道pH 7.17±0.26 8.00±0.41a 7.53±0.31c 7.63±0.35 7.07±0.61b 7.13±0.52b

3.2 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道pH的影響

與正常組比較，模型組大鼠的陰道pH顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組大鼠（百草婦炎清栓低劑量組除外）的陰道pH均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

3.3 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道灌洗液中細胞因子水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠陰道灌洗液中促炎因子IL-1β、IL-2水平顯著均升高（P＜0.01），而IgA水平和抗炎因子IL-13水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組大鼠陰道灌洗液中IL-1β、IL-2水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），IL-13（百草婦炎清栓低劑量組除外）和IgA水平均顯著提高（P＜0.05或P＜0.01），其中IgA的變化有較明顯的劑量依賴趨勢。結(jié)果見圖1。

圖1 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道灌洗液中細胞因子水平的影響（±s，n＝8）

3.4 百草婦炎清栓對BV大鼠子宮及附件形態(tài)的影響

正常組大鼠子宮及附件形態(tài)規(guī)則，子宮壁光滑；模型組大鼠子宮明顯充血水腫，子宮及附件形狀不規(guī)則，可見宮腔積液。經(jīng)百草婦炎清栓治療后，3個劑量組都有不同程度的改善，其中低劑量組依舊有些許水腫現(xiàn)象，中、高劑量組的干預(yù)效果最好。結(jié)果見圖2（圖中，各樣本整體長約40 mm）。

圖2 百草婦炎清栓對BV大鼠子宮及附件形態(tài)的影響

3.5 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道組織病理形態(tài)的影響

在大腸埃希菌的感染下，模型組大鼠陰道組織除潰爛外，還可見明顯的水腫增生和上皮細胞脫落，且伴有大量的炎癥細胞浸潤。與模型組比較，甲硝唑組大鼠陰道組織仍可見少許上皮細胞脫落；百草婦炎清栓中、高劑量組大鼠陰道組織得以明顯修復(fù)，但低劑量組仍有上皮組織潰爛的情況。結(jié)果見圖3。

圖3 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道組織病理形態(tài)影響的顯微圖

3.6 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB蛋白表達的影響

（1）免疫組化實驗：與正常組比較，模型組大鼠陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB的陽性著色均明顯變深，上述蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，百草婦炎清栓中劑量組大鼠陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB的陽性著色均明顯變淺，上述蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖4、表3。

圖4 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB陽性蛋白表達影響的免疫組化圖

表3 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB陽性蛋白表達的影響（±s，n＝8）

表3 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB陽性蛋白表達的影響（±s，n＝8）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

TLR2 0.17±0.01 0.22±0.03a 0.17±0.02b組別正常組模型組百草婦炎清栓中劑量組TLR4 0.19±0.03 0.28±0.06a 0.21±0.06c NF-κB 0.16±0.01 0.22±0.01a 0.17±0.02b

（2）Western blot實驗：與正常組比較，模型組大鼠陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB蛋白的相對表達量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，百草婦炎清栓中劑量組大鼠陰道組織中上述蛋白的相對表達量均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖5。

圖5 百草婦炎清栓對BV大鼠陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB蛋白表達的影響（±s，n＝4）

4 討論

研究表明，BV的患病率逐年上升，并且在年輕群體中尤為顯著[14]。抗菌藥物對致病菌有較好的抑制作用，但同時也會殺死陰道益生菌，隨之可能會造成病原體耐藥、病情復(fù)發(fā)等不良結(jié)局[15]。中醫(yī)關(guān)于陰道炎的理論和實踐較為豐富，常用方劑多有清熱燥濕、殺蟲止癢、消腐生肌等功效。研究表明，中藥栓劑用于各種婦科炎癥的療效較好，且不良反應(yīng)較少，不易引起耐藥，在恢復(fù)患者正常生理功能和祛除潛在病因方面具有優(yōu)勢[16]。本研究結(jié)果顯示，百草婦炎清栓可顯著降低模型大鼠的陰道口紅腫評分及分泌物評分，使其陰道pH恢復(fù)正常，改善大鼠子宮及附件、陰道組織的病理損傷，提示該藥對大鼠的陰道炎癥有一定的干預(yù)效果。有研究指出，作為百草婦炎清栓主成分之一的苦參，因具有較強的抗炎活性，常被單獨制為凝膠制劑用于治療BV[17]；除此之外，百草婦炎清栓中的百部、蛇床子、紫珠葉和仙鶴草也有一定的抗菌抗炎功效[18—20]，均是該藥發(fā)揮BV治療作用的藥效成分。此外本研究結(jié)果還顯示，中劑量百草婦炎清栓對大鼠陰道口紅腫、分泌物評分的影響更明顯，筆者認為可能與高劑量組劑量偏大而對陰道黏膜產(chǎn)生不利影響有關(guān)。

陰道黏膜為局部免疫的重要防線之一，可通過快速脫落上皮細胞和分泌具有殺傷作用的細胞因子來抵御病原體入侵[17]。IgA附著于生殖道黏膜，具有清除病原微生物、中和毒素、阻斷抗原入侵等功能[21]。本研究結(jié)果顯示，各藥物組大鼠受損陰道組織均有不同程度的改善，水腫增生、上皮細胞脫落、炎癥細胞浸潤等明顯減輕，且IgA水平顯著升高，提示百草婦炎清栓可通過修復(fù)細菌感染致?lián)p的陰道黏膜而恢復(fù)IgA的分泌功能，從而增強陰道局部體液免疫功能。

TLR首次在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，隨后TLR同源域也被證實存在于哺乳動物中[22]。TLR可識別、結(jié)合病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，從而介導(dǎo)免疫防御反應(yīng)；當(dāng)免疫應(yīng)答反應(yīng)過于強烈時，下游蛋白釋放的促炎因子會持續(xù)釋放炎癥相關(guān)因子，最終造成組織炎癥損傷[23]。因此，干預(yù)TLR相關(guān)信號通路、抑制免疫應(yīng)答、減少炎癥相關(guān)因子釋放可能是炎癥性疾病治療的重要途徑。髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的主要接頭蛋白，當(dāng)MyD88的碳端與TLR結(jié)合后，前者氮端（死亡結(jié)構(gòu)域）可通過招募IL-1受體相關(guān)蛋白激酶，再經(jīng)多個因子轉(zhuǎn)化而激活NF-κB，最終誘導(dǎo)促炎因子IL-1β等的分泌[23]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠陰道灌洗液中IL-1β水平和陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB蛋白的表達均較正常組顯著上調(diào)，提示BV可引發(fā)炎癥反應(yīng)，該病的發(fā)生可能與TLR/NFκB信號通路激活有關(guān)，這與已有研究的結(jié)果基本一致[6]。經(jīng)百草婦炎清栓干預(yù)后，大鼠陰道灌洗液中IL-1β水平顯著降低，陰道組織中TLR2、TLR4、NF-κB蛋白的表達均顯著下調(diào)，提示百草婦炎清栓可能通過抑制TLR/NF-κB信號通路來減輕大鼠BV引起的炎癥反應(yīng)。

TLR可通過調(diào)控樹突細胞或B淋巴細胞來誘導(dǎo)Th1/Th2分化，而Th1/Th2免疫失衡在陰道炎等婦科炎癥疾病中具有關(guān)鍵作用[24]。IL-2為Th1細胞分泌的促炎因子，有增強自然殺傷細胞和單核巨噬細胞殺傷力的作用；IL-13是Th2細胞分泌的抗炎因子，可通過抑制Th1細胞介導(dǎo)的噬菌作用來增加細胞的感染易感性[17]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)百草婦炎清栓干預(yù)后，模型大鼠陰道灌洗液中IL-2水平顯著降低，而IL-13水平顯著提高，提示該藥對Th1/Th2免疫失衡有改善作用。

綜上，百草婦炎清栓對BV大鼠的炎癥癥狀有一定的改善作用，其機制可能與抑制TLR/NF-κB信號通路有關(guān)。而百草婦炎清栓的作用機制是否還涉及其他信號通路，尚有待后續(xù)研究深入探討。