百合地黃湯加味用于卒中后抑郁癥的潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制Δ

黃思行 ，吳書祎 ，張平 ，羅金萍 ，王敏 ，郭延壘 ，李浩 ，張莉 ，強(qiáng)喆 #（.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.重慶中醫(yī)藥學(xué)院中藥系，重慶 402760；.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 40006）

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是一種以腦卒中后持續(xù)抑郁、認(rèn)知障礙和軀體化癥狀為特征的臨床綜合征。PSD是腦卒中后的常見并發(fā)癥，約1/3的卒中幸存者會(huì)出現(xiàn)不同程度的抑郁[1]。與重度抑郁不同，PSD患者缺乏活動(dòng)能力且精神不振、運(yùn)動(dòng)遲緩[2]；同時(shí)，其焦慮癥狀明顯，主要表現(xiàn)為對(duì)卒中復(fù)發(fā)的恐懼，并會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的自殺念頭，甚至發(fā)展為自殺行為[3—6]。近年來(lái)，已有不少學(xué)者從不同角度對(duì)PSD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了討論[4，7—8]，但尚未形成統(tǒng)一觀點(diǎn)。

相關(guān)研究證實(shí)，傳統(tǒng)藥食同源藥材百合屬植物及其提取物具有有效的抑郁治療作用[9—11]。百合地黃湯源自《金匱要略》，是治療精神類疾病的經(jīng)典方之一，其臨床應(yīng)用歷史悠久，療效確切且安全性高，是目前治療PSD的常用傳統(tǒng)方劑[12—13]。百合地黃湯加味（modified Baihe dihuang decoction，簡(jiǎn)稱“MBD/BDD”）是基于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論的臨床驗(yàn)方，是在百合地黃湯的基礎(chǔ)上添加柴胡、郁金、遠(yuǎn)志、合歡花、香附5味中藥而得。臨床實(shí)踐表明，MBD/BDD對(duì)PSD患者病情有明顯的改善作用，可有效減輕其抑郁癥狀，改善其神經(jīng)功能，提升其生活質(zhì)量[14—15]。盡管該方的臨床療效已被證實(shí)，但其發(fā)揮上述作用的機(jī)制尚不明確。為此，本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的基礎(chǔ)上，擬以PSD模型大鼠為對(duì)象，初步揭示MBD/BDD用于PSD的潛在作用靶點(diǎn)和機(jī)制，旨在為闡明該方的藥效機(jī)制、開發(fā)PSD治療新藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用儀器主要包括StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative PCR，qPCR）儀、QuantStudioTM3熒光實(shí)時(shí)qPCR儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），Universal Hood Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

百合、地黃、柴胡、郁金、遠(yuǎn)志、合歡花、香附飲片（批號(hào)分別為200901、200501、190901、200801、190801、200701、200901）均由重慶市中藥研究院門診部提供，經(jīng)重慶市中藥研究院王昌華研究員鑒定為真品。

鹽酸氟西汀（fluoxetine hydrochloride，F(xiàn)LX）片（陽(yáng)性對(duì)照，批號(hào)20200511，規(guī)格10 mg）購(gòu)自常州四藥制藥有限公司；總RNA提取試劑（批號(hào)9109Q）購(gòu)自日本Takara公司；cDNA第一鏈合成試劑盒（去除gDNA）、實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增預(yù)溶液（批號(hào)分別為11139ES10、11184ES03）均購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；RNA文庫(kù)制備試劑盒、去核糖體試劑盒（批號(hào)分別為#E7530L、MRZMB126）均購(gòu)自美國(guó)Illumina公司；兔源腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）單克隆抗體、兔源酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）單克隆抗體（批號(hào)分別為ab108319、ab187041）均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)ET1702-52）購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)A0208）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，體重180～220 g，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（渝）2017-0003。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于重慶市中藥研究院中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（每12 h明暗交替，室溫約22 ℃，相對(duì)濕度約55%），自由攝食、飲水。本研究方案經(jīng)重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)YLS2020-11），并嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的相關(guān)規(guī)定。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 MBD/BDD活性化合物的鑒定及其靶基因集的篩選

使用ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/）分析MBD/BDD的化合物組成，并鑒定7種組方藥材中包含的所有化合物。以每味中藥的名稱作為關(guān)鍵詞，在ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索MBD/BDD的活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)，去重后分別得到MBD/BDD的活性化合物及其靶基因集。

2.1.2 MBD/BDD抗抑郁相關(guān)基因集的篩選

以“depression”“antidepressants”“depressive disorder”等為檢索詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）獲取抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)。對(duì)GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)性得分大于10的基因和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有基因進(jìn)行篩選，得到抑郁癥相關(guān)靶基因集，并將其與“2.1.1”項(xiàng)下所得MBD/BDD靶基因集進(jìn)行交叉，取交集，即得MBD/BDD抗抑郁相關(guān)基因集。

2.1.3 組分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“2.1.1”項(xiàng)下的MBD/BDD活性化合物靶基因和“2.1.2”項(xiàng)下的MBD/BDD抗抑郁相關(guān)基因作為節(jié)點(diǎn)，使用Cytoscape可視化軟件構(gòu)建組分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（網(wǎng)絡(luò)中，連線表示節(jié)點(diǎn)間的相互作用）。以“2.1.2”項(xiàng)下MBD/BDD抗抑郁相關(guān)基因集對(duì)應(yīng)的靶蛋白為對(duì)象，借助STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string-db.org/），限定物種為“homo sapiens”，采用Cytoscape可視化軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并以“TSV”格式保存。

2.1.4 京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)通路富集分析

京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析可用于發(fā)現(xiàn)藥物作用的關(guān)鍵信號(hào)通路。本研究使用R 3.4.0軟件中的“clusterprofile”包，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行KEGG通路的富集、篩選。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 造模、分組與給藥

首先，對(duì)大鼠進(jìn)行局灶性腦缺血手術(shù)：大鼠禁食、不禁水12 h，經(jīng)0.9%戊巴比妥鈉（5 mL/kg，腹腔注射）麻醉，以仰臥位固定，對(duì)其頸部皮膚消毒后于頸部中線切口，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈；結(jié)扎頸外動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，于左側(cè)頸總動(dòng)脈作一楔形切口，將帶有略微擴(kuò)大的圓形尖端（直徑0.235～0.260 mm）的尼龍單絲縫線從頸外動(dòng)脈輕輕推入頸內(nèi)動(dòng)脈管腔并固定，造成缺血[16]。隨后，取腦缺血術(shù)后存活的大鼠，常規(guī)飼養(yǎng)1周后，分籠（每籠1只）喂養(yǎng)，并給予慢性不可預(yù)見的溫和應(yīng)激，即隨機(jī)接受不同刺激源[夾尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、45 ℃下靜置5 min、明暗顛倒24 h、水平振蕩30 min（頻率160次/min）、4 ℃冰水中游泳5 min]刺激，每天1～2種，每種3次，連續(xù)21 d，以復(fù)制PSD模型大鼠。

將所得PSD模型大鼠隨機(jī)分為PSD模型組、MBD/BDD組[12.6 g/kg，以生藥總量計(jì)，按照成人臨床用量1.8 g/（kg·d）的7倍換算而得]、FLX組[陽(yáng)性對(duì)照，2.3 mg/kg，按照成人臨床用量0.33 mg/（kg·d）的7倍換算而得]，另設(shè)空白對(duì)照組（該組大鼠接受相同的手術(shù)操作但不插入縫線，亦不接受任何刺激），每組8只。MBD/BDD組和FLX組大鼠灌胃相應(yīng)藥液（以水為溶媒），空白對(duì)照組和PSD模型組大鼠灌胃等體積水，每天1次，連續(xù)21 d。

2.2.2 行為學(xué)測(cè)試

（1）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）：于第20天給藥結(jié)束后進(jìn)行OFT。實(shí)驗(yàn)裝置為100 cm×100 cm×60 cm的開放式盒子，盒子底部被分成25個(gè)面積相等的正方形。將所有大鼠放置在盒子的中心，記錄其5 min內(nèi)在中心方格花費(fèi)的總時(shí)間及其行進(jìn)的總距離。每只大鼠單獨(dú)測(cè)試1次。

（2）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）：于第21天給藥結(jié)束后，將所有大鼠置于裝滿水的獨(dú)立玻璃圓柱體[圓柱體高60 cm，直徑40 cm；水溫（20±2）℃，水位高30 cm]中，待其游泳適應(yīng)2 min后，記錄其5 min內(nèi)的累計(jì)游泳不動(dòng)時(shí)間（以活動(dòng)減少且間斷出現(xiàn)不動(dòng)或飄浮狀態(tài)僅露出口鼻為“不動(dòng)”）。

2.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與生物信息學(xué)分析

FST后，各組大鼠經(jīng)0.9%戊巴比妥鈉（5 mL/kg，腹腔注射）麻醉后處死，剖取其腦組織并提取總RNA，進(jìn)行樣品制備、文庫(kù)構(gòu)建和DNA成簇?cái)U(kuò)增。對(duì)腦組織中的RNA進(jìn)行高通量測(cè)序以獲得所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，從而挖掘差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）；對(duì)所得DEGs進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集分析，基于DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/）進(jìn)行疾病相關(guān)性富集分析，基于美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院基因數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）進(jìn)行生物信息學(xué)分析[17]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由北京諾禾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司完成。

2.2.4 靶基因及蛋白表達(dá)的驗(yàn)證

結(jié)合上述轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析結(jié)果，選取其中上調(diào)較顯著的基因進(jìn)行mRNA水平表達(dá)驗(yàn)證（實(shí)時(shí)qPCR法），選取2個(gè)常見的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行蛋白水平表達(dá)驗(yàn)證（Western blot法）。

（1）mRNA水平檢測(cè)：提取MBD/BDD組和PSD組大鼠腦組織總RNA，進(jìn)行qPCR分析。反應(yīng)體系包括cDNA模板1 μL，SYBR Green Master Mix 5 μL，上、下游引物（具體序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1）各0.4 μL，加無(wú)RNase水至10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法檢測(cè)各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因的引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

（2）蛋白水平檢測(cè)：提取PSD組、FLX組和MBD/BDD組大鼠腦組織總蛋白，經(jīng)濃度測(cè)定和變性處理后，進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后加入BDNF、TrkB、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋度1∶1 000），室溫孵育1 h，用ECL顯色后成像，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism v9軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單向或雙向方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

3.1.1 靶點(diǎn)篩選結(jié)果

共篩選得MBD/BDD活性化合物132種，潛在靶基因493個(gè)；共篩選得抑郁癥相關(guān)靶基因1 333個(gè)。將活性化合物潛在靶基因和抑郁癥相關(guān)靶基因進(jìn)行交叉，最終獲得MBD/BDD抗抑郁相關(guān)靶基因131個(gè)。

組分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖1A）展示了相關(guān)性較強(qiáng)的前20個(gè)化合物與其潛在靶點(diǎn)的關(guān)系，這些成分在MBD/BDD抗抑郁中發(fā)揮了重要作用。所構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1B）中，有節(jié)點(diǎn)（即存在相互作用的蛋白）124個(gè)和邊1 024條，節(jié)點(diǎn)度值由大到小排序的前9個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)基因依次是IL1B、AKT1、INS、ESR1、CASP3、GAPDH、IL6、CREB1、TNF，表明這些基因參與了MBD/BDD抗抑郁作用的發(fā)揮。

圖1 MBD/BDD抗抑郁相關(guān)靶點(diǎn)篩選結(jié)果

3.1.2 KEGG通路富集結(jié)果

131個(gè)相關(guān)靶基因主要富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、尼古丁成癮、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）等信號(hào)通路。上述信號(hào)通路分別富集到靶基因21、20、14、14、14個(gè)，可能是MBD/BDD發(fā)揮抗抑郁作用的關(guān)鍵途徑。

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

OFT結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，PSD模型組大鼠在中心方格花費(fèi)的總時(shí)間及其行進(jìn)的總距離均顯著縮短或減少（P＜0.05）；與PSD模型組比較，各藥物組大鼠上述指標(biāo)均顯著延長(zhǎng)或增加（P＜0.05）。FST結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，PSD模型組大鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）；與PSD模型組比較，各藥物組大鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間均顯著縮短（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

圖2 MBD/BDD對(duì)PSD模型大鼠行為學(xué)的影響（±s，n＝8）

3.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與生物信息學(xué)分析結(jié)果

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，經(jīng)MBD/BDD干預(yù)后，大鼠腦組織中表達(dá)發(fā)生變化的基因遠(yuǎn)多于FLX組，其中表達(dá)上調(diào)的基因超過FLX組的2倍（圖3A），且PSD模型組、MBD/BDD組、FLX組的基因譜存在明顯差異（圖3B）。MBD/BDD組與PSD模型組之間的DEGs共1 351個(gè)，其中178個(gè)顯著下調(diào)[log2FC＜-1.0，P＜0.05；FC為差異倍數(shù)（fold change）]、1 173個(gè)顯著上調(diào)（log2FC＞1.0，P＜0.05）（圖3C）。

圖3 各組大鼠腦組織中相關(guān)基因表達(dá)的變化情況

針對(duì)上述DEGs的GO富集結(jié)果顯示，這1 351個(gè)DEGs涉及神經(jīng)元分化、化學(xué)突觸傳遞調(diào)節(jié)、跨突觸信號(hào)調(diào)節(jié)、投射神經(jīng)元發(fā)育調(diào)節(jié)等；基于DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)的富集結(jié)果顯示，這些DEGs主要與精神障礙、記憶障礙、神經(jīng)發(fā)育障礙、智力障礙和單極性抑郁癥等疾病相關(guān)，并在與創(chuàng)傷性腦損傷修復(fù)有關(guān)的軸突引導(dǎo)、膽堿能突觸和神經(jīng)活性配體-受體相互作用方面顯著富集，提示MBD/BDD對(duì)PSD的治療作用可能與影響神經(jīng)結(jié)構(gòu)及功能的修復(fù)有關(guān)。

查詢美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院基因數(shù)據(jù)庫(kù)可知，與PSD模型組比較，MBD/BDD組大鼠腦組織中顯著上調(diào)且上調(diào)幅度排名前30位的基因（如Fezf2、Arx、Ostn、Nrgn、Emx1、Foxg1、Emx2、Nr2e1、Dlx）均與神經(jīng)元增殖、發(fā)育、分化和遷移有關(guān)，但本研究并未在FLX組中發(fā)現(xiàn)上述基因的顯著變化；MBD/BDD組大鼠腦組織中顯著下調(diào)且下調(diào)幅度排名前30位的基因（如Fgf20、Rlim、Robo4、Lat、Tstd1）均與炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管生成有關(guān)，且大部分基因亦在FLX組中明顯下調(diào)。進(jìn)一步的GO分析表明，MBD/BDD組大鼠腦組織中前30個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因與端腦發(fā)育、大腦皮質(zhì)γ氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能中間神經(jīng)元分化、前腦細(xì)胞遷移、邊緣系統(tǒng)發(fā)育、前腦區(qū)域化和認(rèn)知相關(guān)；MBD/BDD組和FLX組大鼠腦組織中前30個(gè)下調(diào)的基因則與基于微管的生物過程調(diào)控、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、脊髓損傷、凋亡信號(hào)通路調(diào)控和營(yíng)養(yǎng)水平調(diào)節(jié)有關(guān)。

3.2.3 靶基因及蛋白表達(dá)的驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中上調(diào)較顯著的4個(gè)基因（Fezf2、Arx、Ostn、Nrgn）進(jìn)行mRNA表達(dá)驗(yàn)證，對(duì)2個(gè)常見神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF、TrkB）[18]進(jìn)行蛋白表達(dá)驗(yàn)證，結(jié)果（圖4）顯示，經(jīng)藥物干預(yù)后，大鼠腦組織中上述基因及蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）。

圖4 靶基因mRNA及蛋白表達(dá)的驗(yàn)證

4 討論

PSD是腦血管疾病的常見并發(fā)癥之一。作為抗抑郁藥，5-羥色胺選擇性重?cái)z取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）是臨床治療PSD的一線藥物。然而臨床實(shí)踐顯示，SSRIs會(huì)增加患者的出血風(fēng)險(xiǎn)，包括胃腸道出血和腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）風(fēng)險(xiǎn)[19]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，服用SSRIs者的出血風(fēng)險(xiǎn)比未服用SSRIs者高50%，其中發(fā)生ICH的風(fēng)險(xiǎn)高40%[20]。因此，有必要尋找新的且安全性更高的治療方案。

中藥具有不良反應(yīng)少、療效持久等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用價(jià)值得到了臨床的廣泛認(rèn)可[21]。MBD/BDD由經(jīng)典名方百合地黃湯加味而成，用于PSD的療效確切，但具體作用機(jī)制尚不明確。由于中藥復(fù)方在疾病治療過程中具有多靶點(diǎn)、多途徑、整體協(xié)調(diào)的特點(diǎn)，故本研究首先使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)MBD/BDD治療PSD的活性成分及潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了分析，最終獲得了MBD/BDD抗抑郁相關(guān)靶基因131個(gè)。隨后，本研究通過構(gòu)建組分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，MBD/BDD治療PSD的機(jī)制可能涉及IL1B、AKT1等多個(gè)基因，與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP等信號(hào)通路密切相關(guān)。

為了進(jìn)一步探討MBD/BDD的抗抑郁機(jī)制，本研究通過局灶性腦缺血手術(shù)結(jié)合慢性不可預(yù)見的溫和應(yīng)激建立PSD大鼠模型，以FLX為陽(yáng)性對(duì)照，通過OFT和FST初步證實(shí)了MBD/BDD能顯著減輕模型大鼠的抑郁樣行為。隨后，本研究進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，MBD/BDD組大鼠腦組織中發(fā)生變化的基因遠(yuǎn)多于FLX組，其中上調(diào)基因數(shù)超過FLX組的2倍，說(shuō)明與FLX相比，MBD/BDD能通過調(diào)控更多相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮治療作用?；蜃兓療釄D分析結(jié)果顯示，MBD/BDD組和FLX組的基因譜差異明顯，提示兩者治療PSD的分子機(jī)制可能不同。MBD/BDD組與PSD模型組之間的DEGs共1 351個(gè)，涉及神經(jīng)元分化、化學(xué)突觸傳遞調(diào)節(jié)等，與精神障礙、記憶障礙、神經(jīng)發(fā)育障礙等疾病有關(guān)，提示神經(jīng)結(jié)構(gòu)及功能的修復(fù)可能是MBD/BDD治療PSD的分子基礎(chǔ)。

目前，關(guān)于PSD的生理病理機(jī)制還沒有統(tǒng)一結(jié)論，其潛在機(jī)制包括單胺類水平降低，促炎細(xì)胞因子過量，谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性，腦軸、下丘腦-垂體-腎上腺軸功能障礙和異常神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)反應(yīng)等，是多種因素共同作用的結(jié)果[22—23]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)MBD/BDD干預(yù)后，PSD模型大鼠腦組織中顯著上調(diào)的DEGs共1 173個(gè)，其中Fezf2、Arx、Emx1、Foxg1、Emx2、Nr2e1、Dlx等基因變化尤為明顯。經(jīng)查詢美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院基因數(shù)據(jù)庫(kù)可知，上述基因大多與神經(jīng)元增殖、發(fā)育、分化和遷移密切相關(guān)，涉及V層錐體神經(jīng)元樹突變化和棘發(fā)育、軸突生長(zhǎng)等生理功能，提示MBD/BDD的抗PSD作用可能與促進(jìn)神經(jīng)結(jié)構(gòu)、功能修復(fù)和神經(jīng)元增殖等有關(guān)。本研究對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中上調(diào)較顯著的4個(gè)基因（Fezf2、Arx、Ostn、Nrgn）進(jìn)行mRNA表達(dá)驗(yàn)證，對(duì)2個(gè)常見神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF、TrkB）進(jìn)行蛋白表達(dá)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，經(jīng)MBD/BDD治療后，大鼠腦組織中上述基因及蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，初步驗(yàn)證了前述研究結(jié)果。

綜上所述，MBD/BDD的抗PSD作用可能與上調(diào)神經(jīng)元增殖、發(fā)育、分化和遷移相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)有關(guān)，是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑共同作用的結(jié)果。本研究可為MBD/BDD及相關(guān)中藥在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)精神疾病中的藥理作用及其分子機(jī)制分析提供參考。