豬源纖維蛋白貼配方的優化Δ

李茹冰 ，李偉達 ，劉文婷 ，李宇璐 ，谷小紅 ，于麗娟 ，萬華印 （.中國科學院大學深圳醫院藥學部，廣東深圳 5807；.佛山市婦幼保健院藥劑科，廣東 佛山 58000；.廣州市眾為生物科技股份有限公司，廣州 5000）

纖維蛋白類止血敷料主要含有纖維蛋白原和凝血酶成分，可模擬人體凝血過程的最后一步，其相關止血生物制劑可通過形成不溶性纖維蛋白而實現傷口的快速封閉[1—2]。臨床現有止血制劑多以纖維蛋白類止血輔料為黏合劑，在使用時須提前將纖維蛋白原和凝血酶分別溶解，再利用雙針筒混合裝置噴灑至創面而成膠止血[3]。然而，這種須提前溶解且須配合使用特殊裝置的制劑可能會導致危急手術患者錯失最佳的止血時機；同時，由于黏合劑自身的機械強度不足[4]，若醫護人員在噴灑后立即使用紗布吸取傷口周邊滲血，則可能會因紗布擦拭掉未成膠的止血物而導致制劑失效。為此，本課題組自主研制了豬源纖維蛋白貼（porcine fibrin patch，簡稱“DBT”），即以從豬血漿中提取的纖維蛋白原和凝血酶，以及從豬跟腱中提取的膠原蛋白為原料，通過特殊工藝處理并凍干而制得的海綿片劑[5]。該DBT具有海綿樣蛋白骨架結構，無須預配，遇血即可形成纖維蛋白；加之其外層為膠原蛋白，能有效防止制劑與紗布或周圍結締組織粘連，故可通過生化止血和機械按壓止血相結合的方式實現快速止血[6]。目前上市的蛋白貼劑僅有人源性TachoComb?（奧地利Nycomed公司）、TachoSil?（日本Takeda公司）、Evarrest?（美國Johnson & Johnson公司）等品種[7—8]，尚無豬源性同類制劑。

根據本課題組前期動物實驗和國內外臨床應用研究，纖維蛋白類止血制劑的用量需根據創面大小和止血情況疊加使用，且止血物需在體內降解，故其量效關系主要體現于制劑的成分組成及含量[9—10]。為更直觀地顯示DBT的內在量效關系，本文運用了Box-Behnken-響應面設計方法，以DBT的黏合強度、持黏力和吸水力3個與止血性能密切相關的力學參數為檢測指標[11—12]，以其總評歸一化（overall desirability，OD）值為響應值，對凍干前纖維蛋白原、凝血酶和膠原蛋白3個主要有效成分的含量進行優化，以保障DBT止血效果的充分發揮，也為同類產品的研究開發提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BLD-1028型剝離強度試驗機、BLD-1008A型保持力測試儀（東莞博萊德儀器設備有限公司），GLZY-1型凍干機（上海浦東冷凍干燥設備有限公司），KD-DTC-210型電子天平（上海亞津電子科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

纖維蛋白原備用液（批號為20140423，質量濃度為50 mg/mL）、凝血酶備用液（批號為20140704，效價為500 IU/mL）、膠原蛋白中間體（批號為20140603，膠原蛋白含量為0.204 g/g）均購自廣州市眾為生物科技股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 DBT的制備

分別將適量纖維蛋白原備用液、凝血酶備用液和膠原蛋白中間體溶液（由其中間體經鹽析、甲酸等處理所得的溶液）注入凍干模具，采用特殊凍干工藝技術將三者凍干在一起，即得DBT（規格5 cm×10 cm）。本制備工藝已申請專利，申請公布號為CN104491917B。

2.2 DBT的力學性能測定

2.2.1 黏合強度測定

參照2020年版《中國藥典》（四部）通則“0952黏附力測定法”第三法進行測定[13]：取DBT（5 cm×10 cm），分離其黃色纖維蛋白原層和白色膠原蛋白層，取黃色纖維蛋白原層，用雙面膠將其剝離面朝上固定于不銹鋼板上，再用膠帶將該層上下兩端加以固定，使其平整貼合在鋼板上；隨后，吸取生理鹽水1 mL，均勻噴灑在該黃色層上；取棉布與該黃色層小心黏合并按壓撫平，用重壓輥來回滾壓5次，靜置30 min[溫度（25±3）oC，相對濕度（55±10）%]；將棉布自由端180度對折，并將棉布自由端和鋼板分別垂直夾于試驗機上，同時使黃色纖維蛋白原層的剝離面與剝離強度試驗機（已進行校準）線保持一致，確認安裝無誤后，開始測試。試驗機以（300±10）mm/min的速度上升剝離，以剛剝離的最大強度為黏合強度。上述測試需取3片同規格的DBT，結果以平均值表示。

2.2.2 持黏力測定

參照2020年版《中國藥典》（四部）通則“0952黏附力測定法”第二法進行測定[13]：將保持力測試儀的試驗板和加載板緊挨并對齊，在距離兩板10～15 cm高處均勻噴灑生理鹽水0.5 mL；取DBT（2.5 cm×5 cm，剪裁所得），黏于試驗板和加載板的中部，并用滾輪來回滾壓5次使其黏合緊密；噴水2 min后，將試驗板固定在保持力測試儀上，在加載板下端掛上200 g的砝碼，記錄脫落時間（脫落時間須超過10 min方能符合實驗要求）。上述測試需取3片同規格的DBT，結果以平均值表示。

2.2.3 吸水力測試

取DBT（5 cm×10 cm），精密稱定其質量（W1）；于室溫（25±2）oC下在生理鹽水中浸泡20 min，待其充分吸水后，取出，靜置3 min，待其無明顯水滴后再次精密稱定其質量（W2），按下式計算吸水力：吸水力＝W2/W1。上述測試需取3片同規格的DBT，結果以平均值表示。

2.3 DBT配方優化的單因素實驗

DBT的止血性能與其3個主要成分（纖維蛋白原、凝血酶和膠原蛋白）的含量密切相關，故本研究以“2.2.1”項下黏合強度為檢測指標，以凍干前上述成分的含量（其中膠原蛋白含量以膠原蛋白中間體溶液質量濃度計，下同）為考察因素，在固定其中2個因素的條件下進行單因素實驗。

（1）固定凝血酶含量為6 IU/cm2、膠原蛋白含量為3 mg/cm2，考察不同纖維蛋白原含量（1.2、2.1、2.9、4.2、5.0、7.5、8.8、11 mg/cm2）對所制DBT黏合強度的影響。結果顯示，隨著纖維蛋白原含量的升高，黏合強度逐漸增大；當纖維蛋白原含量為7.5～11 mg/cm2時，黏合強度的增幅明顯不如含量1.2～4.2 mg/cm2時。綜合考慮，本研究選擇纖維蛋白原含量3～9 mg/cm2進行后續優化實驗。結果見圖1A。

（2）固定纖維蛋白原含量為6 mg/cm2、膠原蛋白含量為3 mg/cm2，考察不同凝血酶含量（2、5、8、11、14 IU/cm2）對所制DBT黏合強度的影響。結果顯示，黏合強度曲線呈拋物線樣，當凝血酶含量為2～11 IU/cm2時，黏合強度呈升高趨勢；當凝血酶含量為11～14 IU/cm2時，黏合強度明顯降低（可能與凝固過快有關）。綜合考慮，本研究選擇凝血酶含量6～10 IU/cm2進行后續優化實驗。結果見圖1B。

（3）固定纖維蛋白原含量為6 mg/cm2、凝血酶含量為6 IU/cm2，考察不同膠原蛋白含量（1、2、3、3.75、4、5 mg/cm2，后續均以對應的中間體溶液質量濃度2、4、6、7.5、8、10 mg/mL表示）對所制DBT黏合強度的影響。結果顯示，隨著膠原蛋白含量的增加，黏合強度呈平緩升高的趨勢。但筆者在實驗過程中發現，當膠原蛋白質量濃度為8、10 mg/mL時，其中間體呈非流體狀態，無法實現凍干制劑的批量化操作。綜合考慮，本研究選擇膠原蛋白含量2.5、5、7.5 mg/mL進行后續優化實驗。結果見圖1C（略去8、10 mg/mL的膠原蛋白中間體溶液對應數據）。

綜合上述單因素實驗結果可看出，纖維蛋白原和凝血酶的含量對DBT黏合強度的影響相對明顯，且在一定范圍內呈正相關；而膠原蛋白的含量對DBT黏合強度的影響相對較弱。

2.4 DBT配方優化的Box-Behnken-響應面實驗

2.4.1 實驗設計與結果

在單因素實驗結果的基礎上，本研究采用Design-Expert 8.0.6軟件，以凍干前的纖維蛋白原含量（A）、凝血酶含量（B）和膠原蛋白含量（C）為考察因素，以黏合強度（Y1）、持黏力（Y2）和吸水力（Y3）3個效應指標的OD值為響應值，設計3因素3水平共17個實驗點的Box-Behnken方案。3個效應指標的OD值按如下步驟計算：首先，對Y1、Y2、Y3進行歸一化處理，得di＝（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）（式中，Yi為實測值，Ymax和Ymin分別為每個效應指標在整個實驗安排中的實測最大值和最小值）；隨后，計算OD值，即OD＝（d1+d2+d3）/3[14]。Box-Behnken實驗設計的因素與水平見表1，實驗安排與結果見表2。

表1 DBT配方優化的Box-Behnken實驗設計因素與水平

表2 DBT配方優化的Box-Behnken實驗安排與結果

2.4.2 模型方程建立與方差分析

應用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行回歸分析，得二次多項回歸方程如下：OD＝0.690+0.170A+0.029B+0.110C+0.011AB-0.064AC-0.046BC-0.230A2-0.100B2-0.120C2。對該回歸模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，模型的P＜0.01，表示其可信度較高；模型失擬檢驗的P＞0.05，表明該模型可用于DBT最優配方的預測；模型的調整系數（R2）為0.932 6，說明該模型的擬合程度較好。在一次項中，A、C對3個效應指標OD值的影響顯著（P＜0.01），各因素對OD值影響的排序為A＞C＞B；二次項中，A2、B2、C2對OD值影響均顯著（P＜0.05）；在交互項中，AB、AC、BC的影響均不顯著（P＞0.05）。

表3 DBT配方優化的Box-Behnken實驗方差分析

應用Design-Expert 8.0.6軟件繪制各因素交互作用對OD值影響的二維等高線圖和三維響應曲面圖。等高線越密集，表明OD值變化越明顯；響應面的曲面傾斜度越大，顏色變化越明顯，表明因素間的交互作用越顯著。結果顯示，3個因素的兩兩交互之中，因素A與C的交互作用最強，因素A與B的交互作用次之，因素B與C的交互作用最弱。結果見圖2。

圖2 各因素交互作用對OD值影響的等高線圖和響應面圖

2.4.3 DBT最優配方的確定及驗證

運用Design-Expert 8.0.6軟件對上述二次多項回歸方程求解，得DBT最優配方為纖維蛋白原含量6.93 mg/cm2、凝血酶含量8.15 IU/cm2、膠原蛋白含量5.90 mg/mL，預測OD值為0.733 0?？紤]到實際操作的可行性，本研究最終選擇DBT的最優配方為纖維蛋白原含量6.5 mg/cm2、凝血酶含量8.0 IU/cm2、膠原蛋白含量5.6 mg/mL。

按上述最優配方制備3批DBT，所得OD值分別0.727 5、0.722 0、0.730 3，平均OD值為0.726 6（RSD＝0.58%，n＝3），與預測OD值的相對誤差為-0.87%，表明該配方穩定、可行。結果見表4。

表4 DBT最優配方驗證實驗結果（n＝3）

3 討論

本課題組所制DBT是將極易發生凝血級聯反應的纖維蛋白原和凝血酶經過特殊工藝與膠原蛋白一起凍干成型而得，多以單片使用，疊加給藥無法使其止血效能加倍，反而會改變其原有結構并增加機體降解負擔，因此通過優化其配方以確定內在成分含量與其止血性能的關系更為必要。為提高實驗精確度并減少實驗次數[15]，本文選擇了Box-Behnken-響應面法對DBT的主要成分含量進行了優化。

本課題組在提取純化膠原蛋白中間體溶液的過程中發現，當膠原蛋白分子量越大、濃度越高時，所得溶液的黏度越高，當膠原蛋白質量濃度為8、10 mg/mL時，中間體已處于非流體狀態；若使用高質量濃度非流體狀態的膠原蛋白，凍干所得制劑將沒有疏松、多孔、結構均勻的海綿骨架，其吸收能力將會大大減弱，甚至會與纖維蛋白原層分離；若通過高溫或酶水解來增加膠原蛋白的溶解度，則難以保持其三螺旋結構，凍干所得制劑的蛋白組織結構亦不穩定，止血時極易發生溶解。因此，本研究選擇了膠原蛋白含量2.5～7.5 mg/mL進入下一步優化實驗。在纖維蛋白原、凝血酶含量的單因素考察中，因纖維蛋白原層的溶解度和吸水力并不強，故為更好地體現纖維蛋白原與凝血酶的效價強度，本研究只選擇了黏合強度作為效應指標進行分析，從而更準確地選擇兩者需優化的含量范圍。

然而，止血敷料的止血性能除了與創面黏附的牢固性有關外，還與其是否能快速吸收滲出血液和與創面黏合的持久性相關（以預防止血物短時間內發生移位脫離）。因此，本研究在Box-Behnken-響應面優化設計中，引入黏合強度、持黏力和吸水力作為效應指標，并以三者的OD值作為綜合評價的響應值。雖然本研究并未在方差分析中發現這3個主要成分含量（即3個因素）之間的交互作用，但進一步的響應面分析結果顯示，這3個因素之間存在一定的兩兩交互作用；同時，筆者前期分別對3個效應值（Y1、Y2、Y3）進行了分析，發現3個因素間是有顯著的交互作用存在，前后結果的差異可能與擬合OD值后部分交互作用被抵消有關。

本研究最終優化得DBT最優配方為纖維蛋白原含量6.93 mg/cm2、凝血酶含量8.15 IU/cm2、膠原蛋白含量5.90 mg/mL；結合生產實際，最終確定最優配方為纖維蛋白原含量6.5 mg/cm2、凝血酶含量8.0 IU/cm2、膠原蛋白含量5.6 mg/mL。經3次驗證實驗，所得OD值的RSD為0.58%，與預測OD值的相對誤差為-0.87%，提示所得配方穩定、可行。此外值得注意的是，DBT的主要有效成分含量并不完全與其止血性能成正比[16]，筆者猜想這可能與不同有效成分含量配伍凍干所得成品的孔隙率差異、微量成分發生生化反應而影響了產品性能等因素有關。但上述推斷尚需通過電鏡掃描觀察和藥理、藥效學實驗進一步論證。

綜上所述，本文優化的DBT配方穩定、可行。