F5及PAI.1基因多態(tài)性與血液透析患者內(nèi)瘺狹窄和閉塞形成的關(guān)系

劉曉靜

（中山市人民醫(yī)院南朗分院血液凈化中心，廣東 順德 528403）

近年來，終末期腎病患者逐年增多，有越來越多的人需要依靠血液透析來維持生命。血液透析是治療終末期腎功能衰竭的主要方式，動(dòng)靜脈內(nèi)瘺作為永久性血管通路被視為患者的生命線。進(jìn)行血液透析需要建立血管通路，目前自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺（AVF）是首選的長期性血管通路。自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺最常見的并發(fā)癥為內(nèi)瘺狹窄及血栓形成，可導(dǎo)致患者發(fā)生血流量不足，動(dòng)靜脈內(nèi)瘺失功[1]。評(píng)估血液透析患者內(nèi)瘺狹窄及血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，提早進(jìn)行干預(yù)，可有效減少血液透析患者內(nèi)瘺狹窄及血栓形成的發(fā)生，提高患者的透析質(zhì)量。近年來，隨著遺傳藥理學(xué)與基因組學(xué)的不斷進(jìn)展，基于基因多態(tài)性的個(gè)體化抗凝治療備受關(guān)注。有研究[2]發(fā)現(xiàn)患者的基因多態(tài)性與血栓事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。本次研究選取2020 年4 月至2022 年12 月在中山市人民醫(yī)院南朗分院血液凈化中心經(jīng)動(dòng)靜脈內(nèi)瘺行規(guī)律血液透析的患者60 例為研究對(duì)象，探討F5及PAI.1 基因多態(tài)性與血液透析患者內(nèi)瘺狹窄和閉塞形成的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 基礎(chǔ)資料

選取2020 年4 月至2022 年12 月在中山市人民醫(yī)院南朗分院血液凈化中心經(jīng)動(dòng)靜脈內(nèi)瘺行規(guī)律血液透析的患者60 例為研究對(duì)象。收集患者的一般資料，其中包括性別、年齡、透析時(shí)長、原發(fā)疾病史，選取其中32 例發(fā)生過內(nèi)瘺狹窄且經(jīng)過取栓或修補(bǔ)后繼續(xù)進(jìn)行透析治療的患者為觀察組，其余未發(fā)生過內(nèi)瘺狹窄的患者為對(duì)照組。兩組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性（見表1）。所有患者或其委托人均已簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前檢測動(dòng)脈內(nèi)徑＞1.5 mm，靜脈內(nèi)徑＞5.0 mm；（2）血管彩超提示血流量≥500 mL/min，透析血流量≥200 mL/min；（3）動(dòng)靜脈內(nèi)瘺正常使用3 個(gè)月以上；（4）每周透析2 ～4 次。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有心腦血管病史者；（2）長期口服抗凝藥物者；（3）存在急慢性感染者。

表1 兩組患者一般資料的對(duì)比

1.2 方法

1.2.1 評(píng)估血液透析患者動(dòng)靜脈內(nèi)瘺情況 所有患者治療期間均每2 ～4 周復(fù)查1 次深靜脈超聲，評(píng)估血栓情況。具體方法如下：患者在非透析日進(jìn)行檢查，取仰臥位，充分暴露內(nèi)瘺側(cè)前臂，使用彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行檢查，探頭頻率5 ～12 MHz。選取上肢靜脈血管模式，通過二維超聲找到供應(yīng)動(dòng)脈、吻合口及引流靜脈, 觀察管腔大小。管壁及管腔內(nèi)外回聲情況。然后借助彩色多普勒血流顯像觀察整個(gè)通路的血流狀況, 檢查血流的方向性、通暢度以及是否有其他異常。最后使用頻譜多普勒測量供應(yīng)動(dòng)脈、吻合口、引流靜脈以及病變處的血流頻譜, 檢查血流的速度和性質(zhì), 使用脈沖頻譜多普勒時(shí)使血流方向與聲束的夾角≤60°。患者出現(xiàn)以下情況之一即記為1 次血栓事件：（1）動(dòng)靜脈內(nèi)瘺靜脈端內(nèi)徑≤2.0 mm 或血管狹窄超過原內(nèi)徑60% 以上；（2）血管彩超提示血流量≤200 mL/min 或透析血流量≤150 mL/min；（3）血管彩超提示靜脈血栓形成。

1.2.2 檢測血液透析患者的F5 及PAI.1 基因多態(tài)性 在血液透析患者進(jìn)行透析前采集其外周靜脈血2 ～3 mL，置于乙二胺四乙酸( EDTA) 抗凝管內(nèi),4℃下保存。在檢測之前取200 μL 靜脈血置于稀釋后的NH4Cl（1 mL）中進(jìn)行預(yù)處理，靜置5 min 待紅細(xì)胞充分裂解，然后使用高速離心機(jī)在3000 r·min.1的轉(zhuǎn)速下離心5 min。離心完畢后棄上清,加入30 μL 耀金保與管底白細(xì)胞進(jìn)行充分混合,靜置30 min 后檢驗(yàn)。本次研究檢測位點(diǎn)通過PAI.1( rs1799889) 4G/5G,F5(rs6025)G/A。采用熒光染色原位雜交法,耀金分測序反應(yīng)通過通用試劑盒雜交進(jìn)行顯色, 使用雙通道實(shí)時(shí)數(shù)字熒光定量PCR 儀進(jìn)行檢測。每批試劑均使用校準(zhǔn)液進(jìn)行校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）] 表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用χ2 檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用spearman 檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic 回歸分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者D.二聚體水平的對(duì)比

觀察組的D.二聚體水平〔（13.54±14.24）mg/L〕明顯高于對(duì)照組〔（7.94±12.05）mg/L〕，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.2 兩組患者基因、基因型和等位基因頻率分布的對(duì)比

兩組患者的F5 與PAI.1 基因型分布均符合哈迪.溫伯格平衡定律（Hardy.Weinberg equilibrium）（P ＞0.05），具有代表性。觀察組與對(duì)照組的F5 基因G/A 各基因型頻次及等位基因頻率分布相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），PAI.1 基因4G/5G 各基因型頻次及等位基因頻率分布相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），詳見表2、表3。

表2 兩組患者F5 基因G/A 基因型和等位基因頻率的分布[頻次(%)]

表3 兩組患者PAI.1 基因4G/5G 基因型和等位基因頻率的分布[頻次(%)]

2.3 血栓事件與PAI.1 基因多態(tài)性的Logistic 回歸分析

通過分析發(fā)現(xiàn)4G4G 基因類型患者與4G5G 基因類型患者靜脈血栓發(fā)生率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)；其中4G4G 基因型患者靜脈血栓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高4.9 倍，4G5G 基因型患者靜脈血栓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高2.1 倍，見表4。

表4 血栓事件與PAI.1 基因多態(tài)性的Logistic 回歸分析

3 討論

血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的關(guān)鍵因素在于血漿凝血、纖溶系統(tǒng)兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡[3]。高凝狀態(tài)時(shí)會(huì)增加患者靜脈血栓栓塞的風(fēng)險(xiǎn)。纖溶系統(tǒng)可對(duì)高凝狀態(tài)起到抑制作用，其酶原激活物（t.PA）與尿激酶纖溶酶原激活物（u.PA）可使纖溶酶原激活形成纖溶酶，纖溶酶介入纖維蛋白肽鏈上的賴氨酸.精氨酸，可使血管內(nèi)血栓的纖維蛋白結(jié)構(gòu)溶解[4]。其中纖溶酶原激活劑抑制物.1(PAI.1) 可有效抑制纖溶系統(tǒng)，是血栓事件發(fā)生的關(guān)鍵因子。PAI 作為一種起效迅速的纖溶酶原激活物抑制劑，主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞及肝細(xì)胞產(chǎn)生，其作用原理是通過u.PA 或t.PA 互相結(jié)合產(chǎn)生1:1 的復(fù)合物，以達(dá)到抑制纖溶酶原激活、有效控制纖維蛋白溶解的目的[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物體內(nèi)PAI.1 的活性、血漿水平與血栓形成有密切關(guān)系。PAI.1 基因缺陷會(huì)導(dǎo)致纖溶系統(tǒng)受損，當(dāng)濃度降低時(shí)可導(dǎo)致出血性疾病發(fā)生，濃度升高時(shí)則會(huì)導(dǎo)致靜脈血栓栓塞。近年來隨著遺傳藥理學(xué)與基因組學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)人體PAI.1 基因多態(tài)性與血漿PAI.1 濃度有著明顯的關(guān)聯(lián)[7]。有研究[8]表明F5 基因多態(tài)性可影響血栓事件，F(xiàn)5 基因中的活化蛋白C（ActivatedProtein C，APC）可通過水解活化因子V（Factor V）形成有抗凝作用的FVac，導(dǎo)致凝血酶原的活性降低，從而刺激纖溶酶原激活物的釋放，增加纖溶活性。同時(shí)有研究[9]發(fā)現(xiàn)F5 基因的rs6025 位點(diǎn)多態(tài)性與血液透析患者內(nèi)瘺狹窄和閉塞的風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性，該位點(diǎn)的GA 基因型和AA 基因型攜帶者的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)均高于GG 基因型攜帶者。也有研究[10]發(fā)現(xiàn)F5 基因的rs6025 位點(diǎn)多態(tài)性與血液透析患者內(nèi)瘺狹窄和閉塞的風(fēng)險(xiǎn)無顯著相關(guān)性，但其與其他遺傳因素的相互作用可能會(huì)增加患者發(fā)生內(nèi)瘺并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。可見，需要通過進(jìn)一步的研究來確認(rèn)F5 基因與血液透析患者內(nèi)瘺狹窄和閉塞形成的關(guān)系。本次研究發(fā)現(xiàn)PAI.1 基因不同表型之間與血栓事件發(fā)生存在關(guān)聯(lián)（P ＜0.05）,4G 等位基因患者血漿PAI.1 濃度與發(fā)生血栓的概率比5G 等位基因患者要高，分析其原因在于5G 等位基因在PAI.1 基因啟動(dòng)子區(qū)插入了1 個(gè)堿基，從而多生成一個(gè)核蛋白( 因子B) 的結(jié)合位點(diǎn)，核蛋白可有效抑制轉(zhuǎn)錄作用，致使PAI.1 的表達(dá)受到影響[11]。因此PAI.1 基因的5G 等位基因位點(diǎn)可有效轉(zhuǎn)錄和抑制t.PA 或u.PA 的結(jié)合，相比之下，4G 等位基因位點(diǎn)只能轉(zhuǎn)錄不能抑制結(jié)合。而F5 基因G/A 各基因型頻次及等位基因分布相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。同時(shí)本次研究將PAI.1 基因型3 種不同類型納入多因素 Logistic回歸分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，4G4G 與4G5G 基因型是靜脈血栓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其中4G4G 基因型患者靜脈血栓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高4.9 倍，4G5G 基因型患者靜脈血栓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高2.1 倍。結(jié)果表明PAI.1 基因種4G/5G 基因型與經(jīng)動(dòng)靜脈內(nèi)瘺行規(guī)律血液透析患者發(fā)生血栓的風(fēng)險(xiǎn)有一定的相關(guān)性，分析其原因在于4G等位基因患者血漿中PAI.1 的濃度較高，導(dǎo)致4G4G基因型患者更容易發(fā)生靜脈血栓。

綜上所述，臨床上可通過經(jīng)動(dòng)靜脈內(nèi)瘺行規(guī)律血液透析患者的PAI.1 基因型判斷是否需要為其使用抗凝或抗血小板藥物進(jìn)行預(yù)防血栓形成處理，臨床醫(yī)生應(yīng)對(duì)上述情況予以關(guān)注。