坎地沙坦對肝癌小鼠新生血管生成的抑制作用

崔志華,蔣麗媛,井磊,王亞珍

(保定市第一醫院腫瘤科,河北 保定 071000)

近年來肝癌發病率呈上升趨勢,晚期肝癌患者失去了根治性切除的機會[1-3],只能保守治療,部分患者即使行姑息性切除術,但5年生存率僅為10%左右[4],所以尋找肝癌有效的治療方案可使廣大晚期肝癌患者獲益。血管緊張素Ⅱ (angiotensin Ⅱ,AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統的重要效應介質,可通過其受體發揮作用[5-7]。血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)能夠抑制腫瘤新生血管生成,證明Ang II可能具有血管生成等生物學效應[8]。本實驗主要研究Ang II1型受體拮抗劑(AngiotensinⅡ type 1 recepeor,AT1 ) 坎地沙坦對肝癌小鼠新生血管生成的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、H22肝癌細胞株及試劑

肝癌H22細胞株(河北醫科大學實驗動物中心)。雄性BALB/C小鼠(清潔級Ⅱ)鼠(第二軍醫大學實驗動物中心)。主要試劑:Ang II1型受體拮抗劑(AT1)坎地沙坦西酯片(日本武田藥品工業株式會社);兔抗小鼠血管內皮生長因子(VEGF)多克隆抗體(美國Santa Cruz生物技術公司);EnVision免疫組化試劑盒(美國Dako公司);氟尿嘧啶注射液(上海旭東海普藥業有限公司)。

1.2 建模及分組

1.2.1 腫瘤細胞懸液的制備及細胞活力計數檢測 將保種7 d的種鼠脫頸處死,抽取腹水至無菌離心管內,800 r/min離心3 min,按1∶5加生理鹽水稀釋混勻,制成腫瘤細胞懸液。取0.5 mL腫瘤細胞懸液于無菌管中,加入0.4% 0.5mL臺盼蘭染色鐘,光學顯微鏡下觀察活細胞數(活細胞不被臺盼蘭染色,呈無色透明狀)。計算細胞活力>90%(細胞活力=活細胞數/總細胞數×100%)。同時檢測細胞計數,并根據細胞計數調整腫瘤細胞懸液濃度至5×106個/mL。

1.2.2 造模及分組 110只BALB/C小鼠均適應性飼養1周,注入約1×106個腫瘤細胞的細胞懸液完成建模。選擇建模成功的BALB/C小鼠100只,采用數字表隨機法分為空白對照組(NEC組)、低劑量坎地沙坦組(LCA組)、中劑量坎地沙坦組(MCA組)、高劑量坎地沙坦組(HCA組)、氟尿嘧啶組(5-FU組) ,每組各20只。

1.3 方法

各組小鼠均常規相同的飼養,環境溫度調節在(20±2)℃,實驗過程中不控制飼料攝入量,不限制飼料成分。各組小組均在建模后24 h開始治療。NEC組:0.9%生理鹽水0.6 mL灌胃,1次/d,連續8 d。LCA組、MCA組、HCA組各50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg坎地沙坦灌胃,1次/d,連續8 d。5-FU:5-FU 25 mg/kg,腹腔注射,1次/d,連續6 d后常規喂養。

1.4 觀察指標

(1)體重及腫瘤生長情況:建模前、治療第2、4、6、8天給藥前先給小鼠秤重,觀察體重變化,記錄各小鼠建模至可見腫瘤時間。(2)治療后第9 天,每組小鼠各隨機選取10只脫頸處死,拔取完整腫瘤組織,用游標卡尺測量腫瘤最長徑和垂直徑,計算腫瘤體積并稱重,計算抑瘤率[抑瘤率=(NEC組瘤重-各實驗組瘤重)/NEC組瘤重×100%]。將腫瘤體積等分切開,一份用4%戊二醛固定用透射電鏡觀察細胞凋亡;另一份用10%福爾馬林固定,行HE染色作組織病理學檢查,觀察腫瘤組織Ang II1型受體陽性率,計算抑瘤率;應用免疫組化法標記VEGF;應用EnVision免疫組化二步法檢測腫瘤組織微血管密度。(3)各組剩余的10只小鼠停藥后不處死,繼續飼養,記錄存活時間。

1.5 結果判定

VEGF陽性判定標準:以棕黃色染色的細胞漿或細胞膜為陽性,根據陽性細胞占比與強度計分,無陽性細胞和無染色計0分;陽性細胞占1%～25%,染色強度弱計1分;陽性細胞占26%～50%,染色強度中計2分;陽性細胞占51%～75%,染色強度強計3分;陽性細胞占76%～100%,計4 分。VEGF陽性分值=陽性細胞占比評分+染色強度評分。

微血管密度(MVD)判定:分別用低倍(100×)和高倍(400×)鏡在腫瘤組織微血管最豐富區域選取3個視野,計數微血管數,取平均值。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠體重情況

各組小鼠建模前體重比較,差異無統計學意義(P>0.05)。治療后4 d、6 d、8 d ,5-FU組小鼠體重低于建模前,其余4組均高于建模前(P<0.05)。組間兩兩比較:治療后4 d、6 d、8 d,5-FU組體重均低于其余4組;治療后8 d, MCA組、HCA組小鼠體重低于NEC組、LCA組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠建模前后體重比較

2.2 各組治療9 d后瘤體重量和抑瘤率比較

各組瘤體體積、瘤體質量組間兩兩比較:NEC組>LCA組>MCA組>HCA組、5-FU組(P<0.05);抑瘤率組間兩兩比較:LCA組LCA、MCA組>HCA組(P<0.05)。見圖1。MVD組間兩兩比較:NEC組、5-FU組>LCA組>MCA組>HCA組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠治療9 d后瘤體重量和抑瘤率比較

2.3 透射電鏡結果

JEOL-1200EX透射電鏡(放大倍速數50萬倍)觀察顯示,NEC組小鼠腫瘤組織細胞核大深染,細胞結構不完整,形態不規則,核質比例增大,胞質內可見許多空泡,未見細胞凋亡征象;LCA、MCA、HCA、5-FU組小鼠腫瘤組織均可見不同階段的凋亡細胞;各組凋亡細胞數量由高到低排序為:HCA組、MCA組、LCA組和5-FU組。LCA組腫瘤細胞核染色質濃縮,表面有微絨毛,胞膜完整,部分線粒體可見嵴和膜的融合、消失;MCA組腫瘤組織細胞核染色質聚集,胞膜較完整,線粒體呈空泡狀,髓樣化;HCA組核染色質高度濃縮,胞膜部分完整,線粒體髓樣化,呈囊泡狀或空泡狀,嵴雜亂無章,膜包裹內可見胞核碎片凋亡小體。5-FU組腫瘤細胞排列較規則,粗面內質網擴張,細胞器較少,胞質較多,膠原纖維增生明顯,核周隙寬。見圖2。

2.4 腫瘤進展及生存情況比較

各組小鼠建模至可見腫瘤時間、平均存活時間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。建模至可見腫瘤時間組間兩兩比較:LCA、MCA、HCA、5-FU組均長于NEC組,差異有統計學意義(P<0.05)。平均存活時間組間兩兩比較:HCA組>MCA組、5-FU組>LCA組>NEC組(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠建模至可見腫瘤時間和平均存活時間比較

3 討論

腫瘤形成初期主要靠彌散,當體積≥2 mm3時,其所需的營養物質和氧氣等就必須依靠血管供應,一旦腫瘤新生血管生成受到抑制,癌細胞所需的營養供應減少或阻斷,會導致癌細胞凋亡、壞死,繼而出現腫瘤退化、萎縮[9-11]。因此,抑制腫瘤新生血管的生成是治療惡性腫瘤的新靶點,也是腫瘤靶向治療的新途徑。目前有研究在乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤組織中呈高表達,且AngⅡ受體主要是AT1[12-14]。新生血管生成是公認的實體腫瘤預后評估的有價值的因素,同樣也可用于肝癌預后的評估。腫瘤誘導新生血管生成的過程十分復雜,多種細胞因子起著重要的作用,其中VEGF是介導血管生成最重要的細胞因子。本實驗結果顯示,各組VEGF陽性評分差異均有統計學意義(P<0.05)。VEGF陽性評分組間比較:NEC組、5-FU組>LCA、MCA組>HCA組(P<0.05)。而5-FU組小鼠腫瘤組織VEGF陽性評分與NEC組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。說明AT1可抑制小鼠腫瘤組織VEGF表達,且存在劑量依賴性,劑量越大,對腫瘤組織VEGF表達的抑制作用越強。而5-FU對小鼠腫瘤組織VEGF表達無明顯的抑制作用。

MVD是評價血管生成狀況的可靠指標,可反映血管生成程度。本實驗結果顯示MVD組間比較:NEC組、5-FU組>LCA>MCA組>HCA組(P<0.05)。提示AT1可能顯著抑制肝癌小鼠新生血管的生成,降低腫瘤組織的微血管密度,且呈劑量依賴性。臨床常用的化療藥物5-FU抑制新生血管生成的作用并不明顯。本實驗結果顯示,各組瘤體體積、瘤體重量組間兩兩比較:NEC組>LCA組>MCA組>HCA組、5-FU組(P<0.05)。抑瘤率組間兩兩比較:LCA組

延長肝癌的生存期,提高生活質量也是肝癌治療的主要目的。本試驗結果顯示,小鼠模型建立后在腫瘤生長期間,NEC、LCA、MCA、HCA組小鼠體重持續增加,但增加幅度隨著藥物劑量的增加呈下降趨勢。只有5-FU組小鼠體重持續減輕,通過觀察發現,5-FU組小鼠治療期間所有小鼠均出現了不同程度的腹瀉,藥物的副反應影響了該組小鼠的食欲,這就是5-FU組小鼠體重不增反降的可能原因。而觀察NEC、LCA、MCA、HCA各組小鼠,建模后進食量較之前無明顯變化,未發現腹瀉及其它副反應,小鼠體重因劑量增加而減輕可能與腫瘤重量有關。本實驗結果顯示,各組平均存活時間比較差異有統計學意義(P<0.05)。各組平均存活時間組間比較,HCA組>MCA組、5-FU組>LCA組>NEC組(P<0.05)。說明AT1能顯著延長肝癌小鼠的生存時間,且隨著AT1劑量的增大,小鼠生存時間明顯增加,呈劑量依賴性。透射電鏡觀察顯示,NEC組小鼠腫瘤組織未見細胞凋亡征象;LCA、MCA、HCA、5-FU組小鼠腫瘤組織均可見不同階段的凋亡細胞;各組凋亡細胞數量由高到低排序為:HCA組、MCA組、LCA組和5-FU組。

綜上,AT1可抑制肝癌小鼠移植瘤的生長和新生血管生成,延長小鼠生存時間,其抑郁作用存在量效依賴性。提示AT1有可望成為肝癌治療的安全有效藥物。本實驗初步探討了AT1在體內對肝癌的抑制作用及機制,為肝癌分子發病機制的深入研究提供理論基礎,為肝癌治療模式的改進提供新途徑,但AT1的抗肝癌機制有待進一步研究。