TurboID技術在疾病蛋白質組學中的發展與應用

張芷源 綜述,丁 明 審校

(中國藥科大學生命科學與技術學院,江蘇 南京 210009)

細胞是生命的最小單位,而蛋白質是生命物質的基礎。在細胞中蛋白質之間通常會形成復合物及構建對維持細胞結構、功能完整至關重要的相互作用網絡來控制不同的生理生命過程。為了解釋這些過程,研究蛋白質的相互作用、蛋白質作用的時間及空間分布則尤為重要。蛋白質-蛋白質的相互作用(PPI)與生物功能的執行及疾病的發生發展密切相關。探索隱藏于復雜的細胞信號通路及調控網絡下的PPI則需要克服諸多傳統方法的技術缺陷。常見的研究蛋白互作體的方法有親和純化-質譜(AP-MS)和酵母雙雜交[1-2]。利用基于AP技術的方法需要裂解細胞并且受限于純化方式,即使可以純化也會容易出現假陽性的鑒定污染,并且在蛋白互作體純化過程中由于嚴格的洗滌,那些短暫而微弱的相互作用可能會消失[3]。而酵母雙雜交試驗只能提示2種蛋白質的潛在相互作用,而不是實際發生在體內的相互作用[3]。

而基于酶的鄰近依賴標記技術是一種新的PPI篩選方法,隨著這項技術的不斷發展可以一定程度上彌補傳統手段的不足。鄰近標記技術(PL)通過將具有標記功能的工程酶與感興趣蛋白(誘餌蛋白)融合,工程酶就可以將目的蛋白鄰近以及潛在互作的蛋白(獵物蛋白)進行共價標記。目前,工程酶主要有3種:辣根過氧化物酶(HRP)、生物素連接酶(BirA)、工程抗壞血酸過氧化物酶(APEX)[4]。而利用BirA及其突變體的鄰近依賴生物素鑒定(BioID)可以鑒定傳統方法容易忽略的瞬時、微弱的相互作用。隨著BioID技術的飛速發展,應用更具有優勢的BirA突變體的技術例如TurboID、miniTurboID及Split-TurboID,能夠更加快速、簡單、可靠地了解蛋白質相互作用并解釋其分子功能。本文主要對TurboID鄰近依賴生物素鑒定技術的研究進展進行歸納總結,闡述其技術原理和在疾病蛋白質組學中的重要作用。

1 鄰近依賴生物素鑒定技術的策略

鄰近依賴生物素鑒定技術是一種基于生物素連接酶(BirA)的鄰近標記技術。BirA是一種保守的酶,相對分子質量大約為35.5 kDa,來源于大腸桿菌,介導生物素與目標蛋白結合[5]。BirA在ATP存在的情況下,催化生物素形成活性biotinoyl-5′-AMP中間體并將其保持在酶活性中心,活性biotinoyl-5′-AMP從活性位點脫離后轉移到靶蛋白的鄰近蛋白表面的伯胺賴氨酸上,實現蛋白質生物素化。由于BirA對其靶序列有很高的特異性,其已被用于研究特定的蛋白質-蛋白質相互作用:BirA融合到誘餌蛋白上,生物素受體肽(BAP)融合到獵物蛋白上,如果它們之間能夠發生相互作用,獵物蛋白將因為足夠接近誘餌蛋白而被生物素化。為了實現混雜標記,對BirA的活性位點進行了突變,使其能夠在沒有BAP的情況下能夠隨機生物素化鄰近蛋白[4]。而多種相對于BirA更具優勢突變體的出現,也使得BioID技術不斷發展。

2 BioID鑒定技術的發展與分類

2.1BioID &BioID2 野生型BirA僅能標記一個蛋白,這對于研究蛋白質之間的相互作用來說遠遠不夠。2012年ROUX等[6]使用了一種高度混雜的突變形式的大腸桿菌生物素連接酶:BirA*,其已經成為PL最常用的工程酶之一。BirA*是對野生型BirA進行點突變研究,篩選得到的一種大小為35kDa的突變體BirA*(R118G),依賴BirA*的鄰近標記技術稱為BioID。BirA*的活性比BirA高,并且相對于BirA其與活性biotinoyl-5′-AMP的親和力更低,能夠更快的釋放biotinoyl-5′-AMP,實現以時間依賴性的混雜蛋白質生物素化。據估計,BirA*的有效標記半徑為10～15 nm,并且BirA*的緩慢催化動力學通常需要18～24 h來生成足夠的生物素化材料用于蛋白質組學分析[6-7],這使得其無法捕捉到短暫時間內蛋白質的相互作用。

2016年KIM等[8]對BioID方法進行了改進提出了BioID2。來源于超嗜熱菌(A.aeolicus)的生物素連接酶與來源于大腸埃希桿菌的BirA在整體結構上具有相似之處,將其催化域內的一個保守殘基點突變,得到BirA(R40G)。BirA(R40G)自然缺乏DNA結合域,相對分子質量更小,只有大約27 kDa。較小體積的生物素連接酶對融合蛋白的破壞較小并且更有利于空間定位靶蛋白。BioID2生物素標記時所需要提供的外源生物素更少、活性更高、時間更短[8-9]。

2.2TurboID &miniTurboID BioID2相比BioID技術提高了標記效率,但將獵物蛋白生物素化仍需要至少16 h,這對于捕捉瞬時動態變化仍然是不夠的。2018年BRANON等[9]以起始模板BirA(R118S)基于易出錯的多聚酶鏈式反應和第五代酵母展示的定向進化技術,工程化篩選出2種更快的混雜連接酶:TurboID(35 kDa)和miniTurboID(28 kDa)。它們催化混雜蛋白質賴氨酸殘基生物素化,而生物素化在生物體內屬于較罕見的翻譯后修飾,并且有著具有超高親和力的結合伙伴-鏈霉親和素。在活細胞內進行生物素標記后,裂解細胞并將細胞裂解物與鏈霉親和素偶聯珠結合,經過嚴格的洗滌分離得到標記的內源性蛋白質組。富集后的標記蛋白用胰蛋白酶消化得到小肽段,然后用液相色譜串聯質譜技術(LC-MS/MS)進行分析,數據可與已建立數據庫進行比較分析,鑒定候選蛋白。

TurboID相對于野生型BirA有15個突變,具有更好的催化效率和快得多的催化動力學。在ATP與外源生物素存在的條件下,TurboID在10 min就可以獲得BioID/BioID2在18 h內相同數量的生物素化蛋白[7]。miniTurboID則相對于野生型BirA有13個突變,并缺少N-末端結構,相對分子質量更小,所以可以減少對于融合蛋白追蹤與功能干擾。miniTurboID的催化活性比TurboID低2倍,在缺乏外源生物素的情況下表現出較低的催化能力,但這可使其背景干擾更小,更適合緊密的控制窗口和對時間需要精準控制的鄰近標記[4,7,9]。

不同的細胞器會有不同的pH、氧化還原環境等,這些都可能會影響PL活性。BRANON等[9]比較了TurboID、miniTurboID和BioID在HEK 293T細胞的細胞核、線粒體基質、內質網腔和內質網膜中的作用,評估得出TurboID在4種細胞器中信號強度、標記效率均優于miniTurboID和BioID。另外,TurboID在蠕蟲[9]、秀麗隱桿線蟲和黑果蠅[10]及植物(包括擬南芥、煙草植物等)[11]中能夠明顯增加生物素標記。綜上可得出結論,TurboID具有高空間分辨率,在標記識別不溶性蛋白、膜相關蛋白、特殊細胞類型的罕見蛋白及微弱/短暫的蛋白質-蛋白質相互作用中具有顯著優勢。

2.3Split-TurboID 為了提高生物素鑒定在PL體系中的空間特異性以及多功能性,拆分PL(Split-PL)體系開始被大眾提及,包括Split-APEX[12]、Split-BioID[13-14]和 Split-TurboID[15]等。將混雜連接酶拆分成2個本身不具有催化活性的小片段,這2個片段可因在活細胞中的蛋白質-蛋白質或膜-膜的關聯而結合,發揮催化活性。Split-PL是繪制細胞器接觸位點和大分子復合物蛋白質組的一種有價值的方法。相比Split-APEX而言,Split-TurboID不需要添加氧化劑或輔助因子,而這些往往具有生物毒害。KELVIN CHO等[15]通過SPELL預測將酶分成2個不活躍的部分,分別克隆為FK506結合蛋白(FKBP)和FKBP12-雷帕霉素復合物的結合位點(FRB)融合體片段,在雷帕霉素誘導下結合。這些片段再結合在不同的亞細胞室蛋白,則建立了一個雷帕霉素、生物素雙依賴的PL。例如,KELVIN CHO等[15]研究了內質網-線粒體體系,在這個體系中,內質網與線粒體的緊密結合使得拆分片段的重建,并在雷帕霉素存在的情況下增強了這種重建,發揮標記作用,探測接觸位點和特定細胞類型界面的蛋白質組學繪圖。

重組Split-TurboID活性低于TurboID,但在生物素孵育30 min后就能檢測到生物素化,并且具有更大的空間特異性。Split-TurboID可以通過設計特定的輸入信號而適用于更多領域的研究,例如免疫學、神經學及腫瘤等。TAKANO等[16]將TurboID拆分為2個Split-TurboID片段,并在星形膠質細胞與神經元相互作用的突觸間隙中重構為功能性TurboID,提供了一個新的分子框架,以理解突觸之間的連接界面及這些接觸如何控制突觸的形成和在大腦中的功能[16-17]。細胞表面的蛋白通常豐度低并具有高疏水性與異質性,亞細胞室蛋白又存在很大的空間特異性,這對于研究其蛋白質組存在很大的挑戰。而Split-TurboID就是一個新的、有力的工具,相比Split-APEX或Split-BioID具有更強的生物相容性和更小的偏差。同時,Split-TurboID還可以提高有挑戰性的靶向應用的信噪比,例如特定基因組位點的dCas9定向PL[18]或特定細胞RNA的dCas13定向PL[19]。

3 TurboID技術在疾病蛋白質組學中的應用

p53是一種調節細胞的生長周期、凋亡、衰老的腫瘤抑制基因,而p53的突變則成為27種癌癥發生發展的驅動因子。而研究最熱的p53(R175H)突變型與細胞基因組穩定性、腫瘤的生長、轉移及耐藥性密切相關[20-21]。比對p53(R175H)與野生型p53相互作用的蛋白質的差異,有助于理解突變型p53作用分子機制。HU等[21]利用鄰近標記技術構建了miniTurboID與p53(R175H)、野生型p53的融合體,利用LC-MS/MS分析相互作用蛋白,通過GO富集與KEGG分析發現大部分的互作蛋白都集中在代謝和遺傳信號處理的通路中,而剪接體為最顯著富集的途徑。

胃癌是世界上發病率、死亡率最高的惡性癌癥之一,探索腫瘤增殖、侵襲、轉移與凋亡的分子機制對發現靶向藥物至關重要。吲地磺胺對多種腫瘤都具有抑制作用,并已有研究證明吲地磺胺能與DCAF15(DDB1與CUL4相關因子15)相互作用,誘導下游底物降解,從而抑制結腸癌細胞的生長[22]。LU等[23]將TurboID與DCAF15融合,誘導生物素化標記鄰近蛋白,通過鄰近標記技術及后續實驗證明了吲地磺胺抑制胃癌細胞的增殖的作用機制。利用PL技術分析腫瘤相關蛋白或藥物在體內的相互作用網絡,分析其作用機制,有利于發現新的藥物靶標與腫瘤治療靶點。

細胞質中存在病原性或自身DNA會觸發天然免疫系統,產生的危險信號會刺激cGAS-STING信號通路,誘導產生干擾素而發揮非特異性免疫作用。MOTANI等[24]融合STING與TurboID,尋找STING可能的互作蛋白。利用鄰近標記研究發現STING的激活會導致高爾基體和核內體中許多蛋白的生物素化,干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM3)就是其中一個,更具進一步研究證明IFITM3的確是STING的新互作體[24]。IFITM3是一種病毒限制性因子,尤其是針對RNA病毒,例如A型流感病毒、西尼羅病毒、登革病毒等[25]。有趣的是,也有研究表明STING也對這類病毒具有抑制作用,所以STING 可能是參與對IFITM3的調控而起到抗病毒活性。STING在天然免疫包括抗病毒免疫中發揮重要作用,維持生命體的健康,但是STING的過度活化也會導致很多自身免疫疾病的產生,所以利用TurboID研究STING的相互作用蛋白尤為重要。

2019年新型冠狀病毒(COVID-19)首次出現并迅速席卷全球,這場全球流行病的病原體冠狀病毒被稱為SARS-CoV-2,其肆虐已導致超5億人感染。而研究SARS-CoV-2的病毒蛋白在宿主細胞內的行為可以揭示潛在的發病機制,并幫助治療藥物、疫苗的開發。通過鄰近標記技術探索病毒-宿主互作體為了解病毒蛋白對宿主細胞的直接影響提供了新途徑。MAY等[26]利用PL技術,將單個的SARS-CoV-2蛋白與TurboID融合并構建穩轉細胞系,然后進行全細胞蛋白質組的組學分析和生物素化蛋白的親和純化,再通過質譜鑒定PPIs。識別由于病毒蛋白表達而受影響的全細胞蛋白質組學變化,并識別單獨的病毒蛋白-宿主細胞蛋白之間的特異的相互作用。將最后得到的BioID數據集與CLUE臨床藥物庫和FDA批準的藥物進行交叉引用,以確定對COVID-19相關治療可能有益的藥物,也為揭示SARS-CoV-2的生物學特性和研發抗病毒藥物提供了寶貴的資源[26-27]。

鄰近標記技術被廣泛應用于癌癥、免疫、神經等領域,為疾病產生的生理病理過程機制、藥物發現、靶向性治療提供了不可磨滅的貢獻。在人體內大腦猶如一個精密的儀器控制著人體的生命活動,而神經元、突觸就相當于這個精密儀器中至關重要的作用元件。有研究證明,星形膠質細胞-突觸相互作用的功能障礙可能會導致精神和神經發育障礙[28]。TAKANO等[16]將TurboID拆分為2個低活性片段(split-turboID),分別融合表達在星形膠質細胞、神經元突觸表面,而通過突觸間隙重構為有活性的TurboID酶。而利用的Split-TurboID技術的確高度標記出了大腦皮層神經興奮性、抑制性神經元與星形膠質細胞之間間隙中的蛋白質,而識別的蛋白質多數上都是獨一無二。星形膠質細胞中信號通路的異常與多種綜合征、疾病的發病機制相關,例如慢性神經性疼痛、自閉癥和癲癇等[16-17,29]。TurboID技術在其他多種疾病中也可運用,為發現多種疾病的發病機制、治療方案與治療靶標提供了新的有力手段,極具經濟價值。

4 小 結

隨著對蛋白質-蛋白質之間相互作用網絡的研究愈發深入,鄰近標記技術也被越來越多的研究者應用在各種領域,比如蠕蟲、秀麗隱桿線蟲和黑果蠅及植物中。同時也給研究腫瘤等各種疾病的生理病理機制與治療提供了新思路。PL技術主要為3種,依賴辣根過氧化物酶(HRP)的生物素標記、依賴生物素連接酶(BirA)的生物素標記及依賴工程抗壞血酸過氧化物酶(APEX)的生物素標記,但HRP由于在哺乳動物細胞質的還原環境中催化活性低且結構不穩定,逐漸在研究PPI的洪流中退出。而BioID技術相對于APEX2而言,其不需要額外的催化因子或助氧化劑,這些往往具有生物毒害性并且可能使細胞為響應氧化應激而改變全細胞蛋白質組的相互作用,從而改變細胞的生理機能,出現假陽性結果。BioID也存在很多不足,例如慢催化動力學、BirA*酶本身具有一定大小、催化半徑小于APEX2等。因此,這也促使研究者們不斷地探索,使得BioID技術不斷的優化。

2018年BRANON等[9]提出了TurboID和miniTurboID的概念,有效解決了BioID的慢催化動力學問題,將生物素標記時間縮短到10 min,并且證明了TurboID的高空間分辨率特性,在標記識別不溶性蛋白、膜相關蛋白、特殊細胞類型的罕見蛋白及微弱/短暫蛋白質-蛋白質相互作用中具有顯著優勢。對于酶催化PL中存在的空間限制,TAKANO等[16]將TurboID進行了拆分,得到了Split-TurboID。若將Split-TurboID片段融合在不同細胞或亞細胞室表面蛋白上,蛋白質之間的相互作用能夠重構有催化活性的TurboID,然后分析生物素化蛋白,則可以探測接觸位點和特定細胞類型界面的蛋白質組學。隨著TurboID技術的不斷發展與創新,逐漸成為一種有效的PL技術,在不同領域發揮作用,并廣泛應用于PPI的鑒定、疾病發生機制研究與藥物靶點的篩選,為廣大科研工作者提供了新的思路和研究手段,推動生命科學的不斷進步。