循環腫瘤細胞與三陰性乳腺癌預后及腫瘤狀態的關系分析

王 浩, 李南林, 曹海玲

(廣東省廣州市番禺區中心醫院, 1. 病理科, 3. 甲狀腺乳腺外科, 廣東 廣州, 510000;2. 中國人民解放軍空軍軍醫大學西京醫院 甲乳外科, 陜西 西安, 710032)

乳腺癌(BC)是女性最常見的一種惡性腫瘤,且發病率呈逐年升高趨勢[1]。BC包括不同的亞型,通常根據雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及人表皮生長因子受體2(HER2)的狀態進行分類[2]。ER、PR、HER2均陰性表達的三陰性乳腺癌(TNBC), 由于具有疾病侵襲性高等特點且缺乏特異性治療靶點,目前治療難度較大[3]。原發性腫瘤樣本可反映特定腫瘤類型的相關特征,也可明確最具侵襲性腫瘤細胞的分子復雜性。基于循環腫瘤細胞(CTC)的研究可提供疾病的全面信息及不同位置腫瘤的特征,幫助識別新的生物標志物和治療靶點,進而改善癌癥患者預后[4]。不同階段TNBC患者的外周血中均存在CTC[5], CTC簇在TNBC患者中常見且與不良預后相關[6]。除了CTC對TNBC患者的預后價值之外, CTC的表型和分子特征還可以用于實時液體活檢。AGELAKI S等[7]發現,早期TNBC患者CTC表型具有異質性,而HER2陽性(HER2+)在疾病演變過程中一直存在。CTC在腫瘤細胞轉移過程中發生變化,這些變化主要與上皮間充質轉化(EMT)過程、上皮標記物表達減少和可塑性、侵襲性增加有關,可使腫瘤細胞更能抵抗細胞衰老和死亡,從而影響腫瘤的治療和預后[8]。本研究從32例Ⅲ～Ⅳ期TNBC患者外周血中分離出CTC, 用與癌癥侵襲性和細胞可塑性相關的基因進行表征,以期確定新的生物標志物和治療靶點,為TNBC患者的治療方案制訂和預后監測提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取廣州市番禺區中心醫院2014—2017年收治的32例TNBC患者作為研究對象。納入標準: ① 病理診斷符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2015版)》中的TNBC診斷標準者; ② 首次發病或復發者; ③ 血細胞計數、肝腎功能和血脂指標等正常者; ④ 同意參與研究并簽署知情同意書者。排除標準: ① 乳腺急性炎癥期患者; ② 存在精神疾病或認知功能障礙者; ③ 合并其他惡性腫瘤者; ④ 哺乳期或妊娠期婦女。另選取30名匹配的健康人員作為對照,年齡42～78歲,平均56.1歲。本研究經廣州市番禺區中心醫院倫理委員會批準,所有受試者簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CTC檢測和分析: 分別采集所有患者和健康人員的外周血各2管(3.2 mL/管)。第1管外周血樣先于室溫條件下以1 900轉/min離心5 min棄上層血漿,再用氯化銨裂解紅細胞后以1 900轉/min離心5 min去除紅細胞碎片,加入磁珠孵育后去除白細胞,將剩余細胞懸液濃縮涂片。干燥后,使用抗人CD45和針對7號染色體著絲粒、8號染色體著絲粒的探針通過CD45免疫染色和熒光原位雜交(FISH)技術檢測CTC。CD45陰性, 7號染色體著絲粒或8號染色體著絲粒中任意1個陽性, 4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚陽性,則該樣品被判定為CTC。第2管外周血樣用于分離上皮細胞黏附分子(EpCAM)陽性CTC, 將全血樣品于室溫下以 600 ×g離心10 min, 去除血漿,將細胞部分與涂有抗EpCAM 抗體(克隆 Ber-EP4)的動態珠孵育并分離,產生磁場。富集步驟后,將與磁珠偶聯的CTC重懸于100 μL RNAlater中,并儲存于-80 ℃環境直至RNA提取。本研究將每3.2 mL血液中含5個CTC作為CTC陽性閾值,使用Cyttel方法識別和計數CTC, 該方法結合了陰性富集、CD45免疫染色和FISH技術(預實驗中已確認技術細節,包括方法的準確性、線性和重現性)。CTC檢測使用Cyttel CTC檢測試劑盒和Cyttel CTC檢測系統,均由萊爾生物醫藥科技有限公司(萊爾生物)生產。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測基因表達: ① 使用 Qiagen QIAmp病毒RNA提取試劑盒提取CTC樣本的RNA, 使用Takara SuperScriptⅢ反轉錄試劑盒合成cDNA, 使用TaqMan PreAmp Master Mix試劑盒進行RT-qPCR檢測。將CD45作為內參基因,采用2-△△ct法進行相對定量分析。② 使用miRNeasy FFPE提取試劑盒和脫蠟溶液從所有福爾馬林固定石蠟包埋組織(FFPE)切片樣品(3個10 μm切片)中提取 RNA,使用Takara SuperScriptⅢ反轉錄試劑盒合成 cDNA, 使用TaqMan PreAmp Master Mix試劑盒進行實時定量PCR檢測。將GAPDH作為內參基因,采用2-△△ct法進行相對定量分析。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 TNBC患者一般資料和臨床病理特征分析

32例TNBC患者年齡33～80歲,平均58.5歲; 腫瘤分期為Ⅲ期9例,Ⅳ期23例; 樣本狀態為初診24例,復診8例; 腫瘤轉移21例,其中17例為內臟轉移,4例同時有內臟轉移和骨轉移; 腫瘤病理類型為導管原位癌29例、浸潤性小葉癌1例、化生性乳腺癌2例,組織學分級為3級22例、2級10例; 有手術史者23例,未接受過任何抗腫瘤治療者5例; Ki67表達水平低4例、高27例,表達陰性1例; 疾病進展期20例,無進展生存期(PFS)為0.5～45.2個月,平均12.4個月; 生存狀態為生存15例、死亡17例,總生存期(OS)為0.5～45.2個月,平均18.4個月。

2.2 TNBC患者CTC計數及其與預后的關系

采用Cyttel技術檢測31例患者(另1例患者因出現假陰性情況被剔除)外周血中CTC水平,其中8例檢出≥5個CTC, 3例檢出CTC簇。本研究未發現CTC計數與其他臨床病理特征存在相關性。與3.2 mL血樣中CTC計數<5個的23例患者相比, CTC計數≥5個的8例患者PFS、OS均更差,差異有統計學意義(P=0.033、0.006), 表明CTC計數對TNBC患者預后具有評估價值; 3.2 mL血樣中CTC計數≥5個的患者中, CTC簇的存在與患者較差的OS有關(P=0.001)。見表1。

表1 31例TNBC患者CTC水平與預后情況

高水平VIM不僅與高水平的EMT啟動子(如TIMP1或SNAIL1)和干細胞標記物(如CD44、ALDH2和CD49F)相關,還與EPCAM、CDH1基因相關。受試者工作特征(ROC)曲線分析結果顯示,這些基因的曲線下面積(AUC)均>0.66, 且P<0.05, 可區分患者與健康對照者,證實其對腫瘤細胞轉移具有診斷價值,見表2。

表2 CTC標記物的診斷價值

2.3 TNBC患者CTC具有細胞高可塑性的特征

為了利用Cyttel系統對CTC計數進行補充,本研究于EpCAM陽性CTC免疫分離后通過RT-qPCR法對患者隊列中的CTC群體進行表征,將30名健康對照者的外周血樣本作為所選基因的非CTC相關表達的參考對照。將GAPDH和CD45作為內參基因進行表達譜分析,包括與EMT、干性表型和BC侵襲性相關的基因。分析所有樣本后,本研究發現CTC群體的特點是表達上皮標志物(CDH1、EPCAM), 與分離方法一致; 此外,這些細胞還不同程度表達與間充質和更多惡性特征相關的基因(如VIM、SNAIL1、TIMP1和CRIPTO1等)以及干性標記物(如CD49F、ALDH2、CD44和BCL11A等),見圖1。

A: 上皮相關基因(CDH1、EPCAM); B: 間充質相關基因(VIM、SNAIL1、TIMP1、CRIPTO1、ZEB1、ZEB2、LOXL2); C: 干細胞特征基因(CD49F、ALDH2、CD44、BCL11A、ALDH1和CD133); D: AR、ANXA2基因。灰色圓點代表健康對照者(n=30)基因表達水平,黑色圓點代表TNBC患者(n=32)基因表達水平。圖1 TNBC患者CTC和健康對照者CTC的基因表達譜比較

2.4 CTC表達特征對患者預后的預測價值

以百分位數70作為臨界值,將基因表達水平分為高水平和低水平。高水平CD49F與轉移腫瘤細胞存在相關性(P=0.024), 而非轉移腫瘤細胞顯示低水平AR(P=0.035)和TIMP1(P=0.014)。為了確定TNBC患者CTC標志物的預后價值,本研究進行Kaplan-Meier生存分析,結果顯示,高水平的CD49F、ALDH2、CD44、GAPDH、TIMP1均與患者較短的OS顯著相關(P<0.05), 高水平的CD49F、GAPDH、TIMP1均與患者較短的PFS顯著相關(P<0.05), 見表3。Cox回歸分析顯示,CD49F、TIMP1、GAPDH、ALDH2、CD44高水平患者的死亡風險顯著增加,分別是低表達水平患者的5.12、5.12、5.18、3.12、3.70倍;CD49F、TIMP1、GAPDH高水平患者的復發風險也顯著增加,分別是低水平患者的3.33、3.86、3.56倍,見表3。

表3 CTC標志物的單變量Cox回歸分析

本研究對所有差異表達的標記物進行二元Logistic回歸和ROC曲線分析。分析結果顯示,TIMP1、SNAIL1、BCL11A三者聯合是檢測腫瘤細胞轉移的最佳組合(AUC為0.861,P<0.001)。模型方程為Ln(odds) =2.02+0.31×TIMP1表達+0.05×SNAIL表達+0.55×BCL11A表達。基于這個模型,本研究能夠以0.756的截斷值和100%的特異度,識別出60%的患者存在轉移性腫瘤細胞。

本研究進一步分析CTC標志物表達水平和CTC細胞計數后發現, CTC計數≥5個的患者具有更高水平的CDH1、EPCAM、TIMP1(P=0.018、0.008、0.025), 表明Cyttel系統識別的CTC表達這3種標志物。為了確定標志物在腫瘤細胞轉移過程中的作用,本研究分析了19例患者在診斷或手術時獲得的原發腫瘤、轉移組織和健康組織樣本,并在原發腫瘤和非腫瘤組織的轉移灶中發現EPCAM、SNAIL1、CD44、CDH1、TIMP1和BCL11A表達水平顯著增高,說明其可能在腫瘤形成和轉移過程中發揮重要作用。

3 討 論

近年來,研究[9-10]證明CTC與不同類型腫瘤的預后有關。CTC具有特殊的分子特征,是轉移病灶形成的關鍵,而TNBC是最具侵襲性的BC亞型,具有高轉移率和缺乏有效治療靶點等特點[11]。因此,對TNBC患者CTC進一步研究,或可為改善預后和明確診斷提供有用信息。

本研究基于Cyttel系統發現患者CTC陽性檢出率為25.8%(8/31), 這些患者均已出現轉移。ZHANG Y W等[12]使用Cyttel技術分析286例Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期TNBC患者手術前后的CTC水平,發現各期的平均CTC含量分別為23%、37%和 56%。MAGBANUA M J等[13]基于Cyttel系統發現102例Ⅳ期TNBC患者開始化療前的CTCs檢出率(CTCs ≥5個)為 44%, 而開始治療后15 d時則降至33%。由此表明,目前的技術還不能充分有效地檢測CTC。為了更好地探索CTC在TNBC中的潛在價值,本研究應用不同于既往研究[14]的方法深入探討CTC的分子特征。

CDH1、EPCAM在從TNBC患者樣本中分離出的CTC中高表達,說明腫瘤細胞起源于上皮細胞。上皮蛋白的活性在腫瘤細胞定植的最后階段尤為重要,此時腫瘤細胞必須增殖,以重建新的腫瘤病灶[15]。TNBC患者CTC中VIM、SNAIL1、TIMP1、CRIPTO1、CD49F、ALDH2、CD44和BCL11A等基因表達,表明存在間充質干細胞標記物,可能有助于腫瘤細胞在血液中的存活。研究[16-17]表明,從上皮到間充質特征的轉變會誘導上皮起源的腫瘤細胞出現干細胞特性,這些中間表型與侵襲性有關。有研究[18]對CTC群體進行表征,發現這些中間表型的出現對腫瘤細胞的存活和定植有顯著影響,與本研究結果一致。在滲入和遷移到血液的過程中,細胞可塑性使得CTC能夠克服缺氧環境,避免凋亡和被免疫細胞識別,在極端惡劣的環境下生存[19]。本研究發現,在轉移性腫瘤患者CTC中,TIMP1、AR和CD49F表達水平更高,這可能與CTC數量增加有關,且這些基因表達水平增高可能與疾病進展有關。本研究結果顯示,表型可塑性更強的EpCAM陽性CTC與腫瘤惡性進展有關,這可為癌癥患者提供有效的預后信息。

綜上所述, CTC計數及分子特征是獲取疾病相關信息的有效途徑,可為建立新的TNBC診斷、監測、預后評估方法提供參考依據,這種基于CTC液體活檢的方法有可能成為探索TNBC擴散機制的重要工具。此外,本研究在TNBC患者CTC中發現了細胞可塑性,這可能與腫瘤的不良預后和高侵襲性有關。