貞蓮明目膠囊治療糖尿病視網膜病變的網絡藥理學機制分析

邊 云, 白海龍, 孟曉峰, 劉 曉, 薛 超, 劉瑞雪,常洪坤, 田風勝, 崔榮崗, 蘇 陽, 劉 梅

(河北省滄州中西醫結合醫院, 1. 糖尿病三科, 2. 治未病中心, 3. 超聲二科, 4. 眼科, 河北 滄州, 061001)

糖尿病視網膜病變是糖尿病常見的微血管并發癥[1]。一項全球薈萃分析[2]報告,近1/3的糖尿病患者被診斷出患有糖尿病視網膜病變, 1/10的糖尿病視網膜病變患者會發展為影響視力的疾病。預防和治療糖尿病視網膜病變主要通過規范使用腸激肽酶、羥苯磺酸鈣等藥物,盡管部分患者視力有所改善,但仍有46%的患者需要激光和(或)手術治療[3]。中醫藥治療糖尿病視網膜病變歷史悠久,積累了豐富的實踐經驗,具有多成分、多靶點、多途徑的優勢。現代藥理學研究[4]發現,中藥可以改善眼底局部的血液循環,促進眼底滲出物的吸收,減少血管瘤的數量,從而起到治療作用。貞蓮明目膠囊[4]由女貞子、墨旱蓮、黃精、決明子、枸杞子、地黃、三七、丹參、白茅根、白術、澤瀉、車前子組成,具有滋補肝腎、涼血止血、活血利水的功效,主治肝腎虧虛夾瘀證,目前臨床上主要用于治療糖尿病或多種眼部疾病。貞蓮明目膠囊可提高糖尿病視網膜病變患者的視力水平,并改善其視網膜血管病變[5]。目前對貞蓮明目膠囊有效成分、作用靶點等藥理機制的研究較少。網絡藥理學以網絡的形式表達藥物成分與其作用靶點之間的關系,通過對網絡節點的分析,獲得中藥復方的主要活性成分和作用靶點,構建藥物-靶點-疾病的網絡關系,可為活性化合物篩選和其機制探索提供新方法。

1 資料與方法

1.1 網絡藥理學及分子對接探討貞蓮名目膠囊的作用機制

1.1.1 主要成分檢索、篩選和作用靶點確定: 通過SymMap(http://symmap.org//)和中國天然產物化學成分庫(http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc/), 分別以貞蓮明目膠囊中女貞子、墨旱蓮、黃精、決明子、枸杞子、地黃、三七、丹參、白茅根、白術、澤瀉、車前子為關鍵詞檢索各味中藥的化學成分。以口服利用度≥30%且類藥性≥10%作為篩選條件,對檢索到的化學成分進行篩選。使用TCMSP數據庫和已發表文獻對篩選出的化學成分對應的靶點進行查詢,并將靶點與Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)進行匹配和規范。

1.1.2 糖尿病視網膜病變相關靶點搜集、篩選和匹配: 通過GeneCards(https://www.genecards.org/), 以糖尿病視網膜病變為關鍵詞檢索相關基因,篩選與糖尿病視網膜病變相關性高的基因靶點。

1.1.3 藥物-有效成分-靶點網絡繪制: 應用R4.0.3軟件對貞蓮明目膠囊和糖尿病視網膜病變的相同靶點進行整合,并結合上述關鍵靶點,依托Cytoscape3.7.0軟件構建中藥-靶點-疾病的網絡信息圖。

1.1.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路和基因本體(GO)功能分析: 利用R4.0.3軟件對所有的關鍵靶點進行KEGG和GO分析,根據P值篩選出前10位的生物過程、細胞組分、分子功能的數據,繪制柱形圖、氣泡圖和信號通路圖。

1.1.5 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及核心靶點篩選: 利用STING(http://sting-db.org/)數據平臺建立PPI網絡圖,將貞蓮明目膠囊和糖尿病視網膜病變共有的關鍵靶點導入,設置最高互作分值為0.9, 去除隱藏的游離節點后共得到153個關鍵靶點,構建PPI圖。

1.1.6 藥物主要活性成分-核心靶點分子對接驗證: 在RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)數據庫檢索和下載潛在靶蛋白的PDB ID, 活性化合物的結構在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺數據庫中以*mol2格式下載。通過AutoDock軟件將化合物配體和蛋白質轉化為"PDBQT"格式,應用SYBYL-X2.0軟件進行模擬分子對接,繪制模擬對接圖像,并計算有效成分與靶蛋白對接的結合能,結合能越低可以認為結合效果越好。

1.2 實驗驗證

1.2.1 藥物: 貞蓮明目膠囊由女貞子、墨旱蓮、黃精、決明子、枸杞子、地黃、三七、丹參、白茅根、白術、澤瀉、車前子組成,鏈脲佐菌素(南京沃博生物科技有限公司,貨號M5721), 羥苯磺酸鈣片組 (南京長澳制藥有限公司,國藥準字H20030087)。

1.2.2 動物: 選取60只SPF級Wistar大鼠, 月齡3個月,體質量為(200±20) g, 由動物中心提供。造模后72 h進行檢測,血糖均不低于16.7 mmol/L, 熒光素血管造影檢查發現眼底新血管形成和微血管熒光素滲出即為造模成功。

1.2.3 動物分組、模型制備、給藥與取樣: 將所購SPF級Wistar大鼠,按照隨機數字表法分為正常組、模型組、羥苯磺酸鈣片組、貞蓮明目膠囊組,每組15只,于實驗室內適應性飼養1周,未見不良反應。參照糖尿病視網膜病動物模型制備規范[6]制備糖尿病視網膜病大鼠模型,除正常組大鼠,其余大鼠均予高糖高脂飲食喂養4周后,腹腔注射鏈脲佐菌素溶液(42 mg/kg), 注射72 h后抽取尾間血進行檢測,血糖均不低于16.7 mmol/L, 熒光素血管造影檢查發現眼底新血管形成和微血管熒光素滲出提示造模成功。造模結束后,正常組和模型組大鼠予0.9%氯化鈉注射液,每次2.0 mL, 每日1次灌胃。羥苯磺酸鈣片組予羥苯磺酸鈣片溶液,參照人和大鼠換算比例制備成0.83 mg/mL溶液,每次2.0 mL, 每日1次灌胃。貞蓮明目膠囊組予貞蓮明目膠囊溶液,濃度0.83 mg/mL, 每次2.0 mL, 每日1次灌胃。所有大鼠均連續灌胃治療4周。最后1次給藥結束后,予3%濃度的戊巴比妥鈉,按照40 mg/kg劑量對大鼠進行麻醉,采用光學相干斷層掃描(OCT)測量視網膜厚度,快速切取各組大鼠視網膜, 4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋切片。同時腹主動脈取血,快速離心后-80 ℃保存。

1.3 觀察指標

大鼠視網膜厚度、視網膜炎癥指標情況: 記錄大鼠視網膜厚度和白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。采用蛋白質印跡法檢測視網膜中蛋白[血管內皮生長因子(VEGF)、核轉錄因子-κB(NF-κB)]表達: 取子宮內膜組織約10 mg, 加入組織裂解液后勻漿, 12 000轉/min離心10 min, 分離上清后進行蛋白質印跡實驗,在聚丙烯酰胺凝膠中分離出不同分子量的蛋白,電轉移至硝酸纖維素膜后,用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后,添加一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜,次日添加二抗1 h后,定量分析蛋白表達水平。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 貞蓮明目膠囊活性成分及其靶點

通過SymMap 數據庫初步提取2 367種化學成分,經過口服利用度和類藥性篩選后獲得三七119種,丹參202種,決明子68種,地黃76種,墨旱蓮48種,女貞子119種,枸杞子188種,澤瀉46種,白術55種,白茅根33種,車前子55種,黃精38種。再將上述化學成分輸入TCMSP數據庫,搜索與之相對應的成分作用靶點,合并以后刪除重復值,共得到有效成分作用靶點248個。貞蓮明目膠囊藥物-有效成分-靶點網絡內重要性前10位的有效成分見圖1、表1。

表1 貞蓮明目膠囊重要性前10位有效成分

2.2 貞蓮明目膠囊治療的核心靶點及蛋白質相互作用關系

通過Drugbank和Uniprot等數據庫檢索,共收集到3 943個糖尿病視網膜病變相關靶點。將貞蓮明目膠囊有效成分靶點和糖尿病視網膜病變相關基因進行匹配后,得到153個貞蓮明目膠囊治療糖尿病視網膜病變的潛在靶點基因,見圖2。

圖2 貞蓮明目膠囊靶基因與糖尿病視網膜病變相關基因的維恩圖

2.3 貞蓮明目膠囊有效成分治療糖尿病視網膜病變核心靶點的KEGG信號通路

KEGG富集分析顯示,胰島素信號通路、MAPK信號通路、黏著斑、神經營養因子信號通路、細胞衰老、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用、細胞周期、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、細胞凋亡、內分泌抵抗與153個核心靶點密切相關,見圖3。

圖3 貞蓮明目膠囊有效成分治療糖尿病視網膜病變核心靶點的KEGG分析氣泡圖

2.4 貞蓮明目膠囊有效成分治療糖尿病視網膜病變核心靶點的GO功能分析

GO功能富集分析包括生物過程、細胞組分、分子功能共3個部分,生物過程分析顯示,蛋白質修飾過程的調控、細胞蛋白質代謝過程的調節、蛋白質代謝過程的調節、分子功能的調節、催化活性的調節、細胞內信號轉導、蛋白質修飾過程的正向調控、蛋白質代謝過程的正向調控、細胞蛋白質代謝過程的正向調控、程序性細胞死亡的調節在貞蓮明目膠囊對糖尿病視網膜病變的治療過程中具有重要作用; 細胞組分分析顯示,胞質溶膠、核質、細胞器腔、膜封閉內腔、核腔、核部分、蛋白質復合物、高分子復合物、膜筏、核染色體在貞蓮明目膠囊對糖尿病視網膜病變的治療過程中具有重要作用; 分子功能分析顯示,酶結合、激酶結合、蛋白激酶結合、轉錄的正調控(依賴于 DNA)、蛋白質復合物結合、ATP結合、腺苷酸核苷酸結合、腺苷酸結合、嘌呤核糖核苷酸結合、嘌呤核苷酸結合酶結合在貞蓮明目膠囊對糖尿病視網膜病變的治療過程中具有重要作用,見圖4。

圖4 貞蓮明目膠囊有效成分治療糖尿病視網膜病變核心靶點的GO功能分析

2.5 PPI網絡構建及核心靶點的篩選

使用Cytoscape對PPI網絡進行拓撲分析,得到包含10個節點的核心網絡,其中白細胞介素-1β(IL1β)、白細胞介素-6(IL6)、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、人表皮生長因子受體(EGFR)、表皮生長因子(EGF)、RACα絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、腫瘤蛋白P53(TP53)、胱天蛋白酶3(CASP3)、環狀素受體1(ESR1)和環加氧酶2(PTGS2)基因是核心靶點,見圖5。

圖5 貞蓮明目膠囊治療糖尿病視網膜病變靶點的核心PPI網絡

2.6 分子對接驗證

由以上分析結果選取貞蓮明目膠囊中藥化合物為槲皮素、油酸、木犀草素、山奈酚和丹參酮ⅡA以及靶點IL-1β、AKT1、TP53、CASP3、EGF進行分子對接,對接總分表明成分靶點結合的穩定性較好,碰撞參數均小于0, 表明小分子配體與蛋白結合的構象穩定,見表2、圖6。

A: 靶蛋白IL-1β的分子結構,綠色部分為IL-1β的三維結構活性口袋; B: 五羥黃酮與IL-1β活性口袋的模擬對接圖像,其中未被綠色覆蓋部分為五羥黃酮分子結構,黃色虛線為五羥黃酮與IL-1β模擬對接的作用點。圖6 貞蓮明目膠囊主要成分與核心靶點的典型分子對接圖

表2 核心靶點與貞蓮明目膠囊主要成分模擬對接參數

表3 各組大鼠視網膜厚度、視網膜炎癥指標情況

2.7 大鼠視網膜厚度、視網膜炎癥指標情況

與正常組比較,模型組大鼠視網膜厚度降低, IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,羥苯磺酸鈣片組大鼠視網膜厚度升高, IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與羥苯磺酸鈣片組比較,貞蓮明目膠囊組大鼠視網膜厚度升高, IL-1β、IL-6、TNF-α降低,差異有統計學意義(P<0.05), 見表3。

2.8 大鼠視網膜中蛋白表達

與正常組比較,模型組大鼠VEGF、NF-κB表達水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,羥苯磺酸鈣片組大鼠VEGF、NF-κB表達水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。與羥苯磺酸鈣片組比較,貞蓮明目膠囊組大鼠VEGF、NF-κB表達水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05), 見表4。

表4 各組大鼠視網膜中VEGF、NF-κB蛋白表達

3 討 論

糖尿病視網膜病變是糖尿病患者的主要并發癥,會導致視力喪失[7-8]。在全球范圍內,有9 500萬例糖尿病患者患有糖尿病視網膜病變,而糖尿病患者數量的增加將導致未來糖尿病視網膜病變患者數量的增加[9]。相關研究[10]發現,患糖尿病20年后,幾乎所有1型糖尿病患者和60%的2型糖尿病患者都發展為糖尿病視網膜病變,已然成為了全球的公共健康問題。調查[11]顯示,經常規西醫治療后,僅有部分患者的視力有所改善,仍有46%的患者需要激光或手術治療。為了實現和控制糖尿病患者視網膜內的血管病變,通常需要多種治療途徑,故本研究結合糖尿病視網膜病變的病因特點,預測貞蓮明目膠囊可能對糖尿病視網膜病變起到一定的治療作用,并基于網絡藥理學,將貞蓮明目膠囊的有效成分和疾病的靶點進行對接,建立藥物-靶點-疾病的網絡關系,最后應用分子對接確定結果的有效程度。

通過對貞蓮明目膠囊的有效化學成分與糖尿病視網膜病變關鍵靶點的網絡藥理學研究發現,貞蓮明目膠囊中153種活性成分作用于糖尿病視網膜病變的關鍵靶點,其中主要成分為丹參酮、槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等, QIAN S H等[12]發現丹參酮可通過提高GLO1水平來改善晚期糖基化終產物誘導的線粒體功能障礙和有絲分裂,可抑制高糖誘導的人視網膜內皮細胞增殖、遷移和血管化。CHAI G R等[13]發現槲皮素可通過誘導HO-1的表達抑制VEGF和sICAM-1的分泌,以達到治療糖尿病視網膜病變的目的。SAFARPOUR S等[14]發現山柰酚可激活肝臟內Akt和GCK活性,通過增強肝臟葡萄糖攝取和代謝來改善葡萄糖穩態,另外還可通過ERK和VASH1信號通路保護視網膜神經節細胞免受高糖損傷,有助于治療糖尿病視網膜病變。AFIFI S M等[15]發現, β-谷甾醇通過激活糖尿病大鼠脂肪組織中的胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白來控制胰島素抵抗和高血糖,同時還通過調節脂肪組織中的炎癥事件來減輕視網膜損傷。從上述研究中可以看出丹參酮、槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇等成分具有抑制糖尿病視網膜病變的作用。

PPI網絡圖分析表明,貞蓮明目膠囊的有效成分主要作用于IL-1β、IL-6、STAT3、EGFR、EGF、AKT1、TP53、CASP3、ESR1和PTGS2多個核心靶點,其中IL-1β、EGF/EGFR/P13K/AKT、IL6/STAT3通路介導的炎癥反應可能是貞蓮明目膠囊治療糖尿病視網膜病變的關鍵靶點。相關研究[16]發現,高血糖會引起線粒體活性氧增加,在活性氧誘導下的白細胞介素刺激細胞黏附分子的表達上調,導致內皮細胞損傷和視網膜內血管病變。另一項研究[17]發現, IL-1β可通過激活PI3K/AKT/NF-κB信號通路使IL-6的表達上調,進一步激活STAT3信號通路,降低緊密連接蛋白occludin、ZO-1的表達,從而降低了視網膜血管內皮的通透性,導致視網膜病變。張金峰等[18]發現,丹參酮可通過抑制IL-1β、IL-6等細胞因子的釋放和AKT、NF-κB等蛋白的表達,從而減輕了炎癥反應對視網膜的損傷。HAN X J等[19]發現槲皮素是細胞中NLRP3炎性體激活的天然抑制劑,可通過抑制NLRP3/IL-1β途徑,減輕促炎因子釋放,起到保護視網膜的作用。另外,相關實驗研究[20-21]發現,山柰酚、β-谷甾醇均可抑制IL-1β、IL6等細胞因子表達,使VEGF水平降低,從而改善視網膜內皮血管的形成和細胞增殖。由上述研究可知, IL-1β、EGF/EGFR/P13K/AKT、IL6/STAT3信號通路可能是貞蓮明目膠囊治療糖尿病視網膜病變的關鍵靶點。

此外, KEGG通路分析發現, TP53信號通路和CASP3信號通路可能是貞蓮明目膠囊治療糖尿病視網膜病變的相關靶點。相關研究[22]發現, TP53信號通路在調節細胞周期方面具有核心作用,其中TP53為關鍵基因,可干擾Bcl-2等促凋亡因子和Bcl-xl等抗凋亡因子的結合,使線粒體內的凋亡相關蛋白釋放,導致視網膜內細胞凋亡。實驗研究[23]發現, TP53還整合了影響胰島素敏感性和肝臟對葡萄糖穩態方面的反調節激素反應的信號通路,對于調節血糖的穩態具有關鍵作用。研究[24]發現, TP53誘導caspase-3活化,激活CASP3觸發凋亡的級聯反應,加速細胞凋亡。米倚林等[25]發現,山奈酚可調節組織內TP53和CASP3蛋白的表達,抑制細胞的凋亡,從而延緩糖尿病視網膜病變的進程。LIU R等[26]發現, β-谷甾醇可調節CASP3基因的表達,抑制視網膜內細胞的凋亡,從而緩解患者癥狀。由上述研究可知, TP53信號通路和CASP3信號通路可能是貞蓮明目膠囊治療糖尿病視網膜病變的相關靶點。

本研究發現, ESR1、PTGS2可能是貞蓮明目膠囊治療糖尿病的潛在靶點。一項回顧性研究[27]發現, ESR1作為轉錄因子,可以調節SLC2A4基因的表達,改變組織GLUT4含量,以控制血糖水平,避免了高血糖對視網膜的損害。另一項研究[28]發現, PTGS2作為一種重要的免疫調節因子,可通過調節NF-κB通路,從而減輕視網膜損害。研究[29-31]發現,丹參酮、槲皮素、β-谷甾醇均可作用于ESR1或PTGS2靶點,以維持血糖穩定,從而避免了高血糖對視網膜的損傷。由上述研究可知, ESR1、PTGS2可能是貞蓮明目膠囊治療糖尿病視網膜病變的潛在靶點。

綜上所述,貞蓮明目膠囊具有滋補肝腎、涼血活血的功效,其對糖尿病視網膜病變的治療或許具有積極作用,其作用機制可能與調節IL-1β、EGF/EGFR/P13K/AKT、IL-6/STAT3、TP53和CASP3信號通路有關。