大豆根際對(duì)羥基苯甲酸降解菌分離及其促生功能研究

王丹丹,孫 麗,于 宏,崔世宇,龐詩(shī)琪,解志紅

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,山東泰安 271000)

大豆是我國(guó)主要的油料作物之一,也是重要的糧食作物,但隨著大豆連續(xù)種植年限的增加及不合理輪作制度,使大豆連作障礙問題成為制約我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)的重要因子[1-2],如何有效緩解大豆連作障礙,提高大豆的產(chǎn)量與品質(zhì),成為我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。連作障礙會(huì)降低大豆對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收能力,影響大豆各個(gè)時(shí)期的正常生長(zhǎng),同時(shí)還會(huì)引起植物病害加重,最終降低大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-5]。大豆連作障礙是植物與土壤2個(gè)系統(tǒng)多個(gè)因素綜合作用引起的,其中一個(gè)重要原因是土壤中自毒物質(zhì)的積累[6-7]。自毒作用是化感作用的一種特殊形式,即作物分泌的化感物質(zhì)在土壤中積累,會(huì)抑制同茬或下茬的同種或同科作物的生長(zhǎng)發(fā)育[8]。酚酸類化感物質(zhì)常被認(rèn)為是根系分泌物中主要的自毒化感物質(zhì)[9-10],大豆根系分泌物中常見的酚酸類自毒化感物質(zhì)有對(duì)羥基苯甲酸、香草酸等[9,11-12],其中對(duì)羥基苯甲酸(p-Hydroxybenzoic acid,PHBA)能影響根系細(xì)胞線粒體正常功能,導(dǎo)致活性氧積累,從而影響植物根系的正常生長(zhǎng)[13-14],也會(huì)造成植物無法正常利用光合作用吸收的能量,影響植株正常生長(zhǎng)[15];對(duì)羥基苯甲酸還會(huì)損傷根系細(xì)胞,破壞根系的完整性,使土傳病原菌更易從植物根系入侵,引起植物病害蔓延[16-17];此外,對(duì)羥基苯甲酸的積累導(dǎo)致連作土壤理化性質(zhì)惡化,不利于作物對(duì)養(yǎng)分的利用[18-19]。

土壤中自毒化感物質(zhì)酚酸的積累是導(dǎo)致連作障礙的一個(gè)重要原因,有效實(shí)現(xiàn)酚酸安全降解進(jìn)而有效緩解連作障礙是大豆產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向。根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指附著于根際土壤顆粒中,對(duì)植物健康生長(zhǎng)發(fā)揮著重要作用的一類根際微生物[20],根際促生菌具有降解自毒化感物質(zhì)、抑制有害植物病原菌生長(zhǎng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增加土壤微生物群落中有益微生物數(shù)量、對(duì)環(huán)境無污染的特點(diǎn),在連作障礙治理中應(yīng)用廣泛[19,21]。在大豆連作障礙土壤中接種有酚酸降解功能的根際促生菌,利用微生物分解連作土壤中累積的自毒化感物質(zhì),有望成為一項(xiàng)健康有效的治理措施。目前,利用選擇培養(yǎng)基從自然環(huán)境中已篩選獲得多種具有對(duì)羥基苯甲酸降解功能的根際促生菌,包括假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[19]、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)[21]、克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)[22]等,這些微生物可以高效降解對(duì)羥基苯甲酸且降解底物多樣,在緩解連作障礙中具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[23]。利用根際促生菌治理大豆連作障礙可持續(xù)性強(qiáng)且對(duì)生態(tài)環(huán)境友好,而尋找有效的可以使用的多功能根際促生菌是生物治理實(shí)施的前提,因此,該研究從連作5年的大豆根際土壤中以對(duì)羥基苯甲酸為唯一碳源篩選降解菌株,并測(cè)定其對(duì)大豆發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響,為生物治理大豆連作障礙提供可利用根際促生菌菌株。

1 材料與方法

1.1 供試土壤樣品取自吉林省延邊朝鮮族自治州5年連續(xù)大豆種植地,將大豆植株根部挖出,抖落大塊附著土,根系1 cm內(nèi)的根際土收集后置于4 ℃保存運(yùn)輸。

1.2 培養(yǎng)基、主要試劑和儀器LB培養(yǎng)基(蛋白胨 10 g/L,酵母粉 5 g/L,NaCl 10 g/L)、無機(jī)鹽培養(yǎng)基(KH2PO42 g/L,Na2HPO41.3 g/L,(NH4)2SO42 g/L,NaCl 5 g/L,葡萄糖1 g/L)。基因組提取試劑盒,購(gòu)自Axygen生物技術(shù)(杭州)有限公司;16S擴(kuò)增引物,購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)(大連)有限公司;高保真聚合酶Primes STAR HS DNA polymerase,購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)(大連)有限公司。

1.3 對(duì)羥基苯甲酸高效降解菌的分離從連續(xù)種植5年的大豆耕地中選取長(zhǎng)勢(shì)較好的植株,采集根際土壤,按1%質(zhì)量體積比將土壤接種于1 g/L對(duì)羥基苯甲酸的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,35 ℃搖床180 r/min,使能夠降解對(duì)羥基苯甲酸的菌株得到富集。土壤懸液在搖床中培養(yǎng)10 d后稀釋涂布于LB培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落劃線于LB固體培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)12 h后觀察菌落特征,若培養(yǎng)特征完全一致則為同一種菌,否則需多次劃線反復(fù)純化直至菌落特征一致。

1.4 高效降解菌株篩選及其耐受性測(cè)定為獲得高效降解菌株,將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)羥基苯甲酸濃度提高至5 g/L。將-80 ℃甘油管菌種于LB固體培養(yǎng)基上活化,35 ℃培養(yǎng)12 h,挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中,35 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h即為種子液。種子液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至新LB液體培養(yǎng)基中,35 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5,取1 mL菌液加至49 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)液中,35 ℃、180 r/min培養(yǎng)觀察菌株是否可以生長(zhǎng)。

將篩選到的高效降解菌株再接種到對(duì)羥基苯甲酸濃度為10、15、20、25、30 g/L無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,35 ℃、180 r/min培養(yǎng)觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.5 自毒物質(zhì)降解率測(cè)定高效降解菌株菌液(培養(yǎng)方法見“1.3”)接種至49 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)液中(對(duì)照加入1 mL無菌水),培養(yǎng)液中以不同酚酸自毒物質(zhì)為唯一碳源,濃度為5 g/L,35 ℃搖床培養(yǎng)72 h,8 000 r/min離心10 min,采用紫外可見分光光度法,取上清液測(cè)定對(duì)應(yīng)自毒物質(zhì)的最大吸收峰波長(zhǎng)的吸光度,并計(jì)算降解率。各物質(zhì)的測(cè)定吸收波長(zhǎng)分別為對(duì)羥基苯甲酸246 nm、苯甲酸230 nm、香草酸250 nm。降解率=(對(duì)照吸光度-處理后樣品吸光度)/對(duì)照吸光度×100%。

1.6 根際促生菌菌株鑒定提取根際促生菌基因組DNA,擴(kuò)增16S rRNA序列片段,擴(kuò)增引物為27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)、1429R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。

電泳檢測(cè)產(chǎn)物片段后送至測(cè)序公司測(cè)序,16S rRNA序列片段在EZBioCloud網(wǎng)站上進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析。

1.7 根際促生菌促生能力測(cè)定固氮能力測(cè)定采用Ashby無氮固體培養(yǎng)基,將目標(biāo)根際促生菌接種于Ashby無氮固體培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)7 d,記錄菌株的長(zhǎng)勢(shì)。

解磷能力測(cè)定采用無機(jī)磷固體培養(yǎng)基和卵黃固體培養(yǎng)基,將目標(biāo)根際促生菌分別接種于無機(jī)磷固體培養(yǎng)基和卵黃固體培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)3 d,觀察是否有溶磷圈出現(xiàn)。

IAA合生能力測(cè)定采用Salkowski法,將目標(biāo)根際促生菌接種于含L-色氨酸(200 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中,35 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)4 d,菌液于4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min,取上清液于酶標(biāo)板中,加入等體積Salkowski比色液,黑暗條件下靜置反應(yīng)30 min后,迅速于530 nm下測(cè)定吸光度。

1.8 種子發(fā)芽試驗(yàn)根際促生菌促進(jìn)種子萌發(fā)試驗(yàn)以大豆為試驗(yàn)對(duì)象,大豆浸泡于70%乙醇10 min后用無菌水清洗3遍完成消毒。CK為空白對(duì)照,消毒后的大豆種子置于含無菌水的培養(yǎng)皿中;處理T1為消毒后的種子置于根際促生菌菌液中(細(xì)菌在OD600為0.5時(shí)離心收集菌體,菌體用無菌水清洗3次后重懸,接種量為1%)。每個(gè)處理10粒種子,設(shè)置5次重復(fù)。

1.9 盆栽試驗(yàn)盆栽土壤取自吉林省延吉市5年連續(xù)大豆種植地塊,121 ℃滅菌20 min,重復(fù)滅菌2次后自然風(fēng)干,土壤、蛭石、珍珠巖按3∶1∶1體積比混勻,拌入無菌MS營(yíng)養(yǎng)液到達(dá)濕潤(rùn)狀態(tài),分裝至盆栽盆中,每杯約200 g。大豆種子70%乙醇浸泡10 min,無菌水清洗3遍后在無菌水中浸泡12 h,放入培養(yǎng)基質(zhì)中。CK為空白對(duì)照,消毒后的大豆種子置于固體基質(zhì)中;處理T1則加入根際促生菌菌液,將活化好的菌株菌液統(tǒng)一調(diào)節(jié) OD600為0.5,每杯加入500 μL菌液,每組重復(fù)5次。培養(yǎng)30 d后小心從培養(yǎng)基質(zhì)中取出完整的大豆植株,將根部沖洗干凈后測(cè)量植株的根長(zhǎng)、苗高、鮮重、干重。

1.10 數(shù)據(jù)處理及分析利用Microsoft Excel和Origin 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)羥基苯甲酸高效降解菌的篩選以對(duì)羥基苯甲酸為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基,在大豆根際土壤中共計(jì)分離得到42株可降解利用對(duì)羥基苯甲酸的根際促生菌株。將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)羥基苯甲酸的濃度提高至5 g/L,獲得6株在高濃度對(duì)羥基苯甲酸培養(yǎng)基中可正常生長(zhǎng)的根際微生物,分別為PA08、PA11、PA14、PA17、PA18、PA40。通過提高無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)羥基苯甲酸濃度,探究所篩6株根際促生菌對(duì)對(duì)羥基苯甲酸耐受性,試驗(yàn)結(jié)果表明,PA18和PA40對(duì)對(duì)羥基苯甲酸的最大耐受濃度為15 g/L,PA11、PA14的最大耐受濃度為20 g/L,PA08、PA17的最大耐受濃度為25 g/L。

2.2 高效降解菌降解底物多樣性的測(cè)定利用底物廣譜試驗(yàn)探究所篩的6株根際促生菌對(duì)3種大豆常見的酚酸類自毒化感物質(zhì)(對(duì)羥基苯甲酸、苯甲酸、香草酸)的降解效果,試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,6株高效降解菌對(duì)3種酚酸都有降解能力,其中PA08、PA11、PA17對(duì)對(duì)羥基苯甲酸、苯甲酸、香草酸的降解效率均超過50%。

圖1 6株根際促生菌酚酸降解率Fig.1 The degradation rates of phenolic acids by 6 plant growth-promoting rhizobacteria

2.3 酚酸高效降解菌的鑒定對(duì)分離篩選得到的6株高效降解菌株的16S rRNA基因序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)完成分子生物學(xué)鑒定,其結(jié)果如表1所示。從表1可以看到,6株高效降解菌株與其相似菌的相似度均超過99%,分別為無色桿菌PA08 (AchromobactermucicolensPA08)、布魯氏桿菌PA11 (BrucellaciceriPA11)、假單胞菌PA14 (PseudomonasalloputidaPA14)、假單胞菌PA17 (PseudomonashunanensisPA17)、布魯氏桿菌PA18 (BrucellaciceriPA18)、無色桿菌PA40 (AchromobactermucicolensPA40)。

表1 菌株的分類

2.4PseudomonashunanensisPA17促生特性分析高效降解菌AchromobactermucicolensPA08、BrucellaciceriPA11、PseudomonashunanensisPA17對(duì)大豆常見3種酚酸類自毒化感物質(zhì)降解率均超過50%,但無色桿菌根據(jù)NY/T1109菌株生物安全標(biāo)準(zhǔn)為生物安全三級(jí),而布魯氏桿菌安全未分類,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中仍需要進(jìn)一步進(jìn)行致病性分析,因此選取PseudomonashunanensisPA17進(jìn)行促生特征分析。

定量檢測(cè)PseudomonashunanensisPA17的產(chǎn)IAA能力,結(jié)果如圖2A所示,PA17在含L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后,與Salkowski比色液反應(yīng)后呈現(xiàn)粉紅色,表明PA17可以合成植物激素IAA,合成量可以達(dá)到(8.65±0.26) mg/L。定性檢測(cè)PseudomonashunanensisPA17固氮及解磷能力,PA17在Ashby無氮固體培養(yǎng)基上可正常生長(zhǎng)(圖2B),并且在無機(jī)磷(圖2C)和有機(jī)磷(圖2D)固體培養(yǎng)基上有明顯解磷圈,表明PA17具有固氮和解磷能力。

注:A.IAA合成能力;B.固氮能力;C.解無機(jī)磷能力;D.解有機(jī)磷能力。Note:A.IAA production.B.Nitrogen fixation.C.Inorganic phosphorus solution.D.Organic phosphorus solution.圖2 Pseudomonas hunanensis PA17促生特征分析Fig.2 Promoting growth feature test of Pseudomonas hunanensis PA17

2.5PseudomonashunanensisPA17對(duì)大豆種子的促生作用測(cè)定大豆種子在不同處理下發(fā)芽率,結(jié)果表明,置于PseudomonashunanensisPA17菌液中的大豆種子發(fā)芽率(100%)明顯高于CK(80%),此外,PA17明顯促進(jìn)大豆胚根的生長(zhǎng)(圖3)。

圖3 Pseudomonas hunanensis PA17對(duì)大豆胚根生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of strain Pseudomonas hunanensis PA17 on root development of soybean

2.6PseudomonashunanensisPA17對(duì)大豆幼苗生長(zhǎng)的影響幼苗盆栽試驗(yàn)結(jié)果如圖4和表2所示,盆栽基質(zhì)中添加根際促生菌PseudomonashunanensisPA17對(duì)大豆幼苗的鮮重、干重、株高、根長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用,相比于CK,PA17處理后鮮重增加11.20%,干重增加6.92%,地上部分苗高增加14.62%,地下部分根長(zhǎng)增加25.27%。

表2 Pseudomonas hunanensis PA17對(duì)大豆幼苗生長(zhǎng)的影響

圖4 大豆盆栽試驗(yàn)Fig.4 Soybean pot experiment

3 討論

對(duì)羥基苯甲酸是大豆連作障礙土壤中積累的主要自毒化感物質(zhì)之一,對(duì)植物多方面造成威脅,嚴(yán)重影響大豆植株的健康生長(zhǎng)。該研究從大豆連作根際土壤中篩選獲得多株對(duì)羥基苯甲酸高效降解根際促生菌,其中假單胞菌PA17 (PseudomonashunanensisPA17)不僅耐受性強(qiáng)且降解底物多樣,對(duì)對(duì)羥基苯甲酸、苯甲酸、香草酸的降解效率均已超過50%;發(fā)芽及盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,PA17可顯著促進(jìn)種子發(fā)芽、胚根及幼苗生長(zhǎng),具有較好的應(yīng)用前景。

隨著國(guó)家大豆產(chǎn)業(yè)振興計(jì)劃的實(shí)施,大豆種植面積逐步增加,如何實(shí)現(xiàn)減少農(nóng)藥化肥施用,有效緩解連作障礙,提高大豆產(chǎn)量和質(zhì)量是產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向。根際微生物在根表[24]或根內(nèi)[25]定殖,通過多種途徑直接或間接促進(jìn)植物健康生長(zhǎng),如降解自毒化感物質(zhì)[10],合成多種活性物質(zhì)有效抑制植物病原菌生長(zhǎng)[26],提高土壤中可利用養(yǎng)分的含量[27],產(chǎn)生植物類激素[28]。該研究中分離純化到的大豆根際促生菌可有效降解自毒化感物質(zhì),并且盆栽試驗(yàn)明顯證明其可促進(jìn)大豆幼苗生長(zhǎng),同時(shí)選取了4株常見的植物病原真菌與一株植物病原細(xì)菌進(jìn)行了植物病原菌拮抗試驗(yàn),但結(jié)果顯示該研究分離到的根際促生菌均沒有拮抗植物病原菌能力,因此,該研究后續(xù)將針對(duì)植物病原菌拮抗能力篩選根際促生菌,將多種根際促生菌配合使用,獲得多功能復(fù)合菌劑,并驗(yàn)證其對(duì)大豆及其他作物連作障礙緩解能力,如花生、黃瓜、番茄等,擴(kuò)大復(fù)合菌劑應(yīng)用范圍。

4 結(jié)論

該研究針對(duì)大豆連作土壤中自毒化感物質(zhì)降解菌,利用對(duì)羥基苯甲酸為唯一碳源,篩選具有對(duì)羥基苯甲酸降解及利用能力的根際促生菌,其中假單胞菌PA17不僅降解能力強(qiáng)且降解底物多樣;促生試驗(yàn)表明,PA17具有吲哚乙酸合成能力、固氮能力,同時(shí)具有解有機(jī)磷及無機(jī)磷的能力;發(fā)芽試驗(yàn)證明PA17可促進(jìn)大豆種子的萌發(fā),并可顯著促進(jìn)大豆胚根的發(fā)育;盆栽試驗(yàn)表明PA17也可明顯促進(jìn)大豆幼苗的生長(zhǎng),具有較好的應(yīng)用前景。