鄭州市寵物貓源病原菌毒力基因檢測及其耐藥性分析

韓榮嘉,彭祖焜,劉建華,苑 麗,梁夢菊,潘玉善,賀丹丹,吳 華

河南農業大學動物醫學院,河南鄭州 450046)

近年來世界各地動物源致病菌耐藥現象十分嚴重,有關寵物源病原菌的耐藥性報道亦越來越多。致病性耐藥菌株的出現不僅增加了貓臨床病原菌感染的治療難度,而且極易導致寵物與寵物主之間多重耐藥菌的橫向傳播,造成新的公共衛生安全問題。了解本地區貓源病原菌毒力基因的攜帶情況及其對常用抗生素及抗菌藥的耐藥情況對于制定合理的臨床抗菌治療方案,減緩人醫、獸醫致病性耐藥菌株的橫向傳播具有重要意義。

研究表明,對寵物健康造成主要威脅的是致病性強且耐多種藥物的病原菌,主要有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和中間型葡萄球菌(MRSP),產超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)大腸桿菌、其他腸道菌群,比如產碳青霉烯酶的大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌[1]和沙門氏菌[2]。陳霞等[3]發現從北京市伴侶動物中分離的腸球菌多重耐藥情況嚴重,郭菲等[4]研究發現烏魯木齊市寵物源大腸桿菌和沙門氏菌對所檢抗生素的耐藥率在90%以上,可見寵物源病原菌的耐藥現象非常普遍。筆者在2021年7—8月收集寵物貓源拭子,對其進行分離鑒定、致病性及耐藥性、耐藥表型分析,旨在了解寵物臨床病原菌的致病性、耐藥性,以防止致病性菌株感染人類以及多重耐藥菌株的橫向傳播。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品來源。試驗樣品于2021年7—8月在河南農業大學教學動物醫院和派德寵物醫院采集,采集住院貓鼻拭子、咽拭子和肛拭子共62份。

1.1.2主要試劑、藥品及儀器。主要試劑:TaqMix酶、BM2000 DNA Marker、50×TAE、1× TE緩沖液、瓊脂糖、熒光染料溴化乙錠;麥康凱瓊脂、LB瓊脂、Baird-Parker培養基、腸球菌瓊脂、BHI瓊脂、SS瓊脂、MH(B)肉湯、LB肉湯。主要藥品:頭孢噻呋(ceftiofur,CEF)、頭孢喹肟(cefquinoxime,CFQ)、多西環素(doxycycline,DOX)、替加環素(tigecycline,TGC)、氟苯尼考(florfenicol,FFC)、慶大霉素(gentamicin,GEN)、阿米卡星(amikacin,AMK)、泰樂菌素(tylosin,TYL)、阿奇霉素(azithromycin,AZM)、替米考星(tilmicosin,TIL)、恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)、氧氟沙星(ofloxacin,OFX)、黏菌素(colistin,COL)。以上試劑均購自天馳生物公司;藥品一部分購自天馳生物公司,一部分來自筆者所在實驗室。主要儀器:超凈工作臺(型號SW-CJ-2FD,購自蘇州安泰技術有限公司)、恒溫生化培養箱(型號ZQTY-70V,購自賽默飛世爾科技有限公司)、電子分析天平(型號AB204-N,購自北京銳志漢興科技有限公司)、紫外/可見分光光度計(型號UV1800PC,購自上海元析儀器有限公司)、離心機(型號5418YQ313640,購自德國Eppendorf公司)、PCR儀(型號ETC811,蘇州東盛興業科學儀器有限公司)、全自動凝膠成像分析系統(型號Genius3,英國Syngene公司)。

1.2 方法

1.2.1寵物貓源病原菌的分離、純化與鑒定。無菌拭子樣本通過肉湯培養,菌液分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養基、SS瓊脂培養基、腸球菌瓊脂培養基和Baird-Parker培養基上,過夜培養后挑取單菌落分離純化3代以上,直至培養基上呈現單一菌落時再進行革蘭氏染色鏡檢及16S rRNA鑒定。

1.2.2毒力基因PCR檢測。根據參考文獻[5-8]選擇不同菌株目的毒力基因及引物序列(表1～4),引物由擎科生物公司合成。

表1 大腸桿菌毒力基因 PCR 引物序列

表2 腸球菌毒力基因PCR引物序列

表3 葡萄球菌毒力基因 PCR 引物序列

表4 沙門氏菌毒力基因PCR引物序列

1.2.3藥物敏感性試驗。依據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測定13種抗生素或抗菌藥的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC);依據CLSI[9]、VET01S[10]推薦標準進行藥物敏感性、耐藥性結果判定,頭孢喹肟(CFQ)耐藥折點參考文獻[11]。

1.2.4黏菌素耐藥基因檢測。質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1是引起黏菌素耐藥的主要原因之一[12]。該試驗中3株沙門氏菌均對黏菌素耐藥。為探究其耐藥性是否因mcr-1所致,故對其進行mcr-1檢測。依據筆者所在實驗室設計的黏菌素耐藥基因mcr-1核苷酸序列合成引物,引物序列F為5′-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3′ ,R為5′-CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3′,擴增產物長度為320 bp。PCR反應體系、擴增程序和產物凝膠電泳、測序同“1.2.2”。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離鑒定結果病料樣本經分離、純化、革蘭氏染色鏡檢,疑似有大腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌、沙門氏菌4種細菌。經16S rRNA 通用引物擴增、凝膠電泳檢測,產物送交擎科生物公司測序,測序結果進行Blast比對(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov),鑒定菌株與對應標準菌株的16S rRNA序列同源性均大于99%。從62份貓拭子樣品中分離獲得大腸桿菌16株,分離率為76.19%(16/21);獲得沙門氏菌3株,分離率為14.29%(3/21);獲得腸球菌14株,分離率為66.67%(14/21);獲得葡萄球菌8株,分離率為38.10%(8/21)。

2.2 毒力基因檢測結果

2.2.1大腸桿菌毒力基因檢測。16株大腸桿菌全部檢測到目的毒力基因,主要集中在5種毒力基因OmpA、fyuA、iucD、iss和hlyF,16株(100%)攜帶OmpA基因,12株(75.00%)攜帶fyuA基因,1株(6.25%)攜帶iucD、iss和hlyF基因,所有菌株均未檢測到irp2、astA和papC基因。大腸桿菌毒力基因PCR擴增結果如圖1所示。

2.2.2腸球菌毒力基因檢測。14株腸球菌經PCR擴增、產物測序比對,結果發現11株檢測到毒力基因,主要集中在4種毒力基因efaA、gelE、cylA和esp。其中,11株(78.57%)攜帶efaA基因,9株(64.29%)攜帶gelE基因,3株(21.43%)攜帶cylA和esp基因;所有菌株均未檢測到ace和AS基因,3株腸球菌未檢測到任何一種目的毒力基因。腸球菌毒力基因PCR擴增結果如圖2所示。

注:a.腸球菌efaA毒力基因PCR擴增結果;b.腸球菌gelE毒力基因PCR擴增結果;c.腸球菌cylA毒力基因PCR擴增結果;d.腸球菌esp毒力基因PCR擴增結果;1～14.PCR產物;15.陰性對照;M.BM2000 DNA Marker。Note:a.PCR amplification results of efaA virulence gene of Enterococcus; b.PCR amplification results of gelE virulence gene of Enterococcus; c.PCR amplification results of cylA virulence gene of Enterococcus; d.PCR amplification results of esp virulence gene of Enterococcus;1-14,PCR products;15,negative control;M.BM2000 DNA Marker.圖2 腸球菌毒力基因PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of virulence genes of Enterococcus

2.2.3葡萄球菌毒力基因檢測。8株葡萄球菌經PCR擴增、凝膠電泳分析,均未檢測到篩選的目的毒力基因。

2.2.4沙門氏菌毒力基因檢測。3株沙門氏菌經PCR擴增、產物測序,結果顯示2株沙門氏菌檢測到毒力基因,攜帶fliC、gipA和mgtC基因,而未檢測到spoE、spvB、spvR和sseL基因;另1株沙門氏菌未檢測到目的毒力基因。沙門氏菌毒力基因PCR擴增結果如圖3所示。

注:a.沙門氏菌fliC毒力基因PCR擴增結果;b.沙門氏菌gipA毒力基因PCR擴增結果;c.沙門氏菌mgtC毒力基因PCR擴增結果;1～3,PCR產物;4,陰性對照;M.BM2000 DNA Marker。Note:a.PCR amplification results of fliC virulence genes of Salmonella isolates;b.PCR amplification results of gipA virulence genes of Salmonella;c.PCR amplification results of mgtC virulence genes of Salmonella;1-3,PCR products; 4,negative control; M.BM2000 DNA Marker.圖3 沙門氏菌毒力基因PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification results of virulence genes of Salmonella

2.3 藥物敏感性試驗結果與耐藥性分析大腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌對13種抗生素及抗菌藥的藥物敏感性試驗結果見表5。由表5可知,大腸桿菌對CEF、CFQ、DOX和FFC的耐藥率較高,其對CEF、CFQ和DOX的耐藥率均為43.75%(7/16),對FFC的耐藥率為62.50%(10/16),對GEN、AMK、ENR、OFX的耐藥率分別為31.25%(5/16)、18.75%(3/16)、6.25%(1/16)和6.25%(1/16),而對TGC、AZM和COL敏感。14株腸球菌對CEF、TIL的耐藥率較高,耐藥率分別為92.86%(13/14)和57.14%(8/14),對DOX、TGC、FFC、GEN、ENR、OFX的耐藥率分別為35.71%(5/14)、28.57%(4/14)、7.14%(1/14)、21.40%(3/14)、28.57%(4/14)和14.29%(2/14)。8株葡萄球菌對CEF、CFQ、DOX、GEN和AMK的耐藥率較高,耐藥率分別為87.50%(7/8)、100%(8/8)、87.50%(7/8)、100%(8/8)和100%(8/8),而對其他抗菌藥物的耐藥率介于12.50%～62.50%。

表5 大腸桿菌、腸球菌和葡萄球菌對13種抗菌藥物的耐藥率

3株沙門氏菌對11種抗生素及抗菌藥的藥物敏感性試驗結果見表6。對于β-內酰胺抗生素CEF,2株沙門氏菌表現敏感、1株沙門氏菌表現耐藥;對于CFQ,2株沙門氏菌耐藥,1株沙門氏菌表現敏感。CFQ作為動物專用β-內酰胺類抗生素,被批準用于臨床的時間不長,在寵物臨床出現耐藥性屬于該地區首次報告,其耐藥機制與原因值得進一步研究。對于四環素類抗生素DOX,3株寵物貓源沙門氏菌均表現耐藥,這與食品源動物臨床上DOX的耐藥性報告結果[13-14]類似。這是由于獸醫臨床長期使用DOX作為廣譜抗生素用于抗感染治療所致。對于新型四環素類藥物TGC,2株沙門氏菌表現敏感,另1株表現耐藥。宿主貓并未使用TGC治療,這可能是由于TGC耐藥機制水平傳播所致,其具體原因有待深入探討與研究。3株沙門氏菌對于獸醫專用酰胺醇類抗生素FFC的耐藥性,2株耐藥、1株中介,且2株沙門氏菌呈高水平耐藥(MIC值≥256 μg/mL,高于折點MIC值16倍),這與FFC長期應用于獸醫臨床有關。對于氨基糖苷類抗生素AMK,1株沙門氏菌敏感、1株沙門氏菌耐藥、1株沙門氏菌中介;對于GEN, 3株沙門氏菌均表現耐藥。對于寵物貓源沙門氏菌,GEN主要用于檢測高水平耐藥,不用于臨床抗菌活性評價[9]。該研究中GEN對3株貓源沙門氏菌的MIC值均大于等于64 μg/mL,表現出對氨基糖苷類抗生素的高水平耐藥性(MIC>32 μg/mL)。對于大環內酰類抗生素AZM,2株沙門氏菌敏感、1株沙門氏菌耐藥;對氟喹諾酮類ENR、OFX均表現為2株中介、1株耐藥。對于多肽類抗生素COL,3株沙門氏菌全部表現耐藥(MIC≥32 μg/mL)。

表6 沙門氏菌藥敏試驗結果

2.4 黏菌素mcr-1耐藥基因檢測結果對3株沙門氏菌的耐藥基因檢測結果如圖4所示。2株沙門氏菌S18和S21含有mcr-1耐藥基因;另外1株沙門氏菌S45對COL耐藥,但未檢測到mcr-1基因,懷疑有其他耐藥機制導致其對COL耐藥,其耐藥機制需要深入研究。

注:1～3.PCR產物;4.陽性對照;5.陰性對照;M.BM2000 DNA Marker。Note:1-3.PCR products;4.Positive control;5.Negative control;M.BM2000 DNA Marker.圖4 沙門氏菌mcr-1基因PCR擴增結果Fig.4 PCR amplification results of mcr-1 genes of Salmonella

3 討論

3.1 菌株分離與鑒定Li等[15]研究表明,大腸桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、假單孢菌屬和腸球菌屬均是貓體內易分離得到的主要病原菌。該試驗選擇性地分離了大腸桿菌、葡萄球菌、腸球菌、沙門氏菌,大腸桿菌和腸球菌的分離率均較高,高于佟盼盼等[16](66.3%)和郭澤宇等[17](35.5%)的報道。該研究中葡萄球菌的檢出率(38.10%)與Li等[15]的檢出率(30%)相差不大。4種貓源病原菌中沙門氏菌的檢出率最低(14.29%),可能受所采集寵物貓的健康狀況、樣本數量以及地區不同的影響。但是,該試驗中沙門氏菌的檢出率明顯高于其他地區檢測結果,如Wei等[18]報道貓源沙門菌的檢出率為1.77%;Aeh等[19]調查發現289份貓糞便樣品中沙門氏菌的檢出率僅1.9%。Elnageh等[20]調查發現利比亞貓源沙門氏菌的分離率為23%(24/103),其中大多數為健康貓。以上結果表明全世界范圍內不同地區的報道有所差異,也反映了沙門氏菌在伴侶動物貓群體中的高定殖狀態。

肺炎克雷伯菌也屬于人、獸易共同感染的主要病原菌,極易造成寵物主人感染且通過寵物犬、貓等橫向傳播。該試驗嘗試分離貓源肺炎克雷伯菌,但因寵物貓應激比較強,試驗采集的咽拭子和鼻拭子樣品數量較少,而肺炎克雷伯菌多存在于呼吸道及黏膜上,因此未成功分離到肺炎克雷伯菌。

3.2 毒力基因攜帶情況大腸桿菌主要致病性毒力基因有負責編碼穩定細胞外膜結構的外膜蛋白毒力基因OmpA、血清蛋白編碼毒力基因iss、影響外膜囊泡活性的毒力基因hlyF[5]、編碼鐵耶爾森菌素攝取受體的毒力基因fyuA、負責需氧桿菌鐵載體合成的毒力基因iucD、參與鐵載體耶爾森菌素生物合成的毒力基因irp2等[21]。該研究中所有大腸桿菌均檢測到OmpA基因;fyuA基因的檢出率也較高(75.00%),高于成都地區犬源大腸桿菌的檢出率(17.31%)[22]。該研究中僅少數大腸桿菌菌株攜帶iucD以及iss、hlyF基因。彭嚴嚴等[5]報道安徽滁州地區9株鵝源致病性大腸桿菌OmpA、iss、hlyF、iucD基因陽性率分別為100%、100%、100%和88.9%,其中OmpA的檢出率與該試驗結果相同,iss、hlyF、iucD的檢出率要遠高于該試驗結果(6.25%),說明iss、hlyF、iucD的檢出率與致病性有著很強的關聯性。Dec等[23]研究結果顯示寵物源爬行動物大腸桿菌astA的檢出率為3.13%(1/32),與該試驗astA的檢出結果(0)相近,這可能與物種差異有關。張海龍等[24]對河北部分地區致病性大腸桿菌中也未檢出黏附素毒力基因papC,與該試驗結果相一致。

該研究中葡萄球菌毒力基因選擇生物膜形成相關毒力基因icaA、icaD和clfA,殺白細胞素編碼基因lukS,耐熱核酸酶Nuc以及剝脫毒素expB,但均未檢出。De Almeida等[27]從患乳房炎奶牛中分離的金黃色葡萄球菌中也未檢出icaA和icaD,這2種基因的檢出可能與地區差異有關。施永超[8]從患膿皮癥犬分離的葡萄球菌中檢出expB的陽性率為38.8%,國外有研究人員[21]認為expB在狗的皮膚感染性疾病中扮演著重要角色。該研究中貓未患過皮膚感染性疾病。lukS在偽中間葡萄球菌中有94%的高檢出率[8],與clfA、Nuc一樣,這是因為葡萄球菌菌種是影響這3種毒力基因檢出率的重要原因。另外,樣本的分離數量、是否來自患病貓也可能是毒力基因檢出率為0的原因。關于是否存在其他毒力基因則有待進一步深入研究,才能進行致病性判定。

沙門氏菌毒力相關基因主要分布在毒力島與毒力質粒上,其對菌體的致病性具有決定性作用,毒力基因通過編碼蛋白侵襲宿主產生致病性。該研究中沙門氏菌S18和S21檢出fliC、gipA和mgtC毒力基因,而其他毒力島基因和毒力質粒基因未檢測到,這可能與宿主自身、遺傳和環境因素有關。楊文文等[6]報道山東地區25株雞源致病性沙門氏菌的fliC、gipA基因陽性率分別為36%和32%。任士飛等[28]研究發現鴨源沙門氏菌中mgtC毒力基因的攜帶率為100%。以上研究結果表明fliC、gipA和mgtC是沙門氏菌中較為流行的毒力基因。曹恬雪等[29]報道毒力質粒基因只存在于特定血清型的沙門氏菌中,比如腸炎沙門氏菌。然而,血清型是致病性的主要影響因素,毒力島、菌毛和毒素等也是沙門氏菌致病性的關鍵[30]。

3.3 耐藥性分析該研究中寵物貓源病原菌對被檢13種抗生素或抗菌藥存在不同程度的耐藥性及多重耐藥性。多藥耐藥集中在4～8耐,耐藥譜型多樣化。16株大腸桿菌對β-內酰胺類抗生素CEF、CFQ,四環素類DOX及FFC、GEN、AMK的耐藥率為18.75%～62.50%,貓源大腸桿菌對慶大霉素的耐藥率(31.25%)低于 Rzewuska等[31]報道的犬貓源大腸桿菌耐藥率(68.1%)。Saputra等[32]研究發現澳大利亞貓源大腸桿菌對頭孢類抗生素類藥物的耐藥率低于10%,該研究中大腸桿菌對頭孢類藥物的耐藥率較高(43.75%),這與該類藥物在河南鄭州地區寵物臨床上長期應用有關。近年來已有報道發現犬源大腸桿菌對ENR的耐藥率達到55.9%[33],該研究中OFX和ENR的耐藥率較低(均為6.25%),表明該地區貓源大腸桿菌對此類藥物出現耐藥性,但耐藥性并未普遍發生,臨床抗感染治療時仍可推薦使用。值得注意的是,該研究未發現貓源大腸桿菌對TGC、AZM和COL具有耐藥性,可推薦使用AZM,但TGC作為抗感染及抗多重耐藥菌的新型抗生素,應盡量避免選用此類藥物而優先選用耐藥率較低的其他常規抗生素或抗菌藥;因為COL具有較強的腎毒性,雖然其對貓源病原菌具有較強的敏感性,但不建議體內用作抗感染治療藥物,可作為外用或局部使用抗感染藥物。

該研究中14株腸球菌也表現出不同程度的耐藥性,CEF的耐藥率達到92.86%,這與腸球菌對β-內酰胺類藥物的固有耐藥性有關[34]。我國18個省份豬源腸球菌已對TGC產生耐藥性[35],該研究中貓源腸球菌對TGC已經表現出較高的耐藥性,分析認為這是人醫臨床的橫向傳播所致。該研究中腸球菌對ENR的耐藥率(28.57%)高于宋超慧等[36]報道的耐藥率(12.5%),該研究中腸球菌對FFC的耐藥率(7.14%)與銀川地區犬源腸球菌的耐藥率(8%)[37]相差不大,因此臨床治療因腸球菌引起的感染性疾病可考慮選用FFC。

該研究中8株寵物貓源葡萄球菌對被檢13種抗菌藥物的耐藥情況嚴重,其對CEF的耐藥率為87.50%,高于軒慧勇等[38]報道的寵物犬源葡萄球菌耐藥率;該研究中葡萄球菌對FFC(25.00%)和ENR(25.00%)的耐藥率明顯低于軒慧勇等[38]報道結果(82.9%、64%),表明該耐藥性具有地區差異性,疑似與該地區貓臨床用藥習慣有關。該研究中葡萄球菌對TYL的耐藥率(62.50%)高于明楊等[39]報道結果(43.75%)。該試驗分離的葡萄球菌多來自健康貓,且近期未使用抗生素用于抗感染治療,可能是寵物貓和主人與其他動物和環境接觸從而導致耐藥菌的橫向傳播所致。

該研究中3株沙門氏菌的耐藥性和多重耐藥性也較為明顯,分別達到7耐、4耐和8耐。對抗革蘭氏陰性菌“最后一道防線”的COL也出現耐藥性,且檢測到mcr-1耐藥基因,而COL因為具有較強的腎毒性而較少在寵物臨床上應用,其耐藥性可能是由于食品源動物橫向傳播所致。TGC因為高劑量下具有腎毒性而不能在人醫臨床應用,但因其廣譜抑菌特性在多重耐藥菌株感染治療中發揮著重要作用[40]。該研究中沙門氏菌S45不僅對COL耐藥,而且對TGC耐藥,這是該地區寵物貓臨床上首次報道,其耐藥原因及傳播機制值得進一步研究。

4 結論

該研究對貓源4種主要病原菌的分離鑒定、毒力基因檢測及藥物敏感性試驗結果豐富了鄭州地區貓源主要病原菌的流行病學資料和耐藥性分析報告,獲得的臨床菌株除葡萄球菌外均不同程度攜帶多種毒力基因,耐藥性突出且存在多重耐藥現象,其對四環素類新型藥物TGC和多粘菌素類COL的耐藥機制疑是水平傳播所致,值得引起警惕。