拮抗水稻病原菌假單胞菌AH菌株的鑒定及全基因組序列分析

胡逸群,沈文杰,陳晴晴,張愛芳

安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所,安徽合肥 230001)

為緩解農藥過度施用與環境保護之間的矛盾,微生物來源的生防菌劑或制品有較好的開發前景。假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和木霉屬來源的微生物,對多種植物或動物病原菌具有良好的抑菌活性,因此被廣泛用作生物防治劑[1-4]。假單胞菌屬具有代謝多樣性的特點,可產生多種次級代謝產物,如吩嗪類物質(phenazines)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)、2,4-二乙酰基間苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol)、黃綠菌素(pyocyanin)和環脂肽(cyclic lipopeptides,CLPs)等。此外,假單胞菌屬細菌也能通過誘導系統抗性的方式,抑制病原菌定殖或生長,對植物具有保護作用[5-8]。銅綠假單胞菌P.aeruginosaUPMP3菌株合成的吩嗪粗提物,可顯著減輕狹長孢靈芝引起的油棕櫚莖基底感染[9]。從蘋果花上分離的P.orientalF9菌株表現出對火疫病菌的良好拮抗特性[10]。此外,大多數假單胞菌屬菌株可作為植物根際促生菌,分泌生長調節劑來增強植物防御病原菌的能力。從印度青蒿根際分離的P.aeruginosa可以促進植物生長,且對植物病原菌鏈格孢、黃曲霉和尖孢鐮刀菌表現出很好的生防活性[11]。

惡臭假單胞P.putida與近緣物種P.fluorescens和P.brassicacearum可作為生物防治劑和植物生長促進劑[12-13]。P.putida與其他有益微生物復合施用時,顯著增加了水果營養元素的含量[14-15]。P.putidaB2017菌株通過產生鐵載體pyoverdine來抑制植物病原菌[16]。在有益于植物的同時,生防菌也需要使自己免于如活性氧爆發之類的快速且強烈的植物防御反應所導致的損傷。P.putidaRRF3通過改變根部基因的轉錄表達來刺激植物產生防御反應,并通過改變根際的化合物組分來保護自身[17]。

一直以來,我國稻米主產區的真菌、細菌病害頻發,稻瘟病菌可在水稻營養生長期侵染葉片導致葉瘟,在生殖生長期侵染稻穗導致穗頸瘟,嚴重降低稻米產量和品質[18]。鐮孢菌Fusarium的復合侵染,如藤倉鐮孢菌F.fujikuroi、層出鐮孢菌F.proliferatum、擬輪枝鐮孢菌F.verticillioides等,會降低種子發芽率,或引起水稻惡苗病[19]。此外,黃單胞菌Xanthomonas是一類重要的植物病原細菌,可侵染400多種植物,包括稻、棉、豆等糧食作物和柑橘、香蕉和木薯等經濟作物[20]。其中,X.oryzaepv.oryzae和X.oryzaepv.oryzicola是稻黃單胞的2個致病變種,分別引起水稻白葉枯病和細菌性條斑病,危害嚴重[21-22]。面對防病增產與生態保護之間日益突出的矛盾,廣譜抑菌菌株的開發利用是減少化學制劑使用、降低環境污染的有效策略。

葉際微生物的生境更為復雜多變,具備良好的環境適應性和多種生防機制。基于此,筆者通過分離水稻葉片微生物、平板對峙篩選拮抗菌株、多基因測序和系統發育分析鑒定得到一株具有良好抗菌活性的惡臭假單胞P.putidaAH菌株,田間試驗明確其對水稻白葉枯病和稻瘟病具有防治效果。利用第二代Illumina與第三代PacBio結合的方法進行全基因組測序,并對測序數據進行基因組組裝、基因預測與功能注釋、次級代謝產物合成基因簇分析,為AH菌株的基因功能研究提供分子遺傳信息。惡臭假單胞P.putidaAH菌株的研究可為水稻病害防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養條件稻瘟病菌Magnaportheoryzae、紋枯病菌Rhizoctoniasolani、莖點霉菌Phomasp.、水稻白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae、尖孢鐮孢菌Fusariumoxysporum、層出鐮孢菌F.proliferum、短小桿菌Curtobacteriumsp.,均保存于筆者所在實驗室。細菌培養用LB培養基,白葉枯病菌培養用NA培養基,培養條件為28 ℃,保存介質為50%甘油。真菌培養用PDA培養基,培養條件為28 ℃,無菌濾紙對菌絲塊進行低溫保存。

1.2 稻瘟拮抗細菌的分離和篩選為從水稻葉際分離稻瘟病菌的拮抗細菌,用無菌剪刀將水稻葉片組織切成小塊,在無菌水中浸泡30 min,6 000 r/min 離心3 min獲得上清液。將懸浮液進行梯度稀釋(10-2、10-3、10-4、10-5),取不同濃度的稀釋液50 μL涂布于3個LB板上,平板于28 ℃培養2 d。挑取形態差異的單菌落進一步純化保存,用于拮抗菌的篩選。稻瘟病菌孢子液稀釋至2×107個/mL,涂布PDA平板后,28 ℃培養3 d。取2 μL上述細菌菌液滴于上述平板,28 ℃培養3 d,周圍有抑菌圈的細菌即為目的菌,純化并保存。

1.3 拮抗細菌的形態觀察取20 μL新鮮菌懸液滴到碳膜銅網,靜置5 min后用濾紙吸去多余液體。將2%磷鎢酸滴在碳膜銅網,靜置染色2 min后用濾紙吸去多余液體,室溫干燥。在透射電子顯微鏡下觀察細菌形態,采集圖像分析。

1.4 細菌分類鑒定利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。使用細菌通用引物[23]擴增16S rDNA基因(27F,5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′;1492R,5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。使用特異性引物擴增gyrB序列(F,5′-GAGCAGACCTACGTCCACGGTGTG-3′;R,5′-GTCGATCATCTTGCCAACGACCGC-3′)。PCR擴增產物經過純化后送生工生物技術公司進行測序。測序結果與BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中核酸數據進行比對,選擇同源性較高的近緣物種序列,利用MEGAX軟件使用鄰接法構建系統發育樹。

1.5 平板對峙試驗5種植物病原菌(M.oryzae,R.solani,F.oxysporum,F.proliferatum,X.oryzaepv.oryzae)和2種附生菌(Phomasp.,Curtobacteriumsp.)作為拮抗測試的靶標菌。將上述分離得到的拮抗細菌在液體LB中培養至生長對數期(OD600 nm=1.0),用于平板對峙試驗。拮抗真菌試驗:將新鮮菌絲塊放置在PDA平板中央,將2 μL拮抗細菌菌懸液滴在平板邊緣。平板于28 °C培養箱培養3～7 d,拍照并記錄數據。拮抗細菌試驗:將靶標菌的菌懸液(OD600 nm=1.0)稀釋100倍,涂布于LB平板,28 °C培養1 d后再將2 μL拮抗細菌的菌懸液滴在上述平板邊緣。平板放置在28 °C培養箱培養3 d,拍照并記錄數據。

1.6 田間防治試驗秈稻常規稻品種WH26作為參試材料,評價拮抗細菌對水稻3種病害(稻瘟病、水稻白葉枯病、細菌性條斑病)的田間防治效果。1月齡的水稻苗用于接種病原菌。病原菌接種前1和3 d,分別用拮抗菌的菌懸液(OD600 nm=0.5)均勻噴施水稻幼苗,以葉片布滿微液滴為限。水稻白葉枯病菌接種:用無菌剪刀沾取X.oryzaepv.oryzae的菌懸液(OD600 nm=0.5),在距離葉尖邊緣約2 cm處剪下葉片。選取10株水稻,每株取3片葉片進行接種處理。接種14 d后進行病斑長度測量。水稻細菌性條斑病菌接種:用無針頭的1 mL注射器將X.oryzaepv.oryzicola菌懸液(OD600 nm=0.5)注入水稻葉片的細胞間隙,注意避免對植物造成另外的機械損傷。選取10株水稻,每株取3片葉片進行接種處理。接種7 d后進行病斑長度測量。稻瘟病菌接種:將M.oryzae孢子懸液濃度調整為2×105個/mL,均勻噴施于水稻葉片,以葉片布滿微液滴為限,接種7 d后觀察統計發病情況。

1.7 抗生素敏感性試驗采用平板加藥法測試拮抗細菌對慶大霉素(Gm)、卡那霉素(Kn)、氨芐霉素(Amp)和利福平(Rif)的敏感性。固體LB培養基中分別加入上述抗生素,配制終濃度分別為20.0、10.0、5.0、2.5 μg/mL的抗生素平板。將拮抗菌的菌懸液(OD600 nm=1.0)稀釋100倍,均勻涂布于上述平板,28 ℃培養1 d,拍照并計數菌落。

1.8 細菌全基因組測序第二代Illumina與第三代PacBio結合的測序方法進行全基因組測序。離心收集新鮮的AH菌體,試劑盒法提取基因組DNA(Genomic DNA Isolation Kit,TaKaRa)。使用G-tubes(Covaris)剪切基因組DNA,EXO VII處理DNA并進行DNA末端修復,制備SMRTbell DNA文庫。基因組的從頭組裝基于三代數據,使用falcon進行原始數據的自我矯正及基因組初步組裝,得到一致性序列。使用GenomicConsensus軟件對原始數據再次矯正,使用sprai對一致性序列進行環化處理,得到環化的細菌基因組[24],Circos軟件構建基因組圈圖[25]。使用Prodigal軟件預測編碼基因[26],Rfam預測非編碼RNA[27]。

2 結果與分析

2.1 生防細菌的分離通過稻瘟孢子液平板的篩選方法,分離得到5株具有抑菌作用的細菌菌株,其中抑菌作用最顯著的一株命名為AH,對其進行后續研究。在PDA培養基上培養2 d后,AH菌落形態為黃白色,表面粗糙,邊緣凹陷(圖1A、B)。在LB培養基上,AH菌落形態與PDA培養基相似,菌體更為致密(圖1C、D)。透射電鏡觀察到AH呈短桿菌(圖1E、F)。

注:使用平板劃線法(A,C)和菌液懸滴法(B,D),分別在PDA培養基(A,B)和LB培養基(C,D)培養菌株AH。透射電鏡觀察菌體形態(E:5.0 μm;F:500 nm)。Note: Strain AH was cultured on PDA medium (A,B) and LB medium (C,D) by streak plate method (A,C) and dropping plate of liquid bacterial culture (B,D),respectively.P.putida AH strain was observed by transmission electron microscope (TEM),which was treated with 2% phosphotungstic acid on the copper grid to stain for 2 min on 5.0 μm (E) and 500 nm (F) scale.圖1 菌株AH的形態學特征Fig.1 The morphological features of strain AH

2.2 生防細菌的鑒定AH的16S rDNA基因序列長度為1 405 bp,BLAST比對結果顯示該序列與P.putida、P.wayambapalatensis、P.muyukensis、P.monteilii、P.plecoglossicida、P.shirazica和P.asiatica等菌株高度相似,相似度均高于99.87%,需進一步確定種屬。利用特異性引物擴增得到gyrB基因序列,長度為708 bp,BLAST比對結果顯示該序列與P.putidaNX-1、P.putidaPC2同源性為97.74%,與P.wayambapalatensisRW3S1相似度為96.15%,與P.muyukensisCOW39相似度為93.04%,與P.monteilii各菌株相似度均為92%。利用MEGAX軟件構建系統發育樹,表明AH屬于惡臭假單胞菌P.putida(圖2)。

圖2 菌株AH基于gyrB基因的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of the complete gyrB gene

2.3 菌株AH的生防潛力菌株AH對參試的7種菌株均表現拮抗活性,其中對稻瘟病菌、水稻白葉枯病菌、短小桿菌和莖點霉抑制作用顯著,抑菌圈直徑均大于1.3 cm(圖3A、B、F、G,圖4)。對于水稻紋枯病菌、尖孢鐮孢菌和層出鐮孢菌的抑菌圈直徑小于1.0 cm(圖3C、D、E,圖4)。

注:平板拮抗測試AH對稻瘟病菌(A)、莖點霉(B)、紋枯病菌(C)、尖孢鐮孢菌(D)、層出鐮孢菌(E)、短小桿菌(F)、水稻白葉枯病菌(G)的抑菌活性。H.平板模式圖。Note: Tested pathogens included Magnaporthe oryzae (A),Phoma sp.(B),Rhizoctonia solani (C),Fusarium oxysporum (D),F.proliferatum (E),Curtobacterium sp.(F),and Xanthomonas oryzae pv.oryzae (G).Experimental model diagram(H).圖3 菌株AH對參試菌株的平板拮抗測試Fig.3 Antagonistic efficacy of P.putida AH against tested strains

圖4 菌株AH的平板抑菌效果Fig.4 Antagonistic efficacy of P.putida AH against tested strains

田間防治試驗中,水稻葉片噴施AH菌懸液不影響水稻生長(圖5A)。僅接種稻瘟孢子液時,葉片出現急性型病斑、慢性型病斑、褐點和白點型病斑的混合癥狀(圖5B、C);接種前用AH菌懸液處理后癥狀顯著減輕。水稻白葉枯病菌接種后,葉片呈現黃白色皺縮癥狀,沿葉脈擴展。AH噴施后癥狀顯著減輕。且AH處理組的葉片皺縮現象比白葉枯病菌接種組的癥狀延遲3 d出現。水稻細菌性條斑病菌接種后,接種部位葉片出現黃褐色的短病斑,AH菌液處理對病害進程無明顯影響(圖5)。說明田間噴施菌株AH懸液可有效減輕水稻白葉枯病和稻瘟病的病害等級。

注:稻瘟病菌(上),水稻細菌性條斑病菌(中)和白葉枯病菌(下)在感病水稻品種WH26上的發病情況。Note:The severities of rice blast (upper),bacterial leaf streak (middle),and bacterial blight (lower) in the susceptible rice variety WH26 were exhibited.圖5 菌株AH對水稻病害的防治效果Fig.5 The biocontrol effect against three major pathogens on rice plants

2.4 菌株AH基因組分析采用二代Illumina與第三代PacBio結合的測序技術對菌株AH進行全基因組測序,獲得高質量Reads 102 114條,數據量1.27 G。AH基因組長為5 889 125 bp,GC含量為63.74%,包含5 215個編碼序列,其中包括19個rRNA、77個tRNA和78個nRNA。基于GC偏差、GC含量、非編碼RNA(rRNA為紅色表示,tRNA為藍色表示,sRNA為綠色表示)和COG注釋等信息,使用Circos軟件構建的基因組圈圖見圖6。全基因組測序數據已提交至GenBank,收錄號為SAMN34209943。利用NR數據庫進行蛋白質序列相似性比對顯示,共有5 183個基因被注釋,占基因總數的99.4%;在KEGG數據庫中比對得到5 150個基因,占比98.8%;在COG、Swiss-Prot和GO數據庫中分別比對得到4 164、3 858、3 715個基因,占比分別為79.8%、74.0%和71.2%。

注:Circos(v0.69)軟件繪制菌株AH的基因組圈圖,從內到外分別代表GC 偏移、GC含量、非編碼RNA(紅色是rRNA,藍色是tRNA,綠色是sRNA)、前導鏈的COG注釋和后隨鏈的COG注釋。Note:The map was drawn using Circos (v0.69).From the center to the periphery,different components represent GC skew,GC content,non-coding RNA (rRNA,red;tRNA,blue;sRNA,green),COG annotation of the leading strand,and COG annotation of the lagging strand.圖6 菌株AH的基因組圈圖Fig.6 Graphical circular map of the genome of P.putida AH

對菌株AH基因組數據進行KEGG和GO數據庫分析,結果見圖7。KEGG注釋結果表明,菌株AH基因組中有2 810 個編碼蛋白的基因富集到六大類42條代謝通路中。其中,代謝功能相關的基因占比最大,其中氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔酶因子和維生素代謝、能量代謝相關通路的數量較高。表明菌株AH具有代謝多樣性的特征。GO數據庫按照生物過程、細胞組分和分子功能三類對菌株AH基因功能進行分類,其中細胞組分中膜組分相關基因、分子功能中的ATP結合和金屬離子結合相關基因占比較大。

注:A.KEGG注釋結果;B.GO注釋結果。Note:A.KEGG annotation results;B.GO annotation results.圖7 菌株AH的基因功能分析Fig.7 Gene functions in the P.putida AH genome

2.5 次生代謝產物合成基因簇的預測使用antiSMASH在線平臺對菌株AH基因組中次級代謝產物合成基因簇進行預測,分析表明該基因組包含8個次級代謝產物基因簇,其中5個是非核糖體肽合成酶(NRPS)基因簇或NRPS-like基因簇(圖8、表2)。根據基因簇同源性,AH可能合成2類已知的抗菌物質viscosin和putisolvin。分析發現,Cluster1與BGC0001100來源的Streptomycesrochei的合成基因簇相似性為13%;Cluster2和Cluster5都與BGC0000413來源的PseudomonasprotegensPf-5的pyoverdin合成基因簇相似,相似度分別為10%和4%;Cluster3與BGC0001312來源的PseudomonasfluorescensSBW25的viscosin合成基因簇相似度為50%。Cluster4與Pseudomonasputida的putisolvin合成基因簇相似性為50%;Cluster5與BGC0000413來源的PseudomonasprotegensPf-5的pyoverdin合成基因簇相似性為4%;Cluster8與BGC0001692來源的XenorhabdusnematophilaATCC 19061的nematophin合成基因簇相似性為12%。另外Cluster6和Cluster7未比對到相似基因簇,暗示菌株AH中可能存在新物質合成基因簇,具有研究和應用潛力。

表2 菌株AH的8個次級代謝產物合成基因簇信息

注:AntiSMASH在線平臺預測菌株AH的次級代謝產物合成相關基因簇,8個基因簇的信息如圖。不同顏色代表不同類型的基因。Note:Secondary metabolite associated gene clusters were predicted by antiSMASH online platform.Eight gene clusters were respectively concatenated on P.putida AH genome according to the order and length.Different colors represent different types of genes as shown.圖8 菌株AH的8個次級代謝產物合成基因簇Fig.8 Secondary metabolism gene clusters in P.putida AH

2.6 菌株AH對氨基糖苷類抗生素高度敏感采用平板加藥法對菌株AH的抗生素敏感性進行測定發現,外源卡那霉素或慶大霉素濃度為2.5 μg/mL的條件下,菌株AH生長出現明顯抑制現象;利福平濃度為10 μg/mL時,AH生長被抑制,20 μg/mL時抑制作用明顯;在所有測試濃度下,氨芐霉素均未對AH生長產生影響(圖9)。這表明AH菌株對氨基糖苷類抗生素(慶大霉素和卡那霉素)高度敏感,且抑菌作用存在劑量依賴性。

圖9 菌株AH的抗生素敏感性測試Fig.9 Antibiotic susceptibility of P.putida AH

3 結論與討論

該研究通過平板抑菌測試,篩選得到5株具有生防效果的菌株,其中菌株AH效果最好,經多基因測序比對,鑒定為惡臭假單胞P.putidaAH。進一步測試發現AH對植物病原細菌水稻白葉枯菌和病原真菌稻瘟病菌、紋枯病菌都有較好的抑菌活性,其抑菌譜具有一定的廣譜性,具有研究價值。

在線平臺antiSMASH預測發現P.putidaAH中有8個次級代謝產物合成基因簇,可能合成viscosin、putisolvin等抗菌物質。putisolvin對多種病原菌具有拮抗活性,一般通過破壞細胞膜和抑制DNA合成的機制發揮抗菌作用,也能作為生物表面活性劑影響細菌群體感應與生物膜形成[28]。但AH菌株的合成基因簇與已知基因簇比對的相似度來看,均未超過50%,僅有Cluster3與P.fluorescensSBW25的viscosin合成基因簇相似度為50%,Cluster4與P.putida的putisolvin合成基因簇相似性為50%。Cluster6和Cluster7未比對到相似基因簇,另外的Cluster1、2、5、8基因簇與已知菌株基因簇的相似度為13%、10%、4%、12%。此外,經過比對發現胺甲萘降解菌株P.putidaSimmons01、P.putidaNBRC14164菌株有6個次級代謝產物合成基因簇,耐低碳氧菌株P.putidaKT2440有7個合成基因簇[29]。這些結果暗示菌株AH的8個基因簇除合成上述已知物質,還可能合成其余未報道的物質,具有代謝多樣性的特征,有較好的研究和應用潛力。

菌株AH的抗生素敏感性測試結果表明其對氨芐霉素的耐藥性很強,而分析AH菌株的基因組數據發現,其中并不含有編碼氨芐霉素抗性的基因,但鑒定得到多個resistance-nodulation against tested strainscell division(RND)類型的抗生素外排泵基因,這表明菌株AH可能是通過外排泵系統來阻止氨芐霉素的外源施加對細菌造成的損傷。除RND類外排泵外,AH基因組中還鑒定到small multidrug resistance(SMR)類的外排泵,靶向氨基糖苷類抗生素。而抗生素敏感性測試表明菌株AH對氨基糖苷類抗生素高度敏感,推測可能是由于相關基因表達水平較低或發生沉默而無法發揮蛋白正常功能,導致菌株AH不足以防御氨基糖苷類抗生素。菌株AH的全基因組數據為后續分子操縱提供了遺傳信息,也為深層的防病機制解析提供了基礎。