基于Olink靶向蛋白質組學技術的高原習服和平原人血清差異表達蛋白研究*

潘鏡余,谷天艷,陳 玲,馬筱潔,史清海△

1.石河子大學醫學院,新疆石河子 832000;2.新疆醫科大學研究生院,新疆烏魯木齊 830000;3.新疆軍區總醫院臨床檢驗診斷中心,新疆烏魯木齊 830000;4.新疆維吾爾自治區人民醫院輸血科,新疆烏魯木齊 830000

高原地區以低壓低氧、高寒及強紫外線為主要特征,其中對人類生命活動影響最為顯著的主要是低氧因素[1]。人體暴露于高原低氧環境后,機體會從整體水平調動其內在機制發生一系列的代償適應性變化以應對高原低氧環境,使機體內環境由不平衡到平衡,最終達到內、外環境的統一,這一過程稱為高原習服[2]。機體對高原環境的習服是一個時間依賴的漸進過程,多數人可通過習服獲得對高原環境良好的適應。高原習服的機制是高原缺氧階段機體神經-體液調節系統及生理、生化代謝的適應性改變[3],以往的研究集中在組織和細胞層面低氧誘導因子激活的造血系統、脂類代謝、炎癥反應等適應性代謝改變,而循環系統外周血中組織或細胞代謝過程中的各類終產物或中間產物的表達變化蘊含著豐富的代謝變化信息,其中痕量、微小蛋白分子由于易被血液中高豐度蛋白的掩蓋或遮蔽一直以來都是相關研究的難點和瓶頸。近年來,蛋白質組學技術主要應用于識別新的生物標志物和(或)潛在的治療靶點,以液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)[4]、蛋白芯片[5]、Olink蛋白質組學技術[6]為代表的高覆蓋度的蛋白質定性與定量的分析技術為疾病診斷、藥物研發和致病機制研究提供了多種選擇。

Olink蛋白質組學技術是基于鄰位延伸技術(PEA)的高通量靶向檢測血液(或各種體液)中特定種類蛋白質的技術,其最大的優勢在于靈敏度達到飛克(fg)級別,更易檢測出低豐度表達蛋白,已廣泛應用于多種疾病的基礎和臨床研究。為深入了解高原習服人群外周血中與細胞代謝過程特異性相關的小分子蛋白差異表達情況,探索高原習服機體組織和細胞代謝性相關缺氧適應性功能機制,本研究擬應用Olink靶向蛋白質組學技術,篩選高原習服人群與平原人群血清中細胞代謝相關的血清差異表達蛋白,分析其在細胞缺氧代謝調控作用中的功能,為探索高原適應性機制和促進高原習服提供參考依據和藥物新靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2020年12月至2021年7月移居西藏阿里地區6～12個月的40例漢族青壯年男性作為高原習服組,均居住于平均海拔4 500 m的地區,身體適應高原,體檢無異常(在陸軍某部醫院完成體檢);另選取與高原習服組年齡等相匹配的40例新疆軍區總醫院體檢中心的平原漢族男性作為平原對照組,均長期居住于海拔<1 000 m的地區,體檢結果為健康。

1.2納入及排除標準 依據新疆軍區總醫院醫學倫理委員會的要求,獲得研究對象知情同意。高原習服組研究對象的納入標準:(1)由海拔1 000 m以下移居至平均海拔4 500 m地區的漢族青壯年男性,居住時間為6～12個月,已適應高原生活且無身體不適者;(2)此前均未到過高原地區,且無心、肺等基礎疾病史;(3)除外真性紅細胞增多癥和其他繼發性紅細胞增多;(4)近期無外傷及手術病史,無發熱、炎癥及其他可能影響檢測結果的情況(如身體狀態欠佳,有飲酒、用藥等情況)。平原對照組研究對象納入標準:(1)常駐海拔<1 000 m,近6個月無長期海拔2 000 m以上旅居史的漢族青壯年男性;(2)無慢性疾病史,經過體檢,肝、腎功能指標,以及心電圖、胸片、腹部超聲等檢查指標均無異常;(3)近期無外傷及手術病史,無發熱、炎癥及其他可能影響檢測結果的情況。

1.3儀器與試劑 分別采用上臂式電子血壓計(大連歐姆龍HEM-7127J)和指夾式脈搏血氧儀(江蘇魚躍YX307),在靜息狀態下測量并記錄研究對象血壓、心率和指脈氧飽和度。由杭州聯川生物技術有限公司提供血清Olink蛋白質組學檢測服務,Olink 92種靶標代謝Panel試劑盒可檢測靶標見表1。

表1 Olink 92種靶標代謝Panel試劑盒靶標

1.4方法

1.4.1血液樣本的采集 所有研究對象禁食12 h,于次日清晨黃帽分離膠采血管采肘靜脈血5 mL,4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上層血清,于-80 ℃冰箱凍存用于蛋白質組學檢測。

1.4.2血清差異表達蛋白檢測 采用Olink靶向蛋白質組學技術——鄰近延伸分析技術(瑞典Olink Proteomics公司)進行檢測。基本原理是使用一對互補可雜交DNA寡核苷酸標記的抗體同時與一個靶標蛋白結合,待測的靶標蛋白使這對抗體接近,通過雜交反應使抗體上配對的DNA寡核苷酸形成雙鏈DNA標簽,采用微流控定量PCR(qPCR)對雙鏈DNA標簽進行相對定量檢測和分析,擴增子數量與待測靶標蛋白的初始濃度呈正比。基本操作步驟包括加樣、雜交孵育、延伸與擴增、芯片預處理及上機操作、數據分析。使用3個用于計算檢測限(LOD)的陰性對照和3個含有92組抗體的板間對照(IPC)對所得循環閾值(Ct)進行質量控制和標準化,測定數值以標準化蛋白質表達值(NPX)的log2對數轉換值表示,計算公式:靶標dCt=靶標Ct-陰性對照Ct-板間對照Ct;靶標ddCt=校正因子(試劑批次變量)-靶標dCt。使用Olink靶向蛋白質組學技術對高原習服組和平原對照組研究對象血清中代謝相關靶標蛋白表達水平進行檢測,將獲得的NPX進行聚類分析。

1.4.3生物信息學分析 對篩選的差異表達蛋白應用基因本體論(GO)數據庫(http://www.geneontology.org/)按照其生物學功能及機體內參與的生理學反應過程進行GO分類和富集分析,繪制GO分析柱狀圖和氣泡圖。對差異表達蛋白應用京都基因和基因組百科全書(KEGG)數據庫(http://www.kegg.jp/)中的信號通路提供代謝途徑查詢并進行富集,繪制KEGG分析柱狀圖和氣泡圖。

2 結 果

2.1基本資料和生理指標比較 本研究納入的兩組研究對象為非自身對照關系。為了排除性別和民族影響,故兩組納入者均為漢族青年男性人群。經統計分析,兩組間年齡、身高、體重、收縮壓差異無統計學意義(P>0.05));與平原對照組相比,高原習服組舒張壓、心率較高,血氧飽和度較低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組基本資料及生理指標比較或M(P25,P75)]

2.2血清中代謝相關差異表達蛋白的分析結果 使用Olink靶向蛋白質組學技術對高原習服組和平原對照組研究對象血清中代謝相關92個靶標蛋白表達水平進行檢測,將獲得的NPX進行聚類分析,結果見圖1。計算兩組NPX均數的差值,篩選得到差異表達蛋白34個,其中上調16個,按照P值從小到大排序分別是:SUMF2、CTSH、TYMP、KLK10、SDC4、FAM3C、GLRX、MCFD2、CTSO、NOMO1、CDHR5、FBP1、LILRA5、CANT1、ALDH1A1、SIGLEC7(P<0.05);下調18個,分別是:SOST、CRKL、NADK、RNASE3、CA13、SNAP23、GHRL、APEX1、NPDC1、CCDC80、CHRDL2、ANXA11、NECTIN2、ARG1、APLP1、SERPINB6、CLSTN2、SERPINB8(P<0.05)。分別對上調和下調P值最小的排名前5位(TOP 5)顯著差異表達蛋白進行分析,結果見圖2。

注:X軸的每個坐標代表一個樣本,Y軸的每個坐標代表一個靶標蛋白,右側顏色條從藍色到紅色的漸變代表表達水平的高低,藍色越深代表表達水平越低,紅色越深代表表達水平越高。圖1 高原習服組和平原對照組血清中代謝相關92個靶標蛋白表達水平熱圖

注:A～E為TOP 5上調表達蛋白,F～J為TOP 5下調表達蛋白;P值中E-06為×10-6,依次類推;NPX為標準化蛋白表達值。圖2 高原習服組和平原對照組92個靶標蛋白中P值最小的前5位差異表達蛋白

2.3血清中代謝相關差異表達蛋白GO富集分析 Olink蛋白質組代謝panel共檢測92種靶標蛋白,對兩組比較顯著上調的16種蛋白和下調的18種蛋白進行GO分類分析,結果表明:差異蛋白在細胞組分分類中主要富集在細胞外泌體;在生物學過程分類中主要富集在中性粒細胞脫顆粒、通過細胞質膜黏附分子黏附、免疫調節等生物學過程;在分子功能分類中主要富集在蛋白質結合、鈣離子結合、金屬離子結合等,見圖3。

注:橫坐標為差異表達蛋白在GO條目(GO Term)中的存在方式或意義,縱坐標為總蛋白數(Protein Number);Biological Process,生物過程;Cellular Component,細胞組分;Molecular Function,分子功能。圖3 高原習服組和平原對照組血清中差異表達蛋白的GO富集分析

2.4血清中代謝相關差異表達蛋白KEGG富集分析 進一步對參與各類生物過程的差異表達蛋白在細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝、生物系統6個部分進行富集分析,發現差異表達蛋白分別在阿米巴病、嘧啶代謝、溶酶體、凋亡、胰島素代謝、細胞黏附分子等通路富集,見圖4。此外,還有一些差異表達蛋白是氮素代謝、精氨酸生物合成、煙酸鹽和煙酰胺代謝、磷酸戊糖途徑等通路中的關鍵蛋白。

注:縱坐標Rich Factor表示位于該KEGG的差異蛋白個數/位于該KEGG的總蛋白數(Protein Number),Rich Factor值越大,KEGG富集程度越高;點的大小代表蛋白數目,點的顏色代表富集分析的P值,即富集的顯著性;該KEGG富集分析氣泡圖是根據富集的P值取前20位的信號通路進行繪圖展示。圖4 高原習服組和平原對照組血清中差異表達蛋白的KEGG富集分析

3 討 論

高原缺氧會對機體造成一定損傷,但機體也可以通過一段時間的代償性適應來維持體內內環境的平衡達到高原習服,如果不能有效適應和習服,則可能導致嚴重的肺水腫或腦水腫[7]。本研究納入的移居海拔4 500 m、居住6～12個月的高原習服研究對象血氧飽和度降低、心率增快均符合移居高原人群基本生理特征。

機體組織細胞有氧呼吸以氧為電子傳遞鏈中的電子受體,產生ATP為細胞代謝提供能量。細胞缺氧將引發多種生理和病理生理改變,無論是急性高原反應、急慢性高原病還是高原習服,它們的中心調節蛋白都是缺氧誘導因子(HIF)蛋白家族[8],而HIF-1被認為是低氧代謝適應的主要驅動因素,在體內維持氧穩態,氧供受限時能調控數百個基因的表達,包括血管新生因子(VEGF)、促紅細胞生成素(EPO)、一氧化氮合酶(NOS)等一系列與無氧呼吸和葡萄糖轉運相關的酶等[9]。缺氧暴露后,代謝適應對正常組織功能至關重要,細胞氧濃度的維持能使其從有氧氧化到無氧糖酵解代謝過程間完成快速和可逆的代謝轉換[10-11],而組織或細胞在缺氧適應性代謝過程中的多種產物將釋放到外周血循環系統中,有些產物是通過循環系統轉運到相應靶器官發揮調控作用,有些則可能是代謝中間產物或廢物等依靠循環系統完成清除,這些產物分子的表達和水平變化蘊含著豐富的代謝變化信息。

LU等[12]使用iTRAQ蛋白質組學技術分析高原習服者血漿后發現,與三羧酸循環、核糖體、代謝途徑、甘油酯代謝、抗壞血酸和鹽酸鹽代謝、丙酸代謝、蛋白酶體等相關的蛋白表達量減少;ZHANG等[13]利用iTRAQ 4-plex蛋白質組學技術研究了慢性高原病與非慢性高原病者之間的差異表達蛋白,富集分析表明主要在過氧化物酶體、氮代謝、碳代謝、代謝途徑、嘌呤代謝和磷酸戊糖途徑中積累;YANG等[14]利用Olink蛋白質組學技術在急進高原習服良好和習服不良者中篩選血清差異表達蛋白譜,發現其參與碳水化合物的代謝、葡萄糖/能量代謝的蛋白表達升高。由于血漿中白蛋白、免疫球蛋白等高豐度表達蛋白的遮蔽作用,其中一些痕量且微小的蛋白分子因豐度低難以被檢測。本研究應用Olink蛋白質組學技術對高原習服人群和平原人群外周血血清中代謝相關的92個靶標蛋白表達水平進行檢測,篩選得到差異表達蛋白譜共34個蛋白質,其中表達上調的蛋白16個,表達下調的蛋白18個。本研究通過KEGG富集分析發現,34個差異表達蛋白在阿米巴病、嘧啶代謝、溶酶體、凋亡、胰島素代謝、細胞黏附分子等通路顯著富集,還有一些差異表達蛋白是氮素代謝、精氨酸生物合成、煙酸鹽和煙酰胺代謝、磷酸戊糖途徑等通路中的關鍵蛋白。上述結果與前述研究報道的結果不完全一致[12-14],存在結果差異可能是與不同研究人群的高原習服狀態、移居高原時長不同等因素有關。

本研究篩選獲得的差異表達蛋白譜中,部分蛋白是與細胞缺氧代謝過程相關的蛋白。硬骨素(SOST)主要是由骨細胞分泌的一種蛋白[15],通過抑制成骨細胞中經典的Wnt信號轉導負向調控骨形成[16]。缺氧時,HIF-1α能直接結合到SOST的啟動子序列上,下調SOST的表達,增強了Wnt/β-catenin信號通路[17-18]。GENETOS等[19]研究也證實,1% O2細胞缺氧下調SOST轉錄和蛋白表達,上調Wnt信號通路和β-catenin激活。CRK樣蛋白(CRKL)是適配蛋白家族的一員,具有黏附、增殖、遷移、存活等多種生物學功能[20]。ZHANG等[21]研究通過對缺氧/復氧(H/R)大鼠H9C2心肌細胞敲除CRKL基因后發現,其通過Bax和下調p-ERK1/2來抑制心肌細胞凋亡,提示CRKL調控緩解低氧誘導的心肌細胞損傷。血管舒張劑激活磷蛋白(VASP)是一種肌動蛋白,連接細胞骨架系統與信號轉導通路,在細胞黏附、細胞骨架動力學等方面發揮關鍵作用[22]。LIU等[23]研究發現,在缺氧時HIF-1α能直接結合到VASP啟動子的缺氧反應元件上,VASP還與CRKL的SH3N結構域直接相互作用進而介導其功能,并且VASP還能增強β-catenin的轉錄活性,都與低氧條件下調控骨形成有關。NAD激酶(NADK)能催化磷酸基團,使ATP轉移到NAD上生成NADP,其在細胞代謝和抗氧化等多種生物功能中發揮著重要作用[24]。高原環境不僅低壓低氧,還存在強紫外線強等氧化應激因素。GROSE等[25]研究發現,在紫外線照射條件下吡啶核苷酸還原水平下降,可激活NADK活性,還原型NADP(NADPH)則能緩解細胞氧化應激損傷。硫酸酯酶修飾因子2(SUMF2)是甲酰基甘氨酸生成酶家族的成員,可與白細胞介素13(IL-13)發生相互作用[26-27]。據此推測,SUMF2可能是高原良好習服后氣道反應性降低的調控分子。胸苷磷酸化酶(TYMP)是一種血管生成因子,可促進組織血管生成并刺激多種內皮細胞的體外生長,且能抵抗缺氧誘導的凋亡。IKEDA等[28]研究證實,TYMP酶活性對其血管生成是不可或缺的,提示TYMP在細胞缺氧代謝過程中發揮積極作用。

綜上所述,本研究通過Olink高敏靶向蛋白質組學技術,篩選出了高原習服人群與平原人群之間細胞代謝相關的血清差異表達蛋白譜,豐富補充了以往質譜或芯片技術較難捕獲的較低豐度的血清差異表達蛋白譜,進一步分析了與細胞缺氧代謝相關的差異表達蛋白的生物學功能機制,但仍有較多蛋白鮮見與細胞缺氧代謝相關的文獻報道。本研究尚存在一定的局限性,兩組人群為非自身對照,飲食、工作強度等有差異,可能存在結果偏倚;其次,研究對象相對較少,缺乏多種方法的差異表達驗證。因此,后續將完善實驗設計、擴大樣本量驗證這些差異表達蛋白,研究這些蛋白在細胞缺氧代謝適應性功能機制中的作用,為探索高原適應性機制和促進高原習服提供理論依據和藥物新靶點。