腫瘤壞死因子-α通過Wnt/β-catenin信號通路對膽囊癌細(xì)胞增殖的作用

王鄭林, 常衛(wèi)才, 劉心語, 陳佳偉, 劉子祥, 周少波

(1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 普外科, 安徽 蚌埠, 233000;2. 舟山醫(yī)院 發(fā)熱門診, 浙江 舟山, 316000)

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,侵襲性強(qiáng)、致死率高[1], 早期缺乏典型癥狀和體征,確診時往往已處于晚期[2-3]。由于其早期發(fā)病癥狀隱匿、惡性程度高、易轉(zhuǎn)移,且放化療不敏感,膽囊癌預(yù)后極差。目前膽囊癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確,但癌癥的發(fā)生、發(fā)展與炎癥有關(guān),腫瘤外源性炎癥由多種復(fù)雜因素引起,即使是細(xì)菌和病毒引起的感染也可增大癌癥發(fā)生的風(fēng)險[4]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為重要的促炎因子,關(guān)于TNF-α對膽囊癌細(xì)胞的增殖作用鮮有報道。Wnt/β-catenin信號通路是一個高度保守和嚴(yán)格控制的分子機(jī)制,負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)增殖、分化、遷移、遺傳穩(wěn)定性、凋亡和干細(xì)胞更新。Wnt/β-catenin信號能夠嚴(yán)格控制胚胎發(fā)生,包括肝膽管發(fā)育、成熟和分化。在正常組織中,Wnt/β-catenin通路處于非活性狀態(tài),但在細(xì)胞更新和再生過程以及某些病理狀態(tài)、疾病、惡性前期狀態(tài)和癌癥中,可能會被重新激活[5]。Wnt/β-catenin是參與炎癥反應(yīng)的重要信號通路之一,其信號失調(diào)與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著重要關(guān)系[6]。研究[7]顯示,Wnt/β-catenin信號通路參與了膽囊癌的發(fā)展。本實驗研究TNF-α對膽囊癌細(xì)胞系NOZ增殖的影響,并探討其初步相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

膽囊癌細(xì)胞系NOZ購自上海通派科技公司; CCK-8、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶購自Gibco; β-肌動蛋白/β-actin多抗和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠二抗購自美國CST公司; β-鏈接素抗體(Anti-β-catenin)、致癌基因抗體C-Myc(Anti-c-myc)、抗體細(xì)胞周期素D1抗體(anti-cyclin D1)購自Affinity生物公司; TNF-α(人種屬)、Wnt/β-catenin信號通路抑制劑IWR-1購自MCE公司; BCA蛋白濃度測定試劑盒和Annexin-FITC/PI試劑盒購自聯(lián)科生物公司; 顯影液購自美國默克公司, SDS-PAGE蛋白凝膠電泳試劑盒購自上海康朗公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng): NOZ細(xì)胞采用含10% FBS、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃、100%濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察并及時更換完全細(xì)胞培養(yǎng)基1次,待細(xì)胞長滿80%～90%時選取處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實驗,用胰蛋白酶將細(xì)胞消化至脫落, 1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min, 棄上清,使用新鮮DMEM完全培養(yǎng)基混勻細(xì)胞懸液并進(jìn)行種板和傳代。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖: 取對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細(xì)胞, 2 000個細(xì)胞/孔接種至96孔板中,待細(xì)胞貼壁,棄去原培養(yǎng)液,然后加入TNF-α處理,分為空白組(無細(xì)胞且只含培養(yǎng)液)和處理組(采用0、10、20、50、100 ng/mL濃度的TNF-α對細(xì)胞進(jìn)行處理),每組設(shè)5個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后棄去原培養(yǎng)液,每孔加入100 μL新的含10%FBS完全培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑, 37 ℃下避光孵育2.5 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度(OD)值。本實驗重復(fù)測定3次,計算細(xì)胞存活率。

1.2.3 細(xì)胞生長曲線法: 在96孔板中將膽囊癌細(xì)胞株NOZ按照2 000個/孔進(jìn)行接種,分為TNF-α(20 ng/mL)組、對照(NC)組(0 ng/mL)、抑制劑組[TNF-α (20 ng/mL)+IWR-1], 每組設(shè)5個復(fù)孔,24、48、72 h后對各組進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),本實驗重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期: 接種前用無FBS的DMEM培養(yǎng)48 h, 于24 h后換成含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,按4×105個細(xì)胞/瓶接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,實驗分組同上。收集使用胰酶消化后的各組細(xì)胞,用4 ℃的PBS緩沖液洗滌3次, 1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min, 棄去上清,加入4 ℃預(yù)冷的75%冰乙醇1 mL, 于4 ℃冰箱過夜固定細(xì)胞,檢測前1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min, PBS緩沖液洗滌2次,再用100 μL PBS將細(xì)胞輕輕吹懸,用300目尼龍網(wǎng)過篩,避光條件下加入1 mL的RNase A和10 μL的PI, 渦旋混勻5～10 s。室溫避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀檢測周期,實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白: 將3×106個/皿的NOZ膽囊癌細(xì)胞株接種于3個皿中,實驗分組同上,將細(xì)胞按上述分組進(jìn)行藥物處理48 h, 用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)BCA蛋白定量檢測并調(diào)整蛋白濃度。用20 μL/組進(jìn)行蛋白凝膠電泳分離,從凝膠中轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,快速封閉液封閉0.5 h, 用PBS按照1∶1 000稀釋β-catenin、c-myc、cyclinD1、β-actin抗體,于4 ℃冰箱下孵育過夜,用TBST將孵好抗體的PVDF膜洗30 min, 每隔10 min更換1次TBST, 二抗按照1∶5 000用PBS稀釋,于室溫下孵育2 h, 采用ECL工作液進(jìn)行顯色,在曝光成像檢測儀中曝光成像。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 平板克隆形成試驗: 取對數(shù)生長期的NOZ細(xì)胞,實驗分組同上,用胰蛋白酶消化后,用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞懸液,并計數(shù),于6孔板中各實驗組接種1 000個細(xì)胞/孔,輕輕轉(zhuǎn)動使細(xì)胞分散均勻。放置于37 ℃、100%濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。每隔3 d進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài),肉眼下可見克隆時終止培養(yǎng)。棄上清, PBS洗滌1次,每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定60 min, 棄去固定液, PBS洗滌1次,每孔加入結(jié)晶紫染液1 mL, 染細(xì)胞15 min。PBS洗滌細(xì)胞數(shù)次至染色液褪去,在干燥空氣中倒扣晾干。使用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照, AI摳照后使用Image J來進(jìn)行相對面積統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用兩樣本t檢驗對2組間的差異進(jìn)行分析, Dunnett-t檢驗進(jìn)行兩兩比較,單因素方差One-way ANOVA分析多組之間的差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TNF-α對膽囊癌細(xì)胞系NOZ增殖的結(jié)果

采用TNF-α處理(20 ng/mL)的細(xì)胞生長速度24 h內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 48、72 h細(xì)胞生長速度顯著增快,且48 h的細(xì)胞生長速度增速大于72 h, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。TNF-α對膽囊癌細(xì)胞系NOZ增殖作用的最佳濃度為20 ng/mL, 最佳作用時間為48 h, 表明TNF-α可以促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞系NOZ的增殖,見圖1。

A: 不同濃度TNF-α對NOZ細(xì)胞增殖的影響(與0 ng/mL比較, ??P<0.01, ????P<0.000 1); B: 不同時點NOZ細(xì)胞的增殖(與NC比較, ????P<0.000 1)。圖1 不同濃度TNF-α和不同時點NOZ細(xì)胞的增殖

2.2 TNF-α對膽囊癌細(xì)胞系NOZ周期的影響

本研究采用流式細(xì)胞儀檢測TNF-α對膽囊癌細(xì)胞系NOZ周期的影響,探討TNF-α促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞增殖的機(jī)制,見圖 2。與對照組比較,采用TNF-α(20 ng/mL)處理的G1期細(xì)胞占比降低,S期細(xì)胞占比增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1), G2期細(xì)胞占比降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 采用TNF-α(20 ng/mL)+IWR-1處理的G1期細(xì)胞占比增高,S期細(xì)胞占比降低,G2期細(xì)胞占比增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究結(jié)果顯示, TNF-α可能通過加速細(xì)胞周期G1→S→G2向M期轉(zhuǎn)化促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖。

2.3 TNF-α對膽囊癌細(xì)胞系NOZ中Wnt/β-catenin信號通路的結(jié)果

采用Western blot方法檢測膽囊癌細(xì)胞系NOZ在TNF-α 20 ng/mL條件下Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因(cyclinD1、β-catenin、c-myc)的蛋白表達(dá)。與對照組比較,實驗組細(xì)胞(TNF-α 20 ng/mL)中cyclinD1、β-catenin、c-myc基因的蛋白表達(dá)含量升高,使用Wnt通路抑制劑IWR-1+TNF-α(20 ng/mL)處理后, cyclinD1、β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 表明TNF-α可能通過激活Wnt/β-catenin信號途徑促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞NOZ增殖,見圖3。

A: TNF-α(20 ng/mL)處理細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測圖; B: 對照組細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測圖; C: 采用TNF-α(20 ng/mL)+IWR-1處理的流式細(xì)胞儀檢測圖; D: 細(xì)胞周期分布圖。圖2 TNF-α對膽囊癌細(xì)胞NOZ周期的影響

A: Western blot 條帶; B: 各組cyclinD1、β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)。與對照組比較, ??P<0.01, ???P<0.001。圖3 TNF-α及IWR-1對膽囊癌細(xì)胞NOZ中各組不同蛋白表達(dá)情況

2.4 TNF-α對膽囊癌細(xì)胞系NOZ增殖能力的影響

本研究采用平板克隆形成試驗檢測TNF-α對膽囊癌細(xì)胞系NOZ的增殖能力。實驗組細(xì)胞(TNF-α 20 ng/mL)中膽囊癌細(xì)胞系NOZ克隆數(shù)量大于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。使用Wnt通路抑制劑IWR-1+TNF-α(20 ng/mL)處理后,膽囊癌細(xì)胞系NOZ克隆數(shù)量少于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,TNF-α可能增強(qiáng)膽囊癌細(xì)胞的增殖能力。見圖4。

A: 細(xì)胞克隆圖片; B: 細(xì)胞克隆數(shù)量。與對照組比較, ?P<0.05。圖4 TNF-α及IWR-1對膽囊癌細(xì)胞系NOZ的克隆數(shù)量的影響

3 討 論

膽囊癌是一種高度惡性的腫瘤,預(yù)后不佳。研究[8]表明,膽囊癌的發(fā)生是由多因素參與的多階段復(fù)雜過程。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明,由膽囊或膽囊結(jié)石感染引起的慢性炎癥可增高個體易患膽囊癌的概率。持續(xù)的局部炎癥反應(yīng)可能通過誘導(dǎo)基因改變,促進(jìn)癌細(xì)胞的生存和增殖,抑制凋亡,刺激血管生成和轉(zhuǎn)移,促進(jìn)膽囊癌的發(fā)生和進(jìn)展[9]。然而,膽囊癌的準(zhǔn)確發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前,炎癥已被確定為癌癥的第7個特征[10]。此外,高達(dá)25%癌癥與慢性炎癥有關(guān)[11]。在炎癥介質(zhì)中, TNF-α是一種主要的促炎細(xì)胞因子,在最初的炎癥反應(yīng)中由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,誘導(dǎo)自身分泌并刺激其他炎癥細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生。腫瘤細(xì)胞也可分泌TNF-α, 并與腫瘤發(fā)生有關(guān),包括腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)TNF-α 20 ng/mL處理膽囊細(xì)胞系NOZ后,其生長速度快于對照組細(xì)胞。細(xì)胞周期進(jìn)一步分析提示, TNF-α 20 ng/mL處理后可明顯加速膽囊癌細(xì)胞周期G1→S→G2最終向M期轉(zhuǎn)化。因此,可以推測TNF-α促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞增殖可能與其加速細(xì)胞細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化有關(guān)。

研究[12]顯示,炎癥微環(huán)境中TNF-α可通過多種信號通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖。TNF-α參與許多生理和病理細(xì)胞途徑,包括細(xì)胞增殖、分化和死亡,調(diào)節(jié)不同細(xì)胞和分子的免疫反應(yīng)、腫瘤的局部轉(zhuǎn)移、血管侵襲以及腫瘤的破壞。TNF-α多見于腎細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸腺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和肉瘤,可在一些腫瘤中作為強(qiáng)有力的生物標(biāo)志物和預(yù)后因子[13-14]。TNF-α表達(dá)量的變化及其基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)甚至可能是腫瘤發(fā)展變化中的里程碑性標(biāo)志物[15]。TNF-α被認(rèn)為是腫瘤基因啟動子,并且在結(jié)腸癌和卵巢癌中存在自分泌表達(dá)。在人膽囊癌細(xì)胞系SGC-996中沉默TNF-α顯著抑制了腫瘤的增殖和侵襲,但TNF-α的沉默并不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TNF-α是腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的關(guān)鍵細(xì)胞因子。在胰腺癌的原位小鼠模型中,用TNF-α抗體治療可導(dǎo)致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移減少[16]。在動物胸部腫瘤、皮膚腫瘤和胃腸道腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境中TNF-α的含量有關(guān)[17]。在對前列腺惡性腫瘤的研究[18]中發(fā)現(xiàn), TNF-α的表達(dá)量與惡性程度、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。因此,腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵促炎因子TNF-α通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖對腫瘤的形成和進(jìn)展發(fā)揮作用。

目前研究[19]已證實, Wnt/β-catenin信號通路影響腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移,該信號通路的異常參與了多種癌癥的發(fā)病機(jī)制。β-catenin蛋白是一種與許多癌癥基因有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子, Wnt/β-catenin信號通路的一個標(biāo)志是β-catenin蛋白的穩(wěn)定。最新研究[20-21]證據(jù)表明, Wnt/β-catenin信號的異常促進(jìn)肝癌的發(fā)展,包括肝細(xì)胞癌(HCC)和膽管癌(CCA), 是成人中最常見的2種原發(fā)性肝癌。Wnt/β-catenin通路還可能與許多卵巢癌亞型的致癌作用有關(guān), Wnt/β-catenin靶基因調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡,從而介導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞的啟動和進(jìn)展。Wnt/β-catenin通路在化療耐藥中起重要作用,可以作為卵巢癌化療增敏的靶點。Wnt/β-catenin通路的激活對前列腺細(xì)胞增殖、分化和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有影響[22]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn), TNF-α促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞中cyclinD1、β-catenin、c-myc蛋白的表達(dá)。IWR-1抑制該信號通路后, TNF-α對膽囊癌細(xì)胞促增殖作用明顯降低。Western blot結(jié)果顯示, IWR-1減弱了TNF-α對膽囊癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因cyclinD1、β-catenin、c-myc等蛋白表達(dá)。上述研究表明, TNF-α通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞增殖。

目前, Wnt/β-catenin信號通路被TNF-α激活的分子機(jī)制尚不清楚。作為一種潛在的炎癥因子, TNF-α可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)化療耐藥性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,還可以激活NF-κB信號,上調(diào)趨化因子、生長因子和轉(zhuǎn)錄因子及其他細(xì)胞因子的表達(dá),加速腫瘤的發(fā)生[23-25]。TNF-α的表達(dá)在各種類型的癌癥中顯著增加,并且通常與患者的不良預(yù)后相關(guān),因此TNF-α被認(rèn)為是關(guān)鍵的促腫瘤細(xì)胞因子[24]。此外,研究[26]表明, TNF-α可激活結(jié)腸NCM460s細(xì)胞中NF-κB和Wnt/β-catenin通路。Wnt/β-catenin通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子APC的蛋白水平經(jīng)TNF-α刺激0.5 h后下調(diào),而另一個負(fù)性調(diào)節(jié)因子GSK3β磷酸化水平上調(diào)。然后,在TNF-α誘導(dǎo)的NCM460s細(xì)胞中,可觀察到經(jīng)典Wnt/β-catenin級聯(lián)反應(yīng)中的中心介質(zhì)β-catenin的去磷酸化、積累和核轉(zhuǎn)運。研究[27]發(fā)現(xiàn),膽囊癌細(xì)胞的增殖受多種因素的影響。本研究證實, TNF-α促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖,進(jìn)一步表明靶向TNF-α及其涉及的細(xì)胞內(nèi)途徑可能被證明有助于治療膽囊癌,為人膽囊癌的治療提供了新的分子靶點和用藥新思路。但膽囊癌患者的總體生存率較低,對其發(fā)病機(jī)制和致癌作用的分子研究較少,探討TNF-α對腫瘤細(xì)胞的作用,可以更好地了解炎癥與膽囊癌之間的關(guān)系,改善膽囊癌患者的預(yù)后。TNF-α激活Wnt/β-catenin信號通路的分子機(jī)制需要更深一步的研究,從而可以更加全面了解膽囊癌進(jìn)展的機(jī)制。