短鏈脂肪酸對抗生素相關(guān)性腹瀉的作用及機(jī)制研究

林 麗, 谷翠紅, 王 碩, 黃姝怡, 王麗紅, 張志華

(1. 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科, 河北 承德, 067000;2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 血液內(nèi)科, 河北 石家莊, 050000)

血液腫瘤為起源于造血系統(tǒng)的惡性疾病的總稱,包括白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤及骨髓增殖性疾病等。近年來,隨著放化療、靶向治療、細(xì)胞免疫治療及造血干細(xì)胞移植等方法的應(yīng)用,血液腫瘤患者的預(yù)后大大改善[1]。但放化療可引發(fā)中性粒細(xì)胞減少,免疫抑制劑靶向藥物相關(guān)的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞功能異常等大大升高患者感染率,嚴(yán)重影響預(yù)后。針對血液腫瘤合并感染情況,廣譜抗生素為首選的治療手段[2]。抗生素相關(guān)性腹瀉(AAD)是廣譜抗生素治療血液腫瘤感染的主要并發(fā)癥,發(fā)生率近40%,常伴有腸道菌群及代謝物的變化[3]。目前, AAD尚無理想的治療藥物,臨床一般采用支持治療、益生菌制劑及糞便移植治療等重建腸道微生態(tài)平衡,但療效有限且具有潛在的副作用[4]。

研究[5]表明,發(fā)生AAD時,腸道菌群變化使得代謝物如短鏈脂肪酸(SCFAs)的含量明顯下降。SCFAs作為腸道厭氧菌發(fā)酵抗性淀粉及膳食纖維等產(chǎn)生的主要代謝物,主要包括乙酸、丙酸、丁酸(三者比例為3∶1∶1)[6], 不僅可作為腸上皮細(xì)胞能量代謝的底物,還可參與維持腸道屏障功能完整性及免疫應(yīng)答功能。多項(xiàng)研究[7-8]顯示,應(yīng)用天然化合物及其成分干預(yù)AAD, 可通過增加產(chǎn)SCFAs菌的豐度而增強(qiáng)腸黏膜屏障功能,減輕腸黏膜損傷,但腸道補(bǔ)充SCFAs對AAD的療效尚未明確。本研究觀察腸道補(bǔ)充SCFAs對AAD大鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度、脾臟指數(shù)、腸道菌群、腸黏膜組織炎癥因子水平及結(jié)構(gòu)的影響效果,探討SCFAs對AAD腸道損傷的作用機(jī)制,以期為血液腫瘤合并AAD的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

鹽酸林可霉素注射液(華北制藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H3020455), 乙酸鈉鹽、丙酸鈉鹽(美國Sigma公司),丁酸鈉鹽(阿拉丁)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

無特定病原體(SPF)級6周齡SD大鼠24只,雌雄各半,體質(zhì)量230～250 g, 購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司,合格證號為SYXK(京)2022-0052。大鼠飼養(yǎng)于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)動物房,室溫20～22 ℃, 12 h黑暗與12 h光照循環(huán)。飼養(yǎng)使用標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料和水,所有動物實(shí)驗(yàn)按照承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.3 方法

1.3.1 AAD大鼠模型制備及分組: 將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d, 灌胃3.0 g/(kg·d)林可霉素注射液,連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)過程中每天觀察大鼠精神狀態(tài)、體毛、飲食、活動度、體質(zhì)量、糞便狀況及尾部肛口潔凈程度等,出現(xiàn)軟便、稀便或黏液視為AAD大鼠模型制備成功。將制備成功的18只AAD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為AAD組、低劑量SCFAs組、高劑量SCFAs組,另將正常大鼠(每天灌胃生理鹽水)設(shè)為對照組,每組6只。對照組、AAD組均灌胃生理鹽水10 mL/(kg·d), 低劑量SCFAs組、高劑量SCFAs組分別灌胃100、150 mg/(kg·d)乙酸+丙酸+丁酸混合液(乙酸∶丙酸∶丁酸比例為3∶1∶1), 所有組別連續(xù)灌胃15 d。

1.3.2 結(jié)腸長度測量和脾臟指數(shù)計(jì)算: 末次給藥后30 min, 安樂處死大鼠,取各組大鼠結(jié)腸和脾臟,用直尺測量結(jié)腸的自然長度; 用濾紙吸干脾臟表面殘血后稱質(zhì)量,脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×10。

1.3.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察: 取部分病變結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛中固定、脫水、包埋、切片、脫蠟,行蘇木精-伊紅(HE)染色,二甲苯透明,中性樹脂封片,于顯微鏡下拍照觀察。

1.3.4 結(jié)腸組織炎癥因子水平檢測: 采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測結(jié)腸組織炎癥因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)水平,取部分病變結(jié)腸組織,以Trizol法提取各組結(jié)腸組織總RNA, 將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 隨后進(jìn)行qPCR, 反應(yīng)所需引物序列見表1, 采用2-△△Ct法進(jìn)行mRNA相對表達(dá)量分析。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.5 結(jié)腸杯狀細(xì)胞觀察: 取部分病變結(jié)腸組織,脫蠟前步驟同“1.3.3”, 經(jīng)阿利新藍(lán)染液浸染、PAS氧化劑氧化、Schiff染色液浸染,蘇木精染色液染核,酸性分化液分化,Scott藍(lán)化液返藍(lán),逐級常規(guī)乙醇脫水,二甲苯透明后以中性樹膠封固,于鏡下觀察結(jié)腸杯狀細(xì)胞。

1.3.6 結(jié)腸內(nèi)容物革蘭染色: 取各組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物直接涂片,自然干燥,進(jìn)行革蘭染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠精神活動狀況、體質(zhì)量比較

對照組大鼠活潑好動,毛發(fā)有光澤,二便正常,飲水和進(jìn)食正常; AAD組大鼠行動遲緩,毛發(fā)粗糙,有輕微脫毛現(xiàn)象,體質(zhì)量增長緩慢,飲水量增加,進(jìn)食量減少,糞便稀軟,不成形,呈爛泥狀; 低劑量SCFAs組、高劑量SCFAs組大鼠活動較少,毛發(fā)略有光澤,進(jìn)食較少,體質(zhì)量增長,飲水量正常,偶見軟便。

給藥15 d時,與對照組比較, AAD組大鼠體質(zhì)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與AAD組比較,低劑量SCFAs組、高劑量SCFAs組大鼠體質(zhì)量均增加,且呈劑量依賴性趨勢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較 g

2.2 各組大鼠結(jié)腸長度、脾臟指數(shù)比較

與對照組比較, AAD組大鼠結(jié)腸長度減少,脾臟指數(shù)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與AAD組比較,低劑量SCFAs組、高劑量SCFAs組大鼠結(jié)腸長度增加,脾臟指數(shù)降低,且呈劑量依賴性趨勢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸長度、脾臟指數(shù)比較

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)比較

對照組: 黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整,腸腺豐富,排列緊密,形態(tài)正常,固有層少量炎性細(xì)胞浸潤,未見其他明顯異常; AAD組: 腸腺排列疏松,黏膜固有層內(nèi)較多炎性細(xì)胞浸潤; 低劑量SCFAs組: 少量黏膜上皮細(xì)胞脫落,局部腸腺排列疏松,固有層內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤; 高劑量SCFAs組: 黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整,腸腺數(shù)量豐富,排列緊密,形態(tài)正常,炎性細(xì)胞浸潤較AAD組減少,見圖1。由此表明, SCFAs可改善AAD大鼠結(jié)腸組織形態(tài),且呈劑量依賴性趨勢。

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織炎癥因子水平比較

與對照組比較, AAD組IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA相對表達(dá)量均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與AAD組比較,低劑量SCFAs組、高劑量SCFAs組IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA相對表達(dá)量均降低,且呈劑量依賴性趨勢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞比較

與對照組比較, AAD組結(jié)腸組織內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與AAD組比較,低劑量SCFAs組、高劑量SCFAs組結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞數(shù)量增加,且呈劑量依賴性趨勢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表4、圖3。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果(HE染色法,放大100倍)

2組比較, ?P<0.05。圖2 各組大鼠結(jié)腸組織炎癥因子水平

表4 各組大鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞比較

2.6 各組大鼠結(jié)腸組織內(nèi)容物革蘭染色結(jié)果比較

與對照組比較, AAD組革蘭陰性桿菌比例下降,革蘭陽性桿菌比例升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與AAD組比較,低劑量SCFAs組、高劑量SCFAs組革蘭陰性桿菌比例升高,革蘭陽性桿菌比例下降,且呈劑量依賴性趨勢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表5。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞觀察結(jié)果(AB/PAS染色法,放大100倍)

表5 各組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物革蘭染色結(jié)果比較 %

3 討 論

血液腫瘤指不同分化階段的造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞異常克隆增殖的異質(zhì)性腫瘤,約占全球癌癥的6.5%[9]。隨著放化療、造血干細(xì)胞移植、靶向治療、生物治療、細(xì)胞治療等治療方式的出現(xiàn),近年來血液腫瘤患者的5年生存率大大提升。然而放化療相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少和中心靜脈導(dǎo)管、免疫抑制劑、靶向藥物相關(guān)的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞功能障礙,使得1/3的患者易合并血流感染[10]。應(yīng)用抗生素是預(yù)防或治療血液腫瘤治療相關(guān)感染的一線方案,但可能引發(fā)AAD等并發(fā)癥。AAD的發(fā)病率與抗生素使用時間及抗菌譜呈正相關(guān),與年齡呈負(fù)相關(guān)[11], 若不及時治療,還可導(dǎo)致偽膜性腸炎等,致死率近1/4[12]。

栗沖[13]觀察132例應(yīng)用抗生素的血液腫瘤患者發(fā)現(xiàn)AAD的發(fā)生率為18.94%, 與ZHANG N等[14]報道的AAD患病率(5%～30%)相符。YUSUF K等[15]發(fā)現(xiàn),廣譜抗生素所致AAD的發(fā)生率為窄譜抗生素的10～70倍,且以第3代頭孢菌素類、克林霉素類、氟喹諾酮類抗生素最為常見。超高效液相色譜串聯(lián)法檢測結(jié)果顯示,發(fā)生AAD的血液腫瘤患者結(jié)腸內(nèi)容物SCFAs如乙酸、丙酸、丁酸含量明顯下降。基于此,本研究擬通過林可霉素注射液建立AAD大鼠模型,觀察腸道補(bǔ)充SCFAs對AAD大鼠腸道黏膜的可能影響。

本研究結(jié)果顯示,應(yīng)用林可霉素灌胃的大鼠出現(xiàn)糞便含水量增加,體質(zhì)量增長緩慢,飲水量增加,排便次數(shù)增加,水樣便,肛周糞便黏附,精神萎靡,提示AAD大鼠模型制備成功; 分別給予100、150 mg/(kg·d) SCFAs(乙酸+丙酸+丁酸混合液,比例為3∶1∶1)后, AAD大鼠的進(jìn)食量、日常活動、體質(zhì)量、糞便性狀、糞便含水量等不同程度地改善,初步提示SCFAs具有減輕AAD大鼠腹瀉的效果。

AAD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前多認(rèn)為與抗生素的應(yīng)用導(dǎo)致腸道生物屏障紊亂有關(guān),腸黏膜屏障由化學(xué)屏障、生物屏障、免疫屏障和機(jī)械屏障組成,腸道生物屏障紊亂可破壞腸道化學(xué)屏障及機(jī)械屏障,使腸黏膜通透性增加,便于條件致病菌侵入黏膜固有層,激活免疫屏障,釋放大量炎性細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α、IL-1β等,進(jìn)一步加重腸黏膜屏障破壞程度[16-17]。本研究給予大鼠林可霉素灌胃后,結(jié)腸組織HE染色可見黏膜損傷,炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA相對表達(dá)量明顯升高, AB/PAS染色示杯狀細(xì)胞數(shù)量減少,黏膜屏障功能受損,革蘭染色結(jié)果示存在菌群失調(diào),從微觀角度進(jìn)一步證實(shí)AAD大鼠制備成功,腹瀉的發(fā)生伴隨腸黏膜屏障功能的降低。SCFAs作為腸道厭氧菌發(fā)酵膳食纖維的代謝產(chǎn)物,在調(diào)節(jié)腸道能量代謝、維護(hù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)、激發(fā)腸道免疫反應(yīng)和促進(jìn)電解質(zhì)與水吸收方面起著重要作用[18]: ① SCFAs是腸道陰離子的主要提供者,通過質(zhì)子化方式擴(kuò)散進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)釋放H+而降低腸道pH值,可抑制志賀菌屬、大腸埃希菌、沙門菌等致病菌或條件致病菌繁殖(適宜生長pH值為6.0～7.0),促進(jìn)益生菌定植生長(益生菌如乳酸菌的適宜生長pH值為4.0)并保護(hù)腸道; ② SCFAs通過促進(jìn)組蛋白乙酰化,激活過氧化物酶增殖體激活受體等方式作用于淋巴細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞,抑制致炎因子釋放,抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖和激活,調(diào)節(jié)趨化反應(yīng),促進(jìn)抗菌肽產(chǎn)生等途徑發(fā)揮緩解炎癥、調(diào)節(jié)腸道免疫的作用。相關(guān)研究[19]亦指出,腸道菌群紊亂相關(guān)疾病可通過增加腸道SCFAs濃度的方法治療,如調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)、口服益生菌、糞便移植等,但上述治療方法因各有弊端未能被廣泛應(yīng)用于臨床[20]。本研究采用2種劑量的SCFAs對ADD大鼠連續(xù)灌胃15 d后, HE染色示黏膜層炎癥細(xì)胞浸潤減少,炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA相對表達(dá)量明顯下降, AB/PAS染色示杯狀細(xì)胞數(shù)量增加,黏膜屏障恢復(fù),革蘭染色結(jié)果示菌群失調(diào)情況明顯改善,提示腸道補(bǔ)充SCFAs有助于增加杯狀細(xì)胞數(shù)量,降低炎癥因子水平,增強(qiáng)腸黏膜屏障功能,恢復(fù)腸道菌群。ICHIKAWA H等[21]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)口或直腸補(bǔ)充SCFAs可促進(jìn)大鼠腸上皮細(xì)胞增殖。SUZUKI T等[22]認(rèn)為,結(jié)腸高濃度SCFAs可增強(qiáng)盲腸的屏障功能。研究[18]顯示,口服SCFAs在被結(jié)腸細(xì)胞利用前不受肝臟等消化因子的影響,提示口服SCFAs的效果明顯優(yōu)于口服益生菌。

綜上所述,SCFAs干預(yù)有助于促進(jìn)AAD大鼠腸道屏障功能恢復(fù),這可能與SCFA調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子,改變腸道菌群組成,減輕AAD所致腸黏膜損傷有關(guān),提示血液腫瘤患者在飲食中補(bǔ)充SCFAs或可減輕AAD癥狀。盡管AAD由廣譜抗生素引發(fā),但亦不能排除血液腫瘤對腸道功能的影響,而本研究中AAD大鼠無腫瘤病變,未來有必要制備荷瘤AAD動物模型進(jìn)一步深入研究加以驗(yàn)證。