凋亡蛋白Caspase-9/Caspase-3在慢性間歇性低氧模型小鼠肝損傷中的作用

余孝海　劉國瑩　鐘明奎

摘要：目的探索凋亡蛋白Caspase-9/Caspase-3在慢性間歇性低氧模型小鼠肝損傷中的作用。方法將雄性C57小鼠隨機分為正常氧對照組（Sham）、慢性間歇性低氧組（CIH），CIH組小鼠放入低氧倉進行間歇性低氧處理（8 h/d，連續28d）。4周后HE 染色顯微鏡下觀察肝部病理形態學改變，比較兩組小鼠血清指標白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平。用Western blot檢測小鼠肝組織中凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的水平。結果與Sham組相比，CIH組肝組織形態學病理改變受損嚴重，白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平顯著升高；凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的表達上調。結論慢性間歇性低氧引起肝損傷，機制可能與凋亡蛋白上調相關。

關鍵詞：慢性間歇性低氧，肝損傷，凋亡蛋白

中圖分類號：R531.8

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9545（2023）03-0102-（05）

DOI：10.19717/j.cnki.jjun.2023.03.019

間歇性低氧（chronicinter—mittent hypoxia，C1H）是阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）最為典型的病理生理特征，OSAS可以引起代謝綜合征損傷多種器官^[1]。氧化應激是指體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）與抗氧化劑和活性氮之間的一種動態平衡被打破。缺血再灌注模型可以模擬OSAS患者睡眠中反復出現的缺氧-復氧損傷，缺氧-復氧破壞了患者體內抗氧化劑和促氧化劑平衡系統，體內過量產生ROS，從而導致過氧化損傷^[2]。缺氧還可以造成引起慢性炎癥，慢性炎癥也是OSAS重要的病理生理學特征。OSAS引起的CIH在體內可過量產生ROS，ROS的過度激活主要是兩方面參與機體調節，一方面參與體內氧化應激反應，另一方面可以作為第二信使，可以激活低氧誘導因子-1α和核因子kB（Nuclear Factor-kB ，NF-kB）等核轉錄因子，NF-k B通路是比較常見的炎癥信號通路，同時可以使白介素IL-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子TNF-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）活化，引發炎癥反應^[3，4]。 同時有研究顯示，CIH可以促進非酒精性肝病（nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD）患者的病情變化，從脂肪肝不斷進展為肝硬化、甚至是肝癌。即使是沒有伴隨NAFLD大鼠，CIH也可通過促進一系列炎癥反應，從而調控炎癥因子活性，一定程度造成肝損傷^[5-6]。氧化損傷與細胞凋亡有很大關系，氧化損傷是導致肝損傷的原因之一。該研究目的是建立慢性間歇性低氧模型，觀察慢性間歇性低氧時凋亡蛋白在肝臟損傷中的作用，探討慢性間歇性低氧模型（CIH）小鼠對肝損傷機制。

1.1 材料

1.1.1 動物 實驗動物清潔級雄性C57小鼠，（n=16，體重=27±4g），由安徽長臨河醫藥科技有限公司，按照安徽醫科大學實驗動物保護條例執行，并嚴格遵守，合格證號 Scxk（皖）2017-001。實驗小鼠被養在標準籠中，每籠不超過8只，12 h暗光循環保證晝夜節律，飼養期間不干預小鼠進食和飲水，動物房環境保持良好的通風和溫濕度條件。自由進水和實物充分，室內溫度保持18～25℃，小鼠的使用嚴格執行《中華人民共和國實驗動物管理條例》。

1.1.2儀器 測氧儀（CYS-1型，購自南京新飛分析儀器公司）；液氮罐（醫用，成都金鳳液氮容器有限公司）；酶標儀（南京德鐵實驗公司）。

1.1.3 試劑 壓縮氧氣（濃度大于99. 9%） 、壓縮氮氣（濃度大于99. 99% ，高純氮氣） 都是由合肥市醫用氧氣廠提供；谷丙轉氨酶（glutamie-pyruvic transaminase，ALT）（長春匯力公司）、谷草轉氨酶（glutamic-Oxalacetie transaminase AST）；（長春匯力公司）；Caspase3 antibody、Caspase9 antibody（博奧森生物技術有限公司）。白介素-l（interleukin-1，IL-1），白介素-6（interleukin-6，IL-6）（北方生物公司）。

1.2方法

1.2.1慢性間歇性低氧模型的制備和分組 小鼠在飼養一周后進行實驗，隨機分成Sham組、CIH組，每組均為8只。該實驗的原理是利用氮氣稀釋原理，對照該實驗室先前的造模方法，將實驗組小鼠輕輕放入含有測氧儀探頭的低氧艙內，實時顯示數據，通過測氧儀探頭監測氧濃度，通過兩個旋鈕調節氧氣和氮氣氣體流量，氧濃度始終控制在6～21%范圍內。氧氣和氮氣由兩個旋鈕閥門控制，一個循環時間為9 min，先充入氮氣4 min ，使低氧艙內的氧濃度下降到約6% ，保持約 40 s ；隨即充入氧氣5 min ，氧濃度恢復至最高約21%，保持約 40 s，循環往復周期，每天8 h（ 9∶00 am～5∶00 pm） 共28d。造模第28d之后，將小鼠處死，進行下一步實驗。

1.2.2體重的測定 低氧模型制備完成之后，首先進行小鼠體重測量。

1.2.3 組織學觀察小鼠的肝臟 小鼠的肝組織被清水洗滌之后，用濾紙包裹吸干，多聚甲醛對其進行沖洗，同時準備含有多聚甲醛溶液的試管，在其中固定，實驗室脫水機脫水之后，石蠟包埋技術將肝組織包埋成蠟塊以備后期觀察，將肝臟蠟塊標本切成4μm 薄片，隨即放入溫水中任其自由展開，展開后用載玻片撈出，放入90℃烘烤箱中，約20 min后進行脫蠟，準備染色并封片，用光學顯微鏡下放大200倍觀察肝臟部病理改變，同時截圖留存。

1.2.4 血清指標的檢測 實驗結束后，采用眼球取血，提前加入抗凝劑，離心后提取血清，ALT和AST水平采用化學法測定，放射免疫分析法檢測測定IL-1、IL-6水平，具體操作參照相應試劑盒說明。

1.2.5 小鼠肝臟凋亡蛋白的測定 小鼠處死后，在冰盤上取出肝臟，取適量肝臟組織與對應劑量的RIPA裂解液在研缽器中充分研磨，裂解液的成分為：150 mol/L NaCl、50 mol/L Tris·base、1% NP-40、50 mol/L NaF、1% PMSF，充分研磨成勻漿后，放在4℃冰箱里，10min離心，用槍頭提取上清液，分別裝于準備好的EP管中，臨時保存于-20℃冰箱中。

1.4統計學處理 實驗結果x-±s表示，用SPSS 26.0軟件對數據做統計分析兩組之間的比較采用配對t檢驗，多組之間的比較選用單因素方差分析（ANOVA），p＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1慢性間歇性低氧對小鼠肝細胞結構的影響 正常組在顯微鏡下肝臟組織細胞形態正常，排列整齊，大小規整，細胞無明顯變性及壞死情況。顯微鏡下低氧組肝臟組織中肝細胞腫大及空泡化明顯，細胞排列紊亂無序，有細胞出現變性及壞死，有炎癥細胞聚集現象。

2.2慢性間歇性低氧對小鼠體重的影響 與Sham組相比，間歇性低氧28d后，CIH組小鼠體重[（25.53±1.49）vs（21.28±1.77），p＜ 0.05，]明顯減輕，見圖 2。

2.3慢性間歇性低氧對小鼠肝臟生化血清指標的影響 肝臟生化血清指標顯示CIH組ALT水平[（37.63±9.89）vs（63.06±11.79），p＜0.05]，AST水平[（88.74±13.56）vs（157.56±20.96），p＜0.05]顯著高于Sham組，見圖3。

2.4 慢性間歇性低氧對凋亡蛋白的影響 與Sham組相比，間歇性低氧28d后，CIH組凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9的蛋白表達上調，見圖4。

2.5 慢性間歇性低氧對小鼠肝臟生化血清指標IL-1、IL-6的變化

血清指標顯示CIH組IL-1水平[（94.13±24.07）vs（134.06±21.02），p＜0.05]，IL-6水平[（61.99±7.66）vs（140.06±20.30），p＜0.05]顯著高于Sham組，見圖5。

3討論

OSAS以CIH最為典型病理生理學特征之一，是一種危險性比較高的疾病類型，OSAS可引起高血壓、糖尿病和代謝綜合征等多種疾病。根據最新研究調查顯示：大概35～45％的肥胖患者伴有OSAS，超過4％的普通人群也患有OSAS^［7］。實驗發現經過間歇性低氧處理28 d后，CIH組肝臟組織中肝細胞腫大及空泡化明顯，細胞排列紊亂無序，有細胞出現變性及壞死，有炎癥細胞聚集現象，顯微鏡下CIH組肝組織形態學病理改變受損嚴重，白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平顯著升高；凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的表達上調，結果提示慢性間歇性低氧引起肝損傷，機制可能與凋亡蛋白上調相關。間歇性低氧一段時間后小鼠體重降低，由于低氧環境對小鼠產生應激反應，小鼠減少攝食，導致體重減輕。有關文獻研究發現：間歇性缺氧可通過誘導脂代謝紊亂導致脂肪肝的發生，脂代謝紊亂導致脂肪肝的發生同低氧水平呈正相關^［8-9］。CIH的最典型特征是機體不斷發生的血氧去飽和，同時ROS產生的重要來源也可以是組織氧利用度的振蕩不斷變化，機體在過氧化物與抗氧化物的相互失衡可產生過量的ROS，ROS的產生引起氧化應激反應，氧化應激可通過DNA損傷、細胞功能障礙、誘導凋亡、信號通路的激活等一系列途徑加重肝損傷。細胞內線粒體作為維持細胞基本功能的關鍵細胞器，很容易不同程度上受到氧化應激的影響，線粒體功能異常會進一步促進內源性的 ROS 產生^［10］，氧化損傷與細胞凋亡有很大關系，氧化損傷與肝損傷密切相關，Caspase-9是誘導細胞凋亡經過線粒體途徑的主要指標之一，Caspase-9被激活后促進慢性間歇性低氧誘導肝細胞凋亡，Caspase-3在各種凋亡方式中扮演了執行小分子，所以它被認為是細胞凋亡的標志，同時Caspase-9被激活后引起一系列反應，下游Caspase-3被激活，通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，從而導致肝損傷^［11-13］。OSAS對肝臟的損傷主要是病理性改變，表現為肝臟出現不同程度的損傷、炎癥、纖維化等^［14］。HIF是在缺氧情況下機體內重要轉錄因子，分為α亞基和β亞基，α亞在低氧環境下，一般結構穩定，而在常氧環境下不穩定而降解，與β亞基結合而發揮相應作用，缺氧時，由于HIF-1αm RNA表達增加，增加HIF-1α活性及相關蛋白穩定性，重新獲得氧氣后HIF-1α蛋白降解，HIF-1α和其結合序列多種基因作用來完成細胞缺氧反應性的調節^[15]。

細胞發生凋亡的過程中，有Caspase依賴機制，也有非Caspase依賴機制。陳素艷等^[16]對缺血再灌注模型取樣后，檢測腦組織凋亡相關蛋白Caspase-9和Caspase-3m RNA水平，提示凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3 m RNA的水平上調在48 h達到頂值，然后不斷下降，研究表明缺血再灌注模型大鼠神經損傷與凋亡蛋白上調密切相關，凋亡蛋白Caspase是凋亡中重要的分子。本研究發現，小鼠慢性間歇性低氧28 d后，間歇性低氧組肝組織形態學病理改變受損嚴重，白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平顯著升高，凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的表達上調，提示慢性間歇性低氧引起肝損傷，機制可能與凋亡蛋白上調相關。凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9可能參與慢性間歇性低氧引起肝損傷。

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（責任編輯 胡安娜）