miRNA-223在老年人非酒精性脂肪肝患者中的表達變化及診斷價值

張穎,童依麗,劉雪靜,潘逸茹,保志軍, 2

1. 復旦大學附屬華東醫院消化科,上海 200040; 2. 上海市老年醫學臨床重點實驗室,上海 200040; 3. 復旦大學附屬華東醫院檢驗科,上海 200040

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一類與胰島素抵抗(insulin resistance, IR)密切相關的代謝應激性肝損傷性疾病[1],可進一步發展為非酒精性脂肪性肝硬化以及原發性肝癌。NAFLD的發病具有顯著的年齡相關性,流行病學調查結果顯示,我國NAFLD患病率為20.09%, 60歲以上的老年人群患病率高達44.43%[2]。然而對老年NAFLD的認識及其危害性并沒有得到足夠重視,尋找一個簡便有效的診斷方法進行早期干預治療尤為重要。

微小RNA(microRNA, miRNA)作為一種重要的轉錄后調節因子,在肝臟脂質代謝、胰島素抵抗以及衰老等生物學過程中發揮特有的調控作用[3]。高通量測序結果發現并證實, miR-223在衰老NAFLD大鼠肝組織中的表達顯著上調[4]。但是關于miR-223在胰島素抵抗中的應用研究報道較少。本研究基于前期實驗結果,探討分析血清miR-223在老年NAFLD患者中的表達變化及其潛在的臨床意義和診斷價值,為老年人NAFLD的早期診斷和早期預防提供理論依據。

1 資料和方法

1.1研究對象2019年5月—2020年10月復旦大學附屬華東醫院消化科和老年科具備完整病史資料的非酒精性脂肪肝門診和住院病例(NAFLD組),年齡≥65歲,共80例,診斷標準和排除標準參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南(2018年更新版)》[1]。選擇我院同期體檢的非脂肪肝老年人80例為對照組。所有受試者均經B超檢查,并測量身高、體重,計算體質量指數(BMI)(BMI=體重/身高2)。其中NAFLD組男57例(71.3%),女23例(28.7%),年齡65～89歲,平均(76.3±5.4歲);對照組男60例(75.0%),女20例(25.0%),年齡65～88歲,平均(75.5±6.0歲)。2組性別、年齡無統計學差異(P>0.05),具有可比性(表1)。本研究經復旦大學附屬華東醫院倫理委員會審查批準(20170078),入組人群均知情同意。

表1 2組一般資料比較(n=80)

1.2標本采集及常規生化檢測清晨空腹采血, 3500rpm離心10min,取上清液,全自動生化分析儀檢測肝功能(ALT、 GGT)、血糖(FPG)、血脂(TG、 Ch、 LDL、 HDL)。剩余血清-80 ℃保存以備用。

1.3瞬時彈性成像技術(Fibroscan)檢測受試者取仰臥位,右手抱頭, Fibroscan-520機型檢測儀(Echosens公司,法國)測定受控衰減參數(controlled attenuation parameters, CAP)。由同一名經驗豐富的臨床醫師使用M型探頭在患者右側腋中線第7～9肋間進行測量,連續有效檢測10次,取中位數為最終測定結果。

1.4實時定量PCR法檢測血清miR-223表達水平按血清RNA抽提試劑盒(TIANGEN公司,北京)操作說明書提取總RNA, NanoDrop超微量分光光度計(Thermo公司,美國)檢測RNA濃度,吸光度(OD260/OD280)比值在1.8～2.0時,說明提取的RNA純度高,無蛋白質殘余。按逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司,日本)說明書進行逆轉錄, cDNA保存于-20℃。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為:F: 5′-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3′, R: 5′-CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′, GADPH為內參。將逆轉錄產物稀釋至2倍作為模板進行實時定量PCR檢測,反應體系為20 μl。反應條件:50 ℃預變性30 s, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,共40個循環。實時定量PCR結果以Ct值(Cycle threshold)表示, miR-223相對表達量采用2-ΔΔCT法計算。每個樣本重復3次。

2 結果

2.1一般資料比較表1可見老年NAFLD組合并高血壓、糖尿病者高于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2血清生化指標比較與健康對照組相比, NAFLD組BMI、 ALT、 GGT、 TG、 Ch、 FBG增高(P<0.05), HDL降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組各項檢測指標比較

2.3Fibroscan檢測結果比較NAFLD組CAP值高于對照組,差異有統計學意義(t=11.895,P=0.001)。見表2。

ALT丙氨酸氨基轉移酶, GGT γ-谷氨酰轉肽酶, TG甘油三酯, Ch膽固醇, LDL低密度脂蛋白, HDL高密度脂蛋白, FBG空腹血糖。

2.4miR-223在2組患者血清中的表達變化實時定量PCR結果顯示, NAFLD組患者血清miRNA-223表達水平高于對照組,差異有統計學意義(0.92±0.60) vs (0.40±0.29),t=3.175,P=0.003)見圖1。

圖1 miR-223在老年NAFLD患者血清中的表達

2.5miR-223與各指標的相關性分析Pearson相關分析結果顯示, miRNA-223與TG(r=0.387), LDL(r=0.363), HDL(r=0.394)呈正相關(P<0.05),而與年齡(r=0.121), BMI(r=-0.151), ALT(r=-0.109), GGT(r=-0.157), Ch(r=-0.108), FBG(r=-0.280), CAP(r=0.109)無相關性(P>0.05),見表3。

表3 miR-223與各指標的相關性分析

2.6血清miR-223對老年人NAFLD的診斷價值ROC曲線分析結果顯示, AUC為0.809(95%CI: 0.675～0.943,P=0.001),見圖2。

圖2 ROC曲線圖

3 討論

miRNAs是一類大小為21～23nt (nucleotide)的單鏈小分子RNA,與靶基因mRNA 3′端非翻譯區(3′UTR)完全或不完全互補結合,在轉錄或轉錄后水平對mRNA進行轉錄抑制或促使其降解,影響目標mRNA的穩定性及翻譯,從而達到調控靶基因表達的目的[3]。已有報道證實, miR-34a、 miR-155、 miR-122在人類NAFLD肝組織中表達異常,這些miRNAs可能通過打破胰島素代謝以及調節膽固醇和脂肪酸之間的平衡,參與了NAFLD的發生與發展[3,5,6]。但是這些研究樣本量少,缺乏對老年NAFLD患者的獨立研究以及長期隨訪追蹤,存在一定程度的局限性。

本課題組在前期的動物實驗中已經發現并證實[4], miR-223在衰老大鼠脂肪肝組織中表達明顯上調。miR-223定位于X染色體,最早在造血系統得到確認,在促進造血干細胞的增殖分化中起了重要的調控作用[5]。后續研究陸續報道, miR-223在胃癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤組織,以及類風濕性關節炎、骨關節炎等免疫炎癥性疾病等多種疾病中同樣起著重要的調控作用[7-8]。然而關于miR-223在NAFLD以及胰島素抵抗中的作用報道甚少,僅有幾篇文章提示miR-223在人類和肥胖小鼠中有異常表達[9-10]。

本組課題研究結果表明,老年NAFLD組患者BMI、 CAP值以及血清ALT、 GGT、 TG、 Ch、 FBG水平高于對照組(P<0.05),提示老年NAFLD患者存在明顯的胰島素抵抗。血清miRNA-223在NAFLD患者中呈現高表達水平(P=0.003),提示miRNA-223與老年人胰島素抵抗密切相關,可能參與了老年人NAFLD的發生發展,這與我們前期動物實驗的結果相符[4,11]。進一步所做的直線相關性分析表明,血清miRNA-223的表達與老年NAFLD組TG、 LDL以及HDL水平呈顯著正相關(P<0.05),提示老年NAFLD患者血脂水平的異常可能受到了血清miR-223的調控,血清miRNA-223或可成為老年NAFLD患者更為敏感的檢測指標,為老年人脂肪肝的無創性篩查提供了新的手段。CAP值作為評估肝臟脂肪變的重要參數,在評估包括NAFLD在內的各種慢性肝臟疾病的脂肪變方面已得到廣泛認可[12],但是本組研究結果并未發現miR-223的表達與CAP值有顯著相關性(r=0.109,P>0.05)。ROC曲線分析結果顯示AUC為0.809 (P=0.001),進一步證實血清miR-223對老年NAFLD患者有診斷意義。

綜上所述, miR-223在老年NAFLD患者血清中表達顯著升高,并與TG、 LDL、 HDL呈正相關性。miR-223在循環血液中穩定性表達的特點預示著其可能成為診斷老年人非酒精性脂肪肝的潛在標志物,為老年人早期診斷和早期預防NAFLD提供理論依據。本課題組尚未對患者進行長期追蹤隨訪,后續研究需要更多的樣本量來進行綜合有效地評估,并進一步積極探索miR-223在調控衰老機體脂肪肝變中的發生發展機制。