高強度間歇運動通過miR-124-3p/ERN1軸抑制吸煙相關的老年慢性阻塞性肺疾病炎癥反應的機制

劉盼盼,曾海珠,張美蘭,章華麗,高宏昌,王雨濛,陳果,趙蕾

1. 上海浦東新區公利醫院呼吸與危重癥醫學科,上海 200135; 2. 上海浦東新區公利醫院急診科,上海 200135

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球前三大死因之一[1],我國60歲以上人群中的患病率已超過27%[2],老年COPD患者往往合并高血壓、心功能不全、糖尿病及肌少癥等多系統疾病,盡管現有治療取得了一定進展,但在提高生活質量、降低死亡率方面仍沒有突破,運動訓練可改善運動耐力、調劑免疫功能[3],在老年COPD中開展運動訓練可協同改善機體多系統病變[4]。

運動訓練作為一種炎癥反應的應激因子,可以增強機體的抗炎能力,增加抗炎癥因子表達[5-6]。利用轉錄組學技術對老年COPD患者運動前后的差異基因進行富集分析發現,這些基因主要富集在炎癥反應相關通路中,且有多種微小RNA (microRNA, miRNA)被證明參與肺部炎癥反應[7-9]。其中miR-124-3p,被發現在COPD合并肺動脈高壓的患者中表達水平上調且與肺部炎癥反應相關[10-11]。然而, miR-124-3p在COPD運動訓練治療中的作用和潛在機制尚不清楚。通過生物信息學分析發現ERN1(Endoplasmic Reticulum To Nucleus Signaling 1, ERN1)與miR-124-3p之間存在相互關系。因此,本研究通過分析COPD患者運動訓練前后miR-124-3p, ERN1以及其他分子標志物的表達水平改變及兩者之間的靶向關系,確定miR-124-3p/ERN1軸對COPD的調節機制,旨在為運動訓練改善老年COPD患者預后的作用機制提供可靠的試驗基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2020年11月15日—2021年11月30日于浦東新區公利醫院呼吸科診治的150例患者作為研究對象,分為非吸煙組(非吸煙且肺功能正常者,n=50)和吸煙非COPD組(吸煙且肺功能正常者,n=50)、 COPD組(COPD患者,n=50)。所有研究對象納入標準:年齡≥60歲;意識清楚,能夠執行治療指令;完成肺功能檢測,根據GOLD(慢性阻塞性肺病全球倡議),若FEV1/FVC>70%,則根據吸煙史分別納入非吸煙組和吸煙組(各50例);而吸入支氣管舒張劑后, FEV1/FVC<70%,排除其他肺部疾患則納入COPD組(50例)。排除標準:患有不穩定型心絞痛、藥物未控制的充血性心力衰竭和高血壓病、近期心肌梗塞、重度肺動脈高壓、既往有運動后暈厥史、影響運動的骨關節病、肝腎衰竭晚期、認知功能障礙。

所有入組者均在清晨8點空腹采集5 mL靜脈血,其中COPD患者分別于運動前和運動12周后抽取。血樣用乙二胺四乙酸(EDTA)抽真空管進行存儲,用梯度離心法分離出外周血白細胞及血清,儲存在-80 ℃的條件下備用。所有受試者均簽署知情同意書,本研究經上海市浦東新區公利醫院臨床醫學倫理委員會批準(倫理批號[2020]臨審第014號)。

1.2高強度間歇運動訓練功率及方案實施按照COPD患者的心肺運動功能,制定適合該個體的高強度運動(即△50%功率),△50%功率=(無氧閾測定功率+極限運動測定功率)/2-功率遞增速率×0.75±10。運動方案[12]:每天1 h(分2～3次完成),每周5次,共12周。運動期間無法維持轉速 (55～65 r·min-1)或肺部出現明顯哮鳴音或Borg疲勞評分大于14則需暫停運動,等待下一個開始指令。

1.3香煙顆粒制備及細胞培養用恒速真空泵將卷煙煙霧抽吸到10 mL RPMI1640介質中,通過0.22μm過濾器進行滅菌。獲得的CSE溶液在1 h內用于試驗。氣道上皮細胞(16HBE)購自中科院上海細胞研究所,使用添加10%牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養基,在37 ℃ 5% CO2培養箱中培養及轉染。

1.4細胞培養及轉染氣道上皮細胞(16HBE)購自中科院上海細胞研究所,使用添加10%牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養基,在37 ℃ 5% CO2培養箱中培養。利用pcDNA, pcDNA-ERN1及miR-124-3p模擬物, miR-124-3p抑制劑分別調節ERN1或miR-124-3p的表達水平,在細胞對數生長期轉染到16HBE細胞中。該序列購自GenePharma (Shanghai, China)。轉染試劑為lipofectamine 3 000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),按照試劑盒說明書進行操作。

1.5qRT-PCR檢測提取總RNA,利用逆反應試劑盒合成cDNA后在7500實時PCR系統上使用SYBR green I Mater Mix試劑盒(Invitrog)進行qRT-PCR。通過相對定量(2-△△Ct法)計算倍數變化。PCR引物描述如下: miR-124-3p:正向5′-ATGTTCACAGCGGACCTTGAT-3′和反向5′-TTCACCGCGTGCCTTAATTG-3′; ERN1:正向5′-GAGATGTGGCCCTGAAACCT-3′和反向5′-AGCAAGCTCATCCGGTGAAA-3′; β-actin:正向5′-GCCAACCGTGAAAAGAT-3′和反向5′-AGAGCATAGCCCTCGTAGAT-3′; U6:正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)通過測定細胞培養上清中促炎細胞因子的水平來分析細胞模型的炎癥反應。ELISA試劑盒(博斯特生物技術公司,中國武漢)用于檢測白細胞介素(IL)-1β、 IL-6、 IL-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平,按照參照試劑盒說明書進行操作。

1.7細胞活性及凋亡測定將對數生長期的16HBE細胞接種于96孔板中,每孔2×103培養48 h后,加入10 μLCCK-8試劑(上海Beyotime),避光孵育2 h后使用Bio-Rad酶標儀測定吸光度值(波長490 nm)。使用FITC-AnnexinV凋亡檢測試劑盒(BD)測定細胞凋亡,按照說明書步驟將不同處理后的細胞收集離心,用PBS沖洗后在室溫下用膜聯蛋白V(AnnexinV)和碘化丙啶(PI)在室溫下避光孵育10 min,用FACS Calibur流式細胞儀(BD)檢測細胞凋亡率。

2 結果

2.13組人口學特點比較非吸煙組、吸煙組、 COPD組年齡、性別構成、 BMI及吸煙史等差異無統計學意義(P>0.05);組間兩兩比較, FEV1/預計值、 FEV1/FVC差異均有統計學意義(P<0.001); COPD組肺功能1級3例, 2級27例, 3級20例。

2.2COPD患者血清miR-124-3p及相關炎癥因子表達水平比較與非吸煙組比較,吸煙組患者血清miR-124-3p表達水平降低,而COPD組則更低(P<0.001,圖1A)。肺功能3級患者血清miR-124-3p的表達較1～2級患者明顯降低(P<0.001,圖1B),但是miR-124-3p的表達水平與肺功能無明顯相關性(r=-0.1148,P>0.05)。COPD患者血清TNF-α、 IL-6表達水平高于吸煙組及非吸煙組(P<0.05),提示運動可下調TNF-α、 IL-6表達水平(圖1C)。

注: (A) 吸煙非COPD組與非吸煙組比較, miR124-3p低表達,與非吸煙組比較, COPD組的miR124-3P表達水平更低。(B)肺功能3級COPD患者的血清miR124-3p低于1～2級的患者。(C) 與非吸煙組相比, COPD組外周血中的TNF-α表達增高,而吸煙組, COPD運動訓練后的表達差異無統計學意義(P>0.05);與吸煙組比較, COPD患者的TNF-α表達水平增高,運動訓練后降低(###P<0.001)。COPD:慢阻肺患者; COPD+Exercise: COPD患者運動訓練后; Non-smokers:非吸煙的肺功能正常者; Smokers:吸煙的肺功能正常者。與非吸煙組比較,**P<0.001;與肺功能1-2級組比較,***P<0.001;與吸煙組比較,##P<0.001;與COPD組比較,###P<0.001。

2.3miR-124-3p過表達可減輕香煙煙霧誘導的16HBE細胞凋亡和炎癥反應隨著CSE濃度的增加,細胞內及培養基中miR-124-3p水平逐漸降低,濃度為2%和4%時miR-124-3p水平被顯著抑制(圖2A-B),后續細胞試驗采用2% CSE處理24 h。轉染miR-124-3p模擬物后,細胞及培養液中miR-124-3p水平顯著升高,而轉染抑制劑后,細胞miR-124-3p水平則相反(P<0.01,圖2C)。miR-124-3p過表達顯著促進細胞活力,抑制煙霧誘導的細胞凋亡(P<0.001,圖2D～E, G～L)。CSE促進16HBE細胞釋放IL-6、 IL-8、 IL-1β和TNF-α,而miR-124-3p過表達逆轉了以上趨勢(P<0.001,圖F)。這說明miR-124-3p過表達可抑制CSE誘導的16HBE細胞凋亡和炎癥反應。

注: (A-B)細胞中及培養液中miR124-3P水平隨CSE濃度降低。(C) miR124-3P模擬物轉染細胞后,細胞內和細胞培養液中其表達水平均顯著上調。(D)和(E) miR124-3P過表達可促進細胞活力,抑制煙霧誘導的細胞凋亡。(F) 煙霧可促進16HBE細胞釋放IL-6、 IL-8、 IL-1β和TNF-α,而miR124-3P過表達可逆轉這種作用。(G-L)煙霧刺激誘導細胞凋亡增多, miR124-3P過表達可逆轉這種作用。與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, #P<0.05;與CSE組比較, ###P<0.001。

2.4ERN1是miR-124-3p的下游靶點,可通ceRNA網絡調控發揮作用miR-124-3p與ERN1 3’UTR之間存在互補序列(圖3A)。熒光素酶報告表明,轉染miR-124-3p模擬物顯著促進了與ERN1-Wt共轉染的細胞的熒光素酶活性,而轉染miR-124-3p抑制劑則具有相反的效果(圖3B), ERN1-Mut細胞的熒光素酶活性不受miR-124-3p表達水平的影響(圖3B)。在CSE處理的16HBE細胞中轉染miR-124-3p模擬物后ERN1顯著下調,而轉染miR-124-3p抑制劑后其表達顯著上調(P<0.001,圖3C)。與非吸煙者相比, ERN1在吸煙者中表達較高, COPD中ERN1的表達較吸煙者更高(圖3D)。而運動訓練后COPD中ERN1水平降低,且與miR-124-3p水平呈負相關(r=-0.644,P<0.001)。

注: (A)miR-124-3p與ERN1的3 ’-UTR互補序列。(B)野生型和突變型的細胞中熒光素酶活性的差異。(C)不同處理條件下的ERN1 mRNA表達水平。(D-E)不同血清樣本中ERN1 mRNA水平以及miR-124-3p的表達水平。與對照組和非吸煙組比較, ***P<0.001;與吸煙組比較, ##P<0.05;與COPD組比較, ###P<0.001。

3 討論

老年COPD患者存在多系統共病,導致其生活質量降低,而規律的中高等強度運動可減輕機體抗炎反應、調節免疫代謝狀態,在老年COPD患者中推廣運動訓練是減輕醫療負擔改善預后的重要措施,但運動訓練的作用機制不明。因此明確運動訓練是否通過ceRNA網絡發揮作用將為COPD康復治療提供理論基礎。miR-124-3p產生于多種細胞,其可調節肺血管內皮細胞增殖和炎癥[13]。CSE處理的16HBE細胞和細胞培養液中miR-124-3P水平均降低和炎癥因子增高,說明miR-124-3p參與了吸煙相關的COPD發展。過表達miR-124-3p降低ERN1及相關炎癥因子的水平,而miR-124-3p下調則反之,結合熒光素酶試驗證實ERN1作為miR-124-3p的下游靶點通過ceRNA網絡發揮作用。同時,與非吸煙者相比, ERN1在吸煙者中表達較高, miR-124水平減少;而COPD又較吸煙組更明顯,這與CSE處理的16HBE細胞中觀察到的結果一致(圖2E),而運動訓練則可逆轉miR-124的下調及ERN1的升高趨勢,這說明運動可能通過靶向miR-124-3p抑制ERN1表達,減輕吸煙相關COPD氣道炎癥。

此研究探索了在老年COPD患者中實施高強度運動訓練前后外周血中miR-124-3p, ERN1及炎癥因子的表達水平變化,通過體外試驗驗證miR-124-3p與ERN1的靶向關系,及其參與運動調節COPD機體炎癥的作用機制。但本研究僅在細胞水平進行機制探討,因此存在以下局限:首先本研究僅以煙霧刺激的角度探討了miR-124-3p對機體炎癥的調控,還需進一步小鼠模型驗證;其次僅驗證了調節miR-124-3p對炎癥因子的影響,未驗證ERN1是否可直接調節炎癥因子表達,仍需要進一步的動物實驗及組織表達水平檢測對此結果行進一步驗證。