大鼠股骨線性骨折模型建立方法的比較與優化改良*

侯雪峰 高玉海 柏 鑫 郭建魁 任 莉 吳思敏 陳克明

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院,蘭州 730050)(2.甘肅中醫藥大學,蘭州 730000)

創傷性及應力性骨折等是骨科常見疾病[1],愈合過程復雜且漫長,在研究骨折愈合過程中的骨轉換和骨修復作用以及促進骨折愈合的相關研究有著廣闊的發展前景。近年來,國內外學者對股骨骨折模型進行了諸多探索,Bonnarens等[2]在研究中使用閉合性骨折造模儀建立了小鼠的閉合性骨折模型。此后多數閉合性骨折模型都基于此對骨折造模儀進行優化改良,以達到精簡準確的目的[3-5]。而開放性股骨骨折模型的建立需要通過手術暴露股骨干,通過圓鋸、擺鋸等進行切割后,再使用克氏針進行髓內固定,進而建立股骨骨折模型。而對于髓內針直徑的選擇,國內外研究結果不一,相關研究指出,克氏針進行髓內固定時,其直徑占股骨內徑的85%最為適宜[6]。鑒于目前造模方式方法較多,本研究根據前人研究基礎對大鼠股骨骨折模型進行了諸多探索,包括復制閉合性骨折模型,探討不同型號克氏針內固定對骨折斷端的穩定性,以及對大鼠股骨開放性截骨模型進行優化改良,現通過對本課題組既往研究中采取不同方式方法建立的大鼠股骨骨折模型進行比較研究,客觀評價各種方法建立大鼠股骨骨折模型的穩定性及適用性,以期為骨折研究提供可靠的造模方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:70只SPF級雄性Wistar大鼠,體質量180～200 g,購自蘭州大學實驗動物中心【SCXK(甘)2018-0002】,飼養于中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院實驗動物中心【SYXK(軍)2017-0047】,室溫22～26 ℃,相對濕度40%～70%,使用通用型塑膠籠具飼養,每籠飼養密度不超過10只,大鼠自由攝食飲水,所有操作均符合中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院醫學倫理委員會科研倫理相關要求,倫理審批號:2020KYLL128。整體實驗的研究方法及過程均符合3R原則。

1.1.2主要儀器與試劑:Ysio全自動DR雙板攝影系統(西門子),鈦合金克氏針(張家港市華陽醫療器械廠),自制骨折造模儀、骨科鉆(上海紫靄醫療器械有限公司),可吸收性外科縫線(上海浦東金環醫療用品股份有限公司),注射用青霉素(山東魯抗醫藥股份有限公司)、碘伏皮膚消毒液(上海利康消毒高科技有限公司)、75%醫用乙醇(山東利爾康醫療科技股份有限公司)、0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組:實驗動物根據比較需要將其分為閉合性骨折模型組和開放性骨折模型組,其中閉合性模型組中根據砝碼下落高度分為22 cm組(砝碼下落高度為22 cm)、26 cm組(砝碼下落高度為26 cm)、30 cm組(砝碼下落高度為30 cm),開放性骨折模型組根據克氏針型號不同分為0.8 mm組(使用0.8 mm鈦合金克氏針內固定)、1.0 mm組(使用1.0 mm鈦合金克氏針內固定)、1.2 mm組(使用1.2 mm鈦合金克氏針內固定),又依據固定方式不同分為單純克氏針固定組與克氏針加線固定組。

1.2.2閉合性大鼠股骨線性骨折模型的建立:各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進行麻醉,麻醉后大鼠右側臥位固定,手術區備皮消毒,在膝關節外側做一縱行1 cm切口,暴露股骨遠端和股四頭肌肌腱,將股四頭肌肌腱撥向內側,沿股四頭肌肌腱做一縱行0.3～0.5 cm切口,充分暴露股骨內外髁間溝。將0.8 mm克氏針于股骨內外髁間溝出,穿進髓腔并從梨狀肌窩處穿出。然后將此處皮膚切開0.5 cm切口,將克氏針折彎,剪掉膝關節處多余的克氏針,閉合傷口。將大鼠置于骨折造模儀沖撞臺上,下肢垂直于砧座,使500 g砝碼分別從22、26、30 cm高度下落,使術側股骨骨折(圖1)。

圖1 閉合性骨折模型造模儀器及操作過程Fig.1 Instrument and operation procedure for modeling closed fracture

1.2.3開放性大鼠股骨線性骨折模型的建立:大鼠禁食24 h,麻醉后,術側區域備皮消毒,在股骨外側做一長1.5～2 cm左右的切口。鈍性分離黏膜、肌肉,暴露股骨中段,單純克氏針固定組僅使用1.2 mm克氏針進行髓內固定,克氏針加線固定組除使用1.2 mm克氏針進行髓內固定外,再使用3-0可吸收縫合線對骨折兩斷端進行牽拉固定。術后,使用0.9%氯化鈉溶液將傷口處沖洗干凈,縫合肌肉和皮膚。肌肉注射青霉素,10萬單位/只。術后連續注射3 d,防止感染。大鼠開放性股骨骨折模型建模成功的標準:骨折類型為股骨中段橫斷型骨折或短斜形骨折;骨折斷裂間隙≤0.5 mm;術后骨折對位良好,無移位,無感染及其他并發癥(圖2)。

圖2 開放性大鼠股骨骨折模型制作過程Fig.2 The process of modeling open femoral fracture in rats

1.2.4X線檢查:模型建立后立即對各組大鼠拍攝X線,觀察是否符合骨折造模標準。每2周進行一次X線檢查,檢查時先麻醉大鼠,俯臥位置于X線機下進行拍攝,拍攝條件50～55 kV,5～8 mA。通過X線片觀察骨折類型及各組大鼠的骨痂生長情況,并根據骨痂評分標準對大鼠的骨痂生長情況進行評分。斷端未見骨痂為Ⅰ級。斷端邊緣模糊,少見骨痂為Ⅱ級。斷處邊緣進一步模糊,骨痂量增多但未達到將缺損填滿為Ⅲ級。斷處邊緣已完全消失,缺損被骨痂填滿為Ⅳ級。X線Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級分別記為0、1、2、3分并且計算。

1.2.5HE染色觀察骨折斷端病理學改變:術后8周,依據隨機化原則,分別從單純克氏針固定組與克氏針加線固定組中各抓取3只大鼠,脫頸處死,迅速取出術側股骨,并固定于4%多聚甲醛溶液中24 h,隨后將股骨置于10%EDTA溶液中進行脫鈣處理,每周更換脫鈣液1次,8周后進行石蠟包埋、切片并染色,在顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 X線片比較結果

2.1.1閉合性骨折模型X線結果:X線結果顯示,砝碼下落高度30 cm造模成功率為17%,砝碼下落高度26 cm造模成功率為50%,砝碼下落高度22 cm造模成功率為33%。X線片顯示該造模方式制造的大鼠股骨骨折模型其骨折類型復雜多樣(圖3)。結果提示該造模方式建立閉合性大鼠股骨線性骨折模型成功率較低,總體造模成功率未達到理想狀態。

圖3 大鼠股骨閉合性骨折線片,砝碼500 g,下落高度分別為30、26、22 cm Fig.3 X-ray images of closed femoral fractures in rats were taken with weights of 500 g and falling heights of 30, 26 and 22 cm, respectively

2.1.2不同型號克氏針內固定的開放性骨折模型X線結果比較:X線結果顯示,隨著克氏針直徑的升高,其固定效果也更好,實驗結果表明1.2 mm克氏針較其他兩種型號固定效果更好,并且從X線片觀察到各組骨痂生長情況未表現出明顯差異(圖4)。

圖4 不同型號克氏針內固定的開放性骨折模型X線片Fig.4 X-ray images of open fracture models with different types of Kirschner wire internal fixation

2.1.3單純克氏針固定組與克氏針加線固定組X線結果比較:X線結果顯示,單純克氏針固定組有1只大鼠在造模后第2周克氏針脫出,4只大鼠在造模后第6周時克氏針均有不同程度脫出,其中有2只大鼠的克氏針完全脫出,造成骨折斷端嚴重移位,最終符合實驗標準占比為67%。克氏針加線固定組有1只大鼠在造模后第4周克氏針脫出,骨折斷端成交角移位,最終符合敷衍標準的占比為93%。

2.1.4單純克氏針固定組與克氏針加線固定組骨痂評分結果:比較兩組造模2周和4周后骨痂X線評分情況,結果顯示克氏針加線固定組的評分明顯優于單純克氏針固定組(圖5,6)。

圖5 單純克氏針固定與克氏針加線固定的開放性骨折模型X線片Fig.5 X-ray images of open fracture models with Kirschner Wire fixation and Kirschner wire-sewing threads fixation

注:克氏針加線固定組與單純克氏針固定組的骨痂評分比較,*P<0.05。Note:Comparison of poroma score between Kirschner Wire fixation and Kirschner wire-sewing threads fixation,*P<0.05.圖6 克氏針加線固定組與單純克氏針固定組的骨痂評分比較Fig.6 Comparison of poroma score between Kirschner wire-sewing threads fixation and Kirschner Wire fixation

2.2 單純克氏針固定組與克氏針加線固定組組織形態學比較

HE染色處理結果顯示,治療8周后克氏針加線固定組已經形成骨性連接,骨痂塑性基本完全,骨折斷端以成熟的骨細胞為主,并有少量尚未鈣化完全的骨細胞。而單純克氏針固定組骨橋連結仍以軟骨及纖維連結為主,兩骨折斷端均形成了一定的軟骨,構成假關節樣結構。結果提示克氏針加線固定組其固定穩定,骨折愈合良好且未見可吸收線對其產生不良影響(圖7)。

注:克氏針加線組可見骨折斷端以已鈣化的骨細胞為主,單純克氏針固定組以半透明狀的軟骨為主。Note:In the group with Kirschner wire and suture, the fracture ends predominantly showed calcified bone cells. In the group with only Kirschner wire fixation, the main feature was translucent cartilage.圖7 克氏針加線固定與單純克氏針固定建模8周后的股骨骨折斷端的HE染色切片Fig.7 HE staining images of broken end of a femur fracture between Kirschner Wire fixation and Kirschner wire-sewing threads fixation after 8 weeks of modeling

3 討論

骨折是人類最常見的大器官創傷[7],在動態愈合過程中涉及諸多復雜機制。近年來,隨著國內外對于骨折、骨不連以及骨延遲愈合的研究日益增多,建立一種理想可靠的骨折動物模型成為了首要問題。目前骨折模型多集中于大鼠、小鼠的股骨骨折和脛骨骨折模型,根據建模方法的不同將其分為閉合性骨折模型和開放性骨折模型。

目前國內外研究者多因閉合性骨折模型對周圍皮膚、軟組織等損傷較小而采用閉合性骨折模型[5,8-9]。本研究參考Bonnarens等[2]設計的骨折造模儀,結果顯示,500 g砝碼分別從22、26、30 cm高度下落其造模成功率均不理想,結果提示雖然閉合性骨折模型其損傷機制更貼合于實際,但由于實驗動物之間存在較大的個體差異,同時,大鼠在砧座上的置放位置、角度等均會影響股骨的應力,故可能存在的問題是骨折類型多樣,可重復性差,很難保證實驗動物的同質性。另外,骨折造模儀的精密程度對骨折模型的影響也較為巨大,骨折造模儀需要人工制作,復制較為困難,對技術要求較高,需要多次實驗、改進,人力物力耗費較大。

開放性骨折模型,創傷較大,對軟組織損傷也較為嚴重,甚至可能伴有一定的感染風險,但是由于其可控性好,仍然被諸多研究者使用[10-11]。另外,無論是閉合性骨折模型還是開放性骨折模型都需要采取一定的固定方法,正確固定結構的應用對骨折的愈合和長期穩定性至關重要。國內外相關研究中多數采用髓內針進行固定,研究表明雖然髓內針會破壞骨髓,并干擾髓內血液循環,但并不會阻止骨折修復過程[2]。但是髓內針的粗細會影響骨折斷端的穩定性,其對骨髓破壞的程度也不同,這些因素均會改變骨折愈合的速度。本研究基于參考文獻[12]的建模方法,并進行優化改良,分別采用0.8、1.0、1.2 mm的克氏針進行髓內固定,結果顯示1.2 mm的固定效果優于其他兩組。此外,在實驗過程中發現,雖然髓內針內固定對股骨斷端進行軸向固定,控制了橫向移位,但是由于克氏針表面光滑,很難控制縱向移位,以及由于大鼠活動造成的克氏針直接脫出,本課題組又對開放性骨折模型造模方法進行改進。結果顯示,克氏針加線固定組的穩定性明顯提高,骨痂評分優于單純克氏針固定組,提示其愈合質量更好,兩組的骨組織病理學也顯示出在造模8周后克氏針加線固定組基本愈合,而單純克氏針固定組骨折斷端仍然以纖維軟骨的形式存在,可能由于斷端活動,已經形成“假關節”樣結構。

總之,本研究通過綜合對比本課題組既往實驗中的不同砝碼高度下落造成的大鼠股骨閉合性骨折模型、采用不同型號克氏針髓內固定的開放性骨折,以及通過比較單純克氏針固定與克氏針加線固定的開放性骨折模型發現,閉合性骨折模型骨折類型不確定,重復性較差,而在開放性骨折中2 mm克氏針比0.8、1.0 mm的克氏針固定效果好,進一步研究發現采用1.2 mm克氏針同時加可吸收線對兩骨折斷端進行牽拉固定效果十分理想,且對骨折的愈合過程未產生不良影響。綜上所述,通過對現有大鼠股骨骨折建模方法進行改良,確定了1.2 mm克氏針加線固定的開放性大鼠股骨線性骨折模型是一種理想的實驗模型,穩定性好,可重復性高,操作難易程度適中,同時可保證實驗對象的同質性和均一性。