復發性自然流產過程中蛻膜自然殺傷細胞相關受體的作用機制研究進展

袁柔剛，趙曉麗，張欣文*

(1.陜西中醫藥大學第二臨床醫學院,西安 712046;2.西安市人民醫院/西安市第四醫院婦女保健中心,西安 710004)

復發性流產(RSA)是婦產科常見的妊娠并發癥之一,也是婦產科生殖免疫相關的常見疾病,嚴重威脅廣大女性的身心健康。雖然RSA發病大多有明確的病因,但臨床上仍然有許多RSA的觸發因素仍未被發現,其中大部分被認為與免疫異常有關。在正常妊娠過程中,各種免疫細胞和細胞因子共同作用,形成一種免疫耐受性,使胚胎能夠成功地逃避母體免疫系統。自然殺傷細胞(NK細胞)是近年來免疫學家所關注的熱點,這些細胞在負責識別/殺死異常分化、形態學發生異常改變及受到感染的細胞的過程中發揮重要作用。在妊娠過程中,蛻膜自然殺傷細胞(dNK細胞)數量持續增加,且保持與滋養層細胞的密切接觸,因而dNK細胞與滋養層細胞在母胎界面的相互作用可以看做是母體對胎兒的同種抗原識別存在免疫耐受從而達到對胎兒免疫保護的細胞基礎[1]。埃及亞蘇大學醫學院的El-Badawy等[2]在對RSA婦女外周血殺傷免疫球蛋白樣受體的研究中發現,根據CD16和CD56的相對表達,NK細胞主要包括兩種不同的亞群,即CD56dimCD16bright亞群和CD56brightCD16dim亞群。外周血中CD56brightNK細胞占17.5%,蛻膜中CD56brightNK細胞占17.3%;血液和蛻膜中CD56dimNK細胞均高于CD56brightNK細胞。而對于這些細胞的功能,研究發現dNK細胞既可以在母胎界面發揮免疫調節作用[3],同時也在滋養層細胞侵襲和血管重塑的調節中也起著關鍵作用[4-5]。

這些NK細胞在識別/殺傷靶細胞的過程中,需要依賴NK細胞表面的抑制性受體和激活性受體同靶細胞表面的主要組織相容性復合體(MHC)分子相互作用,使得抑制性信號和激活性信號之間的平衡發生改變所產生的組合信號去識別體內的異常。NK細胞表面受體豐富多樣,這些受體與其配體在自然流產的發病過程中可能存在不同的調控作用。NK細胞表面受體主要分為兩個家族:免疫球蛋白超家族[包括殺傷免疫球蛋白樣受體(KIRs)家族、天然細胞毒受體(NCR)和LIR(白細胞Ig樣受體)/ILT(免疫球蛋白樣轉錄本)LIR受體)]和C型凝集素家族[CD94/NKGs和CD94/NKG2受體(自然殺傷基因)、NKG2D受體][6]。在妊娠過程中,它們通過各種免疫調節機制促進母體對胚胎的接受。NK細胞表面受體(Natural killer cell receptor,NKR)是NK細胞活性的中樞調節因子[7]。但是對于各類受體具體的調節機制仍未研究清楚。本文將針對以上所提及的受體及其配體在自然流產中的發病、調控機制的相關研究進展進行綜述。

一、殺傷性免疫球蛋白樣受體(killer immunoglobulin-like receptor,KIR)

多數調節dNK細胞功能的激活和抑制受體都屬于高度多態性的KIR家族。識別人類白細胞抗原HLA-I類分子的KIRs對NK細胞功能尤為重要,在母胎界面只有絨毛外滋養層(EVT)表達選擇性HLA-I類分子,所有其他類型的滋養層細胞都沒有HLA表達[8]。由于KIR和HLA基因的變異性,每次妊娠都會有一個獨特的KIR和HLA-I的組合,這與NK細胞直接與滋養層相互作用的事實相結合,表明KIR和HLA可能在RSA中發揮作用。EVT表達HLA-C、HLA-E及HLA-G[9-10],如果抑制性KIR與自身HLA-I類分子之間相互作用,它們就會抑制dNK細胞的激活,從而損害滋養層細胞[11-12]。

KIRs可以根據它們的結構和功能進行分類。每個KIR分子由兩個或三個胞外免疫球蛋白樣結構域(分別為2D和3D分子)、一個跨膜區和一個短(S)或長(L)的胞內尾巴組成[11-13]。KIRs在NK細胞亞群上表達,可能影響該細胞的活化,要么通過抑制性KIRs[帶有長(L)細胞質尾巴的KIR2DL和KIR3DL,包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIMs)]來抑制細胞激活,要么通過激活性KIRs[KIR2DS和KIR3DS,短(S)細胞質尾巴沒有信號基序,但與適配分子DAP12同源二聚體相關,具有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAMs)]來激活細胞。

KIR是表達在NK細胞和T淋巴細胞膜上的跨膜糖蛋白,在與靶細胞表面配體識別相關的NK細胞胞外片段上具有特征性的免疫球蛋白(Ig)樣結構域。所有KIR基因都編碼在19號染色體(19q14.3)的白細胞受體復合體(LRC)中,LRC包括KIR家族的15個基因,編碼KIR的基因具有多態性;LRC中存在的KIR基因除了具有多態性,其數量還存在很強的單倍型變異性;兩種類型的KIR單倍型(A和B),可以被KIR家族的15個基因所定義[11-15],即KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3D、KIR3DL3和KIR3DS1[10-16]。

目前鄭州大學附屬人民醫院蘇寧教授團隊進行了關于KIR基因和HLA-C配體影響漢族人口復發性自然流產的研究[16],該研究檢測了110例原因不明的RSA漢族女性和105例健康漢族女性的KIR和HLA-C基因,探究是否某些基因型更容易發生流產,結果表明:與對照組相比,RSA患者組KIR3DL1基因頻率明顯降低,KIR2DS1基因頻率明顯更高,但是兩組KIR基因頻率及不同KIR單倍型差異無統計學意義;抑制基因的減少和激活基因的增加可能誘導子宮蛻膜自然殺傷細胞(dNK細胞)的激活,從而降低胎兒存活的概率導致流產的發生。這項研究提示母系KIR和HLA-C基因與中國漢族女性RSA之間存在關聯,但是并未對其機制進行更加深入的研究。無論如何,這些研究結果對我們關于KIR受體基因在RSA發生中機制的探索有一定的啟示。

二、天然細胞毒受體(natural cytotoxicity receptors,NCR)

NCR隸屬于免疫球蛋白超家族,包括自NCR-1(即NKp46)、NCR-2(即NKp44)、NCR-3(即NKp30)[16],這些受體在識別幾乎不表達主要組織相容性復合體(MHC)的靶細胞中發揮重要作用。NCR在NK細胞胞外部分也具有免疫球蛋白(Ig)樣結構域,因此將之歸屬于免疫球蛋白超家族。這類受體識別的配體包括應激誘導蛋白(NKG2D的配體)、病毒蛋白(如血凝素)、pp65(NKp44、NKp46和NKp30的配體)及一些尚未鑒定的腫瘤配體[17-18]。

由于NCR缺乏免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAMs),因此它們只能通過含有ITAM的相關分子向胞內傳遞激活信號[19]。NKp46和NKp30可以在靜息狀態和激活狀態的NK細胞上表達,而NKp44僅在激活的細胞上表達。NKp30可以轉錄成不同的變異體,其中NKp30a、NKp30b和NKp30c是最豐富的異構體,每個異構體都有不同的功能,NKp30a和NKp30b傳遞激活信號,而NKp30c傳遞免疫抑制信號;NKp46和NKp44可以轉錄成幾種異構體,但NKp46沒有發現剪接變異體的功能差異,且NKp44存在抑制性異構體[20];此外,3種NCR都被多次證明可以誘導子宮NK細胞的細胞毒作用和細胞因子的產生,但其中只有NKp46能誘導dNK細胞的細胞毒作用[21];另NKp30可以促進細胞因子的分泌,而NKp44在dNK細胞中具有抑制功能[22]。

日本Fukui教授團隊[23]對復發性流產或著床失敗婦女子宮內膜NK細胞上NCR和細胞因子的表達進行了研究,主要研究了復發性妊娠丟失(RPL)婦女子宮內膜NCR(NKp46、NKp44和NKp30)的表達和NK細胞的產生,采用流式細胞術檢測子宮內膜NK細胞中NCR(NKp46、NKp44和NKp30)的表達,實驗收集了34例著床失敗婦女和74例對照組的分泌中期子宮內膜的NK細胞,分析孕婦外周血NK細胞NCR的表達狀況;結果顯示NCR表達及細胞因子產生發生了改變,特別是dNK細胞NKp46表達降低,這提示了復發性流產女性可能存在NK細胞調控異常。但是這項研究也只是探究了幾種NCR在RSA患者中的表達情況,并未對之具體的機制進行深入研究。

NKp46又可細分為NKp46dim和NKp46bright。Mai等[24]研究了NKp46受體在決定生殖結果中的作用,通過收集流產婦女的子宮內膜,根據妊娠反應試驗結果將子宮內膜分為妊娠組和妊娠失敗組,采用多色流式細胞術分析NKp46受體及NK細胞上表達的其他激活或抑制受體及NK細胞產生的細胞內因子;結果發現根據與NK細胞相關的不同熒光強度,NKp46受體在生殖中發揮不同的作用,即NKp46dimNK細胞參與殺死細胞,而NKp46brightNK細胞參與細胞因子的產生;這表明NKp46可能是觀察胚胎耐受條件的預測標記,說明該受體在RSA患者發生過程中扮演重要的角色。此項研究并未對NK細胞受體與各自的HLA抗原在RSA患者中的相互作用進行深層次的探討,但對于我們日后在NK細胞受體與各自的HLA抗原在不明原因RSA(URSA)中的相互作用的研究有一定的啟示意義。

三、白細胞免疫球蛋白樣受體(leukocyte immunoglobulin receptor,LILR)/免疫球蛋白樣轉錄體(Immunoglobulin-like transcript,ILT)

白細胞免疫球蛋白樣受體(LILR)家族的一些成員,也被稱為免疫球蛋白樣轉錄體(ILT),其存在于人類胎盤中;白細胞免疫球蛋白樣受體家族B成員1(LILRB1,即ILT2)主要在基質細胞上被發現,而白細胞免疫球蛋白樣受體家族B成員2(LILRB2,即ILT4)除了基質細胞外,也在平滑肌層的血管周圍發現;LILR是一種含有細胞外配體結合免疫球蛋白樣結構域和細胞內免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)的I型跨膜糖蛋白,因此被歸類為免疫抑制性受體[24]。這些受體類似于KIR,編碼在19號染色體(19q14.3)上,且LILR比KIR分布更廣。

HLA-G隸屬于非經典的HLA-Ⅰ類分子,由 HLA-G基因編碼,最初在滋養層細胞被發現。滋養層細胞屬于蛻膜侵入細胞,對于母體而言屬于同種異體移植物,HLA-G在滋養層細胞中高表達,而HLA-G能夠直接抑制NK細胞的殺傷作用,從而保護胎兒細胞免受NK細胞的攻擊[25]。HLA-G四聚體的結合被發現是由ILT受體介導的,主要由ILT4介導,ILT2也有一定的貢獻,但只有當后者高水平表達時才能介導,ILT2在所有女性dNK細胞中的表達率為20%～25%。ILT2和ILT4均存在于所有蛻膜巨噬細胞上,當ILT2和ILT4與滋養層細胞上的HLA-G結合時,ILT2和ILT4的抑制功能可能會抵消KIR2DL4的激活信號;LILRB1在細胞質區域含有一個酪氨酸的免疫受體開關基序,既可以作為激活受體發揮作用,也可以發揮抑制功能,LILRB1與HLA-G的結合比與經典的HLA-I類分子結合更強,并且HLA-G四聚體比單體形式更有效地誘導LILRB1信號[26]。

近年來,對于母胎界面蛻膜NK細胞表面抑制性受體LILR/ILT與其配體HLA-G在復發性流產中表達及作用的研究少之又少,因而對母胎界面這兩者之間關系深層次的探究也可以作為對流產機制探索的新方向[27]。

四、分化決定簇抗原94(Cluster of differentiation 94,CD94)/自然殺傷細胞凝集素樣受體亞家族C成員1(NK cell lectin-like receptor subfamily C member-1,NKG2A)

CD94/NKG2A是一種存在于NK細胞和某些T細胞上的受體,由CD94與NKG2分子家族其他成員通過共價鍵結合而成;這兩種分子都是C型凝集素超家族的糖基化成員,CD94/NKG2A受體是HLA-E與特定MHC I類分子信號序列特異性衍生而來的肽分子,信號序列衍生肽的位置在決定HLA-E/肽復合物是否對NK細胞介導的裂解作用具有抗性方面至關重要[28]。針對這一點,美國國家過敏和傳染病研究所的Brooks等[29]證實CD94/NKG2A特異性與HLA-E相互作用,并證明這種相互作用依賴于HLA-E與上述衍生肽的結合;此外,通過對CD94/NKG2A+ NK細胞的功能分析,并沒有觀察到CD94/NKG2A與經典HLA I類分子之間的相互作用,他們還評估了HLA-E相關肽在HLA-E和CD94/NKG2A相互作用中的功能,發現所有I類先導序列多肽均需要與HLA-E結合,并被CD94/NKG2A所識別?？梢哉fHLA-E對CD94/NKG2A的特異性識別是由肽在兩個水平上控制的:首先,肽必須穩定HLA-E,促進其在細胞表面表達;另外,HLA-E/肽復合物必須形成CD94/NKG2A的配體[29]。由于NK細胞表面受體主要通過其抑制性受體發揮其細胞毒作用,而CD94/NKG2A作為這樣的受體,在體內NK細胞剛開始發育就開始緩慢合成表達,白細胞介素-15可以與其他多種細胞因子可以共同促使祖細胞的分化和增強CD94的表達[29]。

在妊娠過程中,NK細胞對胎盤的形成至關重要,而胎盤是一種能夠控制生長中的胎兒所需氧氣和營養物質供給的關鍵器官。dNK細胞不會攻擊不相匹配的胎兒及其胎盤,相反,它們幫助局部血管耐受滋養胎兒所需的變化?？刂芅K細胞功能取決于HLA-I類與抑制性NK細胞受體的相互作用[30];人類首先進化出HLA-E與CD94/NKG2A的相互作用,HLA-E在滋養層細胞表面作為CD94/NKG2A的配體,在CD94/NKG2A抑制受體和HLA的驅動下,子宮dNK細胞促使它們在母胎界面傳遞這些關鍵功能,其次才逐漸建立了HLA-A、HLA-B和HLA-C與KIR的多種相互作用[31]。

五、自然殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B成員2(NK cell lectin-like receptor subfamily B member-2,NKG2D)

NKG2D免疫受體在大多數NK細胞上表達[3],孕早期dNK細胞NKG2D表達降低,在孕中期NKG2D表達增加[32]。NKG2D屬于C型凝集素受體家族,其配體為MHCⅠ類同系物MICA和MICB。人應激誘導的MHC Ⅰ類鏈(MIC)相關蛋白A和B(MICA/B)分子與其同源受體NKG2D的相互作用,是一種免疫逃逸機制;MIC分子是表達于人dNK細胞表面的NK細胞激活受體NKG2D的配體,在體內可以作為細胞應激信號,并觸發一系列免疫效應功能;MIC分子能夠與NKG2D受體相互識別并交聯使得免疫細胞能夠對外識別和攻擊出現的應激細胞,同時不需要MHC I類表達或抗原識別;據此可以說MIC/NKG2D相互作用是一種有效的免疫監測機制[33-34]。此外,磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3)的激活是形成NKG2D免疫突觸所必需的;在人體NK細胞上,NKG2D受體的刺激信號可以通過相關的DNAX相關蛋白10(DAP10)適配器介導,NKG2D本身參與刺激NK細胞形成免疫突觸,并可以把NKG2D招募到中心突觸,在這過程中PIK3的結合位點是必不可少的,且在刺激新號傳遞前足以將DAP10招募到NK細胞免疫突觸的位置[35]。

在女性妊娠期間,母體對胎兒的免疫耐受與胎盤產生的許多免疫抑制因子有密切關系。胎盤源性外泌體作為一種新的免疫調節因子出現在母體免疫耐受中,外泌體是形態明確的膜狀納米大小的囊泡,是由內泌體多囊體(MVB)與質膜融合而成后分泌而來,通過代理傳遞細胞與細胞之間的接觸,在接觸過程中,外泌體轉移相關分子,使之具有新的特性并且重新編程受體細胞。人胎盤滋養層細胞在整個妊娠過程中能夠不斷地分泌外泌體,這些外泌體直接在胎盤絨毛膜周圍的母體血液中傳遞,發揮其免疫抑制功能[36-37]。MICA和MICB在妊娠期間由胎盤表達,與合胞滋養細胞的內泌體多囊體分選,通過攜帶MIC的外泌體釋放[38]。

NKG2D在母胎界面針對胎兒的母體免疫反應可能導致反復流產。dNK細胞聚集在母體-胎兒界面,在妊娠期間發揮重要作用;在dNK細胞表面,NKG2D配體通過與相應受體結合激活細胞。在孕婦正常妊娠過程中,合體滋養細胞能夠將MICA和MICB分泌到血清中,干擾NKG2D介導的母體對抗胎兒的免疫反應;MICA和MICB水平的降低與dNK細胞上NKG2D水平的增多相關,這個過程可能參與了RSA的發病[39]。Sondes等[40]對RSA中NK細胞受體NKG2D及其配體MICA的基因多態性進行了實驗探究,目的是探討NKG受體基因多態性和MICA基因多態性與RSA的可能關系;此項實驗通過等位基因鑒別檢測患者和對照組女性NKG2D基因的7個單核苷酸多態性(rs1049174、rs2255336、rs2617160、rs2617161、rs2246809、rs2617169和rs2617170)、NKG2A基因的1個單核苷酸多態性(rs1983526)和MICA基因的1個單核苷酸多態性(MICA129);實驗結果也提示NKG2D基因多態性可能影響婦女的妊娠成功率。

根據查閱文獻,發現目前在婦產科學中對于NKG2D的研究多集中于卵巢腫瘤及病毒感染機體的免疫層面,而對其在反復自然流產的母胎界面方面的研究少之又少。這也可以為我們對于自然流產的免疫機制相關研究提供新方向。

六、結語

RSA婦女受孕前后NK細胞數量與其細胞膜表面受體的增加是一個重要的臨床問題,dNK細胞被認為是胚胎被母親“排斥”(同種異體免疫流產)的主要細胞群。根據目前已有的對于dNK細胞表面受體的研究,胚胎排斥反應可能是NK細胞同種異體識別系統缺陷的結果。即自然流產患者dNK細胞的毒性與母胎界面各種NK細胞表面受體與其相關配體缺乏表位匹配密切相關,通過受體-配體之間的匹配減弱或缺失,dNK細胞的激活沒有被阻斷,從而NK細胞的殺傷作用占據主導地位,使其獲得殺傷許可,從而無阻礙地破壞滋養層,導致妊娠失敗。由于NK細胞相關的免疫識別系統的復雜性使研究人員對于分析其對妊娠結局的影響變得十分棘手,也因此生殖過程中的免疫或免疫遺傳機制的研究對我們研究自然流產仍然是一個挑戰。增加對KIR/HLA-C復合體、NCR的幾種亞型NKp44/NKp46/NKp30、LIR/ILT/HLA-G復合體、CD94/NKG2A復合體和NKG2D的研究,有助于更好地理解母胎界面NK細胞表面免疫受體及其配體相互識別發揮作用的妊娠模型,有助于對不明原因的自然流產患者進行病因分析,甚至于在將來為不明原因的自然流產患者的治療提供思路,如研究針對相關受體和/或其相關配體的靶向治療藥物等[1]。