基于膽汁酸代謝組學探討復方大黃煎劑保留灌腸對輕微型肝性腦病大鼠模型的治療作用

杜沅沁， 王萌， 黃國初， 姚春， 鐘瑞熙， 黃良江， 徐健， 黃晶晶， 譚欽文，毛德文

1 廣西中醫藥大學研究生院， 南寧 530000； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院脾胃科， 南寧 530023

肝性腦病（HE）是一種常見且公認的肝病神經精神綜合征，其特征是在沒有其他已知腦部疾病的情況下出現一系列神經精神癥狀［1］。臨床上，患有肝病且出現上述嚴重癥狀的患者可診斷為顯性HE。然而，30%～70%的肝硬化患者沒有表現出任何臨床上明顯的腦功能障礙癥狀，但在神經心理、生理測試或腦電圖中取得了異常結果［2］。僅表現為輕度癥狀包括認知和注意力缺陷、反應遲鈍、記憶減退以及視覺運動協調障礙，這種情況定義為輕微型肝性腦病（MHE）［3］，是進展為顯性HE的高危風險因素，無疑將增加此類患者的救治難度與死亡風險［4］。因此，通過對MHE發病機制的深入了解，MHE的診斷和預防對于降低HE的發病率和病死率變得越來越重要。MHE發病機制迄今尚未闡明。一般認為MHE是顯性HE的特殊類型，屬HE的早期階段，其機制與顯性HE一致，只在程度存在差別。氨中毒學說是最早提出且證據最多的發病機制假說，氨代謝紊亂引起氨中毒可觸發神經元凋亡級聯反應［5］。損害顱內血流的自動調節功能［6］，直接影響腦部神經生理功能。除此之外尚有γ-氨基丁酸神經遞質與假性神經遞質學說，二者均可產生中樞抑制效應，表現出神經功能異常變化［7-8］。最近一項研究［9］表明，腦內膽固醇蓄積是通過膽汁酸（bile acid，BA）介導的法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）作用促進MHE進展的一個因素。

中醫藥由于其獨特的理論體系、指導方針和用藥方法，在治療和預防疾病中發揮著重要的作用［10］。腸道微生物群通過生物轉化或與中藥的某些生物活性成分發生反應，以促進藥物吸收［11］。而腸道菌群的改變對BA代謝至關重要。大黃煎劑被列入《慢加急性肝衰竭中西醫結合診療專家共識》1A級別證據，強烈推薦用于肝硬化并發HE［12］。大黃煎劑保留灌腸治療MHE可有效降低內毒素及血氨水平，改善肝功能［13］。有研究指出在MHE患者血液中發現多種BA升高［14］，但是經過大黃煎劑保留灌腸治療后的MHE患者血清中多種BA發生了變化［15］。然而，大黃煎劑調控血清中BA的機制尚未清楚，所以本研究旨在研究大黃煎劑保留灌腸對MHE大鼠BA代謝物的影響。利用代謝組學方法進一步探索防止MHE進展為HE的潛在治療機制。

1 材料和方法

1.1 化學品和試劑 大黃（產地：甘肅，批號20211103）和烏梅（產地：福建，批號20210914）由廣西南寧萬寶堂藥業提供。CCl4（批號：1601168）購自合肥工業大學化學試劑廠；硫代乙酰胺（TAA）（批號：T70013）購自普西唐生物科技有限公司；甲酸（批號：94318）購自霍尼韋爾公司；甲醇（批號：A452-4）、異丙醇（批號：A461-4）購自費希爾化學公司；38種BA標準品購自Sigma-Aldrich（美國）和Steraloids公司（美國）；蘇木素-伊紅（HE）染色液（批號：DH0006）購自北京雷根生物技術有限公司。

1.2 儀器 Morris水迷宮視頻分析系統（北京智鼠多寶生物科技有限責任公司）；NX10N快速血氨測定儀（日本Fujifilm公司）；7020型全自動生化分析儀（日本Hitach公司）；Agilent 2100生物分析儀（美國安捷倫科技公司）；5500 QTRAP質譜儀（上海SCIEX分析儀器貿易有限公司）；Waters ACQUITY UPLC I-Class系統（美國Waters公司）；低溫高速離心機（德國eppendorf公司）；ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column色譜柱（美國Waters公司）；FE28型FiveEasy Plus臺式pH計（上海屹利科學儀器有限公司）

1.3 實驗動物 無特定病原體（SPF）級SD雄性大鼠55只，體質量（180±20） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證編號：SYXK（湘）2019-0001，實驗動物使用許可證編號：SCXK（桂）2019-0004。飼養于廣西中醫藥大學SPF級動物實驗室內，室溫20～24 ℃，相對濕度控制在50%～70%，12 h光照晝夜循環，空氣流通，適應性喂養7 d，期間自由飲食飲水。

1.4 分組及干預 55只大鼠運用簡單隨機分組法分為空白組（NC組）、HE組、MHE組和MHE大黃煎劑治療組（MHEY組）。各組大鼠進行5 d的水迷宮尋臺訓練，測試2次后，進行HE及MHE模型大鼠制備。觀察各組大鼠體質量、存活率、一般狀態，水迷宮檢測評估是否成模，成模后各組取10只大鼠。MHEY組給予大黃煎劑溶液連續灌腸14 d，其余各組予同體積蒸餾水灌腸。大黃煎劑的制備：將30 g大黃和30 g烏梅煎制成100 mL溶液，根據“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算200 g大鼠用量約為70 kg人的0.018，遂計算出每只大鼠的灌胃量為9 mL·kg-1·d-1。

1.5 HE及MHE模型制備 本實驗采用CCl4和乙醇構建大鼠肝硬化模型［16］：將CCl4、橄欖油按2∶3比例混合配置成40% CCl4油溶液后于模型大鼠皮下注射，每周2次，持續9周。首周每次注射5 mL/kg，而后每次注射3 mL/kg，期間搭配5%乙醇溶液自飲，NC組普通飲水，每周腹下注射生理鹽水2次。之后采用TAA法構建HE大鼠模型、MHE大鼠模型［17-18］，用生理鹽水配成40 mg/mL TAA溶液。HE組腹腔注射TAA（300 mg/kg），MHE、MHEY組腹腔注射TAA（200 mg/kg），NC組腹腔注射生理鹽水（5 mL/kg），每隔48 h腹腔注射，連續注射3次。TAA注射期間動物均飲用生理鹽水葡萄糖液（內含100 g/L葡萄糖，0.9 g/L氯化鈉，20 mmol/L氯化鉀）。根據大鼠HE診斷標準，若大鼠出現嗜睡、反應遲緩，自主性活動減少、共濟失調、昏迷等癥狀之一，即可診斷HE［19］。若出現少許或未出現上述癥狀，但是血氨及肝功能均明顯高于正常組，病理組織學檢測提示肝衰竭，且水迷宮檢測顯示大鼠尋臺時間明顯延長，穿臺次數減少即可診斷MHE。

1.6 Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力 將直徑為1.5 m的黑色圓形水池［水深30 cm，水溫（26±1） ℃］均等分為4個象限，在某一象限設置1個直徑10 cm的平臺隱匿于水下2 cm處，并在水中添加黑色顏料混勻，水池上方懸掛攝像機。定位巡航訓練：共歷時5 d，每天定于固定時間段訓練4次。訓練開始時，從池壁四個起始點的任一點將大鼠面向池壁放入水池。自由錄像記錄系統記錄大鼠找到平臺的時間和游泳路徑，4次訓練將大鼠分別從4個象限放入水中。大鼠找到平臺后或60 s內找不到平臺（潛伏期記為60 s），則由實驗者將其引導到平臺，在平臺上休息10 s，再進行下一次試驗。每日以大鼠4次訓練潛伏期的平均值作為大鼠當日的學習成績。空間探索實驗：定位航行實驗結束后撤去平臺，在原平臺相對象限入水點將大鼠放入水中，記錄其120 s內游泳路徑并統計穿越平臺次數。定位巡航實驗在造模后及給藥后各進行1次，空間探索實驗在給藥后進行1次。

1.7 樣品采集和制備 末次給藥后再次進行Morris水迷宮實驗。之后按照體質量比給予大鼠腹腔注射等比例的2%戊巴比妥鈉（0.03 mL/kg）深度麻醉，開腹在肝臟背面尋得膽管后置管引流膽汁至無菌EP管儲存在-80 ℃冰箱用于BA代謝組學分析，在腹主動脈采血行血氨及生化檢測；然后對各組大鼠實施安樂死，剪取肝左葉至無菌EP管儲存在-80 ℃冰箱用于Western Blot、PCR檢測，剪取肝右葉并取腦組織置于4%多聚甲醛中固定用于組織病理學分析，最后收集結腸和腸道內容物至無菌EP管儲存在-80 ℃冰箱，用于隨后的pH檢測。

1.8 血氨、肝生化指標及結腸內容物pH測定 取血后應用快速血氨測定儀檢測大鼠全血中氨的含量，應用全自動生化儀檢測血清中AST、ALT、ALP、TBil及總膽汁酸（TBA）水平。取大鼠回盲腸后端結腸大約10 cm，采用pH計法檢測結腸內容物pH值。

1.9 HE染色 取于4%多聚甲醛中固定24 h后的大鼠肝臟和腦，流水沖洗30 min，然后剪成組織大小約3 mm×2 mm×3 mm，各級酒精梯度脫水，二甲苯三級透明，浸蠟包埋，石蠟切片機切片、黏片及烤片后HE染色并成像。

1.10 BA靶向代謝組學 首先每個膽汁樣本稀釋100倍，接著各取液體樣本100 μL，加入500 μL預冷甲醇及10 μL內標，渦旋混合，-20 ℃孵育20 min沉淀蛋白；4 ℃條件下，14 000×g離心15 min，取上清真空干燥；質譜檢測時加入甲醇-水（1∶1，50 μL/50 μL）復溶，4 ℃條件下，14 000×g離心15 min，取上清進樣分析。

樣品采用Waters ACQUITY UPLC I-Class系統進行分離。流動相：A相為0.1%甲醛水溶液，B相為甲醇。樣品置于8 ℃自動進樣器中，柱溫45 ℃，流速為300 μL/min，進樣量2 μL。相關液相梯度如下：0～6 min，B相從60%線性變化到65%；6～13 min，B相從65%線性變化至80%；13～13.5 min，B相從80%線性變化至90%；13.5～15 min，B相維持在90%。樣本隊列中每間隔一定數量的實驗樣本設置一個質量控制（quality control，QC）樣本，用于檢測和評價系統的穩定性及重復性。

采用5500 QTRAP質譜儀（AB SCIEX）在負離子模式下進行質譜分析。5500 QTRAP ESI源條件如下：source temperature： 550 ℃； ion Source Gas1（Gas1）：55； Ion Source Gas2 （Gas2）： 55； Curtain gas （CUR）：40； ionSapary Voltage Floating（ISVF）： -4 500 V；采用MRM模式檢測待測離子對。采用Multiquant軟件提取色譜峰面積及保留時間。采用BA的標準品矯正保留時間，進行代謝物鑒定。為進一步定量篩選差異BA，應用R軟件包“mixOmics”建立OPLS-DA模型以提取組間的差異信息。

1.11 統計學方法 使用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析。計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃煎劑減弱CCl4及TAA誘導的MHE

2.1.1 對大鼠一般狀態的影響 HE組大鼠先后出現體質量下降、嗜睡、反應遲緩、各種反射逐漸消失、共濟失調、個別出現昏迷現象等。MHE組大鼠部分出現反應遲緩和自主性活動減少，未出現嗜睡、共濟失調、昏迷等HE癥狀。MHEY組大鼠均未見上述癥狀。

2.1.2 對大鼠尋臺潛伏期與穿臺次數的影響 大黃煎劑干預后，定位航行訓練及空間探索試驗檢測結果表明，與NC組比較，HE組、MHE組尋臺潛伏期（造模后、用藥后）顯著增加，穿臺次數顯著減少（P值均＜0.05）；與MHE組相比，MHEY組尋臺潛伏期（用藥后）顯著降低而穿臺次數顯著增加，HE組尋臺潛伏期顯著增加而穿臺次數顯著減少（P值均＜0.05）（表1）。

表1 水迷宮數據Table 1 Water maze data

2.1.3 對血氨、肝生化指標及結腸內容物pH值的影響 與NC組比較，HE組和MHE組AST、ALT、ALP、TBil、TBA、血氨及結腸pH值顯著增加（P值均＜0.05）；與MHE組相比，MHEY組AST、ALT、ALP、TBil、TBA及血氨及結腸pH值減少（P值均＜0.05），HE組AST、ALT、ALP、TBil、TBA、血氨及結腸pH值增加（P值均＜0.05）（表2）。

表2 四組間各指標比較Table 2 Comparison of indicators among four groups

2.1.4 大鼠肝組織病理變化 光學顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織病理切片（圖1）。NC組肝組織中肝小葉結構清晰正常，未見肝細胞炎性細胞浸潤、細胞壞死等現象，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列。HE組假小葉形成，細胞紊亂，肝細胞水腫變性壞死明顯，重度炎癥細胞浸潤伴纖維組織增生，膽管數量明顯增多。MHE組中央靜脈周圍肝細胞排列紊亂，假小葉形成，肝細胞水腫變性減輕，輕度炎癥細胞浸潤，膽管數量較HE組減少。MHEY組中央靜脈周圍肝細胞較整齊，有假小葉形成；肝細胞水腫變性較MHE組明顯減輕，重度炎細胞浸潤，膽管數量較MHE組減少；整體損傷水平較MHE組減少。

圖1 肝組織HE染色（×200）Figure 1 Liver tissue HE staining image（×200）

2.1.5 大鼠腦組織病理變化 NC組腦組織結構正常，排列整齊；HE組神經元壞死嚴重、結構不完整、排列紊亂、細胞核固縮、胞質減少；與HE組相比，MHE組神經元壞死較輕，MHEY組細胞壞死、排列紊亂、細胞核固縮現象減輕，結構逐漸完整（圖2）。

圖2 腦組織HE染色（×200）Figure 2 HE staining image of brain tissue （×200）

2.2 BA靶向代謝組學分析

2.2.1 靶向測序結果 對膽汁樣本的混樣QC樣本進行BA靶向代謝組學的質譜定性定量檢測分析，共測得BA代謝物23個。對數據的穩定性和重復性進行評價，待測物在QC樣本中的RSD結果顯示（圖3），代謝物RSD均小于30%，說明樣本中的分析數據結果穩定可靠。

圖3 QC RSD百分比圖Figure 3 Percentage chart of QC RSD

分別比較各組間大鼠膽汁中BA含量的差異（圖4），MHE組TBA、初級BA和次級BA均低于NC組（P值均＜0.05）；HE組TBA和初級BA低于MHE組（P值均＜0.05）；MHEY組TBA、初級BA高于MHE組（P值均＜0.05）。

圖4 BA統計分析圖Figure 4 Statistical analysis of bile acids

2.2.2 PCA分析 PCA顯示MHE成模前后大鼠膽汁的BA分別聚集成2個簇集，且經過大黃煎劑治療前后的MHE大鼠膽汁的BA也分別聚集成2個簇集，提示健康大鼠發生MHE時，其膽汁中的BA發生了明顯變化，但經過大黃煎劑治療后膽汁中的BA也發生了變化。而MHE和HE組大鼠的簇集重合率較高，說明這兩組的BA譜相似（圖5）。

圖5 PCA散點圖Figure 5 PCA scatter plot

2.2.3 OPLS-DA分析 Scores plot中橫坐標表示OSC過程中主成分的得分，代表兩組樣本間的差異；縱坐標表示OSC過程中正交成分的得分，代表各組內樣本間的差異（圖6）。MHE組和NC組間分離趨勢明顯，代表兩組間代謝產物差異明顯；MHE組和MHEY組存在組間分離趨勢，代表兩組間代謝產物存在差異；而MHE組和HE組趨勢較近，代表兩組間代謝產物差異不明顯；但四組內數據均不集中，代表組內樣本代謝產物均存在一定的差異。

圖6 OSC散點圖Figure 6 OSC scores plot

對OPLS-DA模型進行Permutation檢測，對數據進行200次隨機排列組合實驗。MHE組與NC組對比模型、MHE組與MHEY組對比模型的Q2和R2均＞0.5，P值均＜0.05，說明具有較高的解釋力和預測能力，可以進行下一步的數據分析；而MHE組與HE組對比模型的R2＜0.4，說明此模型不適用于下一步的數據分析。

成功建立OPLS-DA模型后，結合P-value和變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值篩選差異顯著的BA，VIP值＞1時，差異顯著，P＜0.05。MHE組與NC組對比，差異顯著的BA有12個，GCDCA、GUDCA、GHDCA、TCDCA、TUDCA、GLCA和TLCA減少，γ-MCA、THCA、7-KDCA、AlloLCA、α-MCA增加。MHEY組與MHE組對比，差異顯著的BA有5個，THDCA、TMCA、TCDCA、TUDCA和TLCA增加（附錄A和表3）。

3 討論

實驗數據顯示，結合大鼠一般狀態觀察及Morris水迷宮檢測，MHE組大鼠部分出現反應遲緩和自主性活動減少，認知功能下降，HE組大鼠先后出現嗜睡、反應遲緩、共濟失調甚至昏迷，學習和記憶能力嚴重下降，MHEY組大鼠均未見上述癥狀。此外，血清中AST、ALT、ALP、TBil、TBA、血氨及結腸pH值生化指標的變化表明，HE組比MHE組肝衰竭程度更嚴重，而大黃煎劑干預MHE大鼠后各項指標均好轉。另外，結合肝組織和腦組織病理切片，說明大黃煎劑有較好的保護肝細胞、改善肝功能的作用，并可以降低大鼠結腸內容物的pH值，降低血氨，恢復MHE大鼠認知功能。

有研究［20-21］表明，腸道和大腦之間的雙向串擾對于維持宿主體內平衡至關重要，并在神經、激素和免疫學水平上受到調節，腸道菌群在腸-肝-腦相互作用中起著重要作用，BA對腸道菌群的擾動會影響腸-肝-腦軸以改變行為反應［22］。結合和非結合BA先前已在非認知受損的人類及嚙齒動物的大腦中被檢測到，并且相同的BA主要存在于循環中［23-24］。盡管在低活性的大鼠腦提取物中觀察到鵝去氧膽酸（CDCA）由24-羥基膽固醇合成［25］，但據推測，大部分腦BA是從外周循環運輸的［26］。BA是FXR、G蛋白偶聯受體5、肝X受體、孕烷X受體和維生素D受體等多種核受體的天然配體，在腦和外周器官均有表達［25，27］。腦中的BA在認知功能、記憶和學習中的作用與這些核受體及幾種神經遞質受體的激活有關，包括M2和M3毒蕈堿乙酰膽堿受體、γ-氨基丁酸和N-甲基-D-天冬氨酸受體［28］。研究［29］表明，未結合BA和次級BA的缺失會導致回腸中FXR的激活，這可能會損害抗炎途徑和腸道屏障功能，最終誘導MHE的發生。此外，回腸中的FXR先前也被證明可以激活FGF15的表達，FGF15進入肝腸循環，激活肝中的FXR調節肝臟SHP/LRH-1途徑，進而下調CYP7A1的表達，減少BA合成，而合成BA的原料膽固醇肝內蓄積也可進一步加重肝損傷［30］。而且，BA濃度的降低可升高腸道pH值和無法控制具有脲酶的菌種生長引起血氨升高［31］。有研究［32］顯示，喂食富含BA抑制劑消膽胺飼料的小鼠血清和腦BA含量降低，從而減輕了與MHE相關的神經功能損害。在急性肝衰竭大鼠中，FXR及其輔助因子小異二聚體伴侶在額葉皮層中的表達增加。直接向額葉皮質注入FXR特異性抑制劑對急性HE相關的神經系統并發癥具有保護作用［33］。

本研究結果顯示大鼠發生MHE時，肝FXR表達增加，初級BA濃度降低，大黃煎劑干預后可能通過調節菌群，影響腸內BA池，通過抑制回腸FXR-FGFR4使肝FXR表達降低，BA濃度回調。MHE大鼠GCDCA、GUDCA、GHDCA、TCDCA、TUDCA、GLCA和TLCA減少，γ-MCA、THCA、7-KDCA、AlloLCA、α-MCA增加，大黃煎劑干預后，THDCA、TMCA、TCDCA、TUDCA和TLCA回調；MHE組與HE組組成相似。據報道［34］，TUDCA在防止肝細胞凋亡和保護線粒體免受干擾能量產生的不利細胞因素的影響方面發揮作用。BA進入大腦的機制以及它們如何存在于腦脊液中是未知的。最近的研究［35］顯示，腦中疏水性BA通過涉及緊密連接蛋白閉塞的Rac1-dependent磷酸化的機制增加了血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的通透性，而非結合BA疏水性強于結合BA。隨著BBB通透性增加，血清中非結合BA被動擴散到大腦中加重MHE［33］。有研究［35］顯示，腸道微生物組調節失調導致細胞毒性次級BA如脫氧膽酸及其衍生物的產生增加，這些細胞毒性次級BA可以調節BBB并在大腦中積累，從而導致其受體和靶標介導的代謝功能受損引起認知功能障。雖然本研究不是檢測血清中BA代謝譜，但是檢測膽汁中BA能更直觀地反應腸道菌群與BA代謝的關系。當大鼠發生MHE時，膽汁中非結合BA是升高的。課題組推測膽汁中BA的變化引起了血清中非結合BA的升高，進而增加BBB的通透性誘發MHE。而且可以推測當MHE發生時，肝內如TUGDA一類保護肝細胞的BA濃度下降，毒性BA升高，進一步加重肝損傷。大黃煎劑可以逆轉此現象。而且HE組和MHE組的BA組成相似，說明HE是MHE進展而來，發病機制類似。

BA與腸道菌群兩者本身就是相互調節，本研究發現了BA腸肝循環在MHE發病中的重要性，加強肝病與腸-肝-腦軸之間的關系，并且進一步探討了大黃煎劑保留灌腸治療MHE的機制。雖然本實驗未直接證實膽汁中Ras的變化可導致MHE，但是可以推測得出與MHE發病密切相關，并且其與腸道菌群密切相關，相互調控，為接下來深層次的研究奠定了基礎。由于資金和時間限制，本研究存在以下缺點：未研究腦、血液和腸道中的BA代謝譜。

倫理學聲明：本研究方案于2022年8月28日經由廣西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批，批號：DW20220826-162，符合實驗室動物管理與使用準則。所有實驗操作嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》進行。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：王萌、毛德文負責課題設計；杜沅沁負責資料分析，撰寫論文并最后定稿；鐘瑞熙、徐健、黃國初、黃良江負責實驗實施，分析數據；黃晶晶、譚欽文負責數據整理；姚春負責實驗指導。