熱休克蛋白90在HBV復制中的作用

花胤， 方海麗， 劉守勝， 辛永寧， 張梅， 宣世英

1 南京醫科大學附屬青島臨床醫學院， 青島市市立醫院 a. 感染性疾病科， b. 臨床研究中心， 山東 青島 266011； 2 青島市第八人民醫院感染性疾病科， 山東 青島 266000

HBV的復制可以概括為松弛環狀DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）轉化為共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），以cccDNA為模板合成RNA中間體，再從RNA中間體逆轉錄回rcDNA的過程。cccDNA在HBV復制過程中高度穩定，由此導致HBV的長期慢性感染和較低治愈率［1］。近年來，研究發現HBV復制過程中肝臟內存在不同程度的熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）90表達，并且其表達水平與乙型肝炎的診斷和分型有密切的關聯。隨著對Hsp90在HBV復制過程中的作用的研究不斷開展，提示Hsp90有可能作為抗HBV的潛在靶點，但目前尚未對此有系統的歸納總結。本文對Hsp90在HBV復制過程中的作用進行綜述，以期為Hsp90作為抗HBV的新靶點提供理論依據。

1 Hsp90的生理功能

1.1 分子伴侶 分子伴侶是一類參與蛋白質的折疊與組裝，但其本身并不進行折疊的蛋白質［2］。多項研究已經證明Hsp90的分子伴侶功能。酶、類固醇受體、轉錄因子蛋白質的一級序列中存在疏水性基團，Hsp90可以協助這些疏水性基團折疊到其球形蛋白的內部，以防止疏水性基團自發地聚集而失去正常的結構和功能［3］。Hsp90經常與Hsp70和Hsp40合作發揮分子伴侶功能［4］，純化的Hsp90可以穩定熱變性的蛋白質，包括檸檬酸合成酶、硫氰酸酶、蛋白激酶2［5-6］。Hsp90的目標蛋白常在信號通路中發揮作用，典型的目標蛋白有類固醇受體和v-Src蛋白激酶。

1.2 細胞骨架 在非應激情況下，Hsp90占哺乳動物細胞內總蛋白的1%～2%，而在應激條件下會增加到4%～6%，由于其龐大的數量和分子伴侶的性質，Hsp90在細胞漿內常參與細胞骨架的形成。體外實驗［7］發現Hsp90與肌動蛋白絲交聯，其分解產物Hsp90cl會導致肌動蛋白的氧化累積增強，而防止Hsp90降解可以減少肌動蛋白氧化的積累。另有研究［8］表明乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X，HBx）可以與鈣調蛋白相互作用，從而使Hsp90與鈣調蛋白脫離，并增強Hsp90的活性，啟動下游的Hsp90/LIMK1/cofilin通路實現肌動蛋白的重組。此外Hsp90可以與微管蛋白發生作用并保護其受熱變性［9］，且Hsp90與動植物細胞中的微管都存在相互作用［10］。

1.3 核內功能 細胞核中Hsp90在正常情況下占核內總蛋白的5%～10%，而在應激條件下，Hsp90的核內占比有所增加。在核內Hsp90可以與DNA、RNA以及組蛋白結合。Hsp90可以和細胞分裂周期蛋白37共同參與細胞周期相關蛋白激酶的折疊，如細胞周期蛋白依賴性激酶4/6［11］、細胞周期依賴性激酶11p110［12］以及細胞周期依賴性激酶調節蛋白Wee1等［13］。

2 Hsp90參與HBV的復制過程

2.1 Hsp90促進HBV核衣殼的形成 HBV的部分雙鏈環狀DNA在機體內可以表達4種蛋白質，即表面蛋白（HBs）、核心蛋白（HBc）、DNA聚合酶/逆轉錄酶（polymerase-reverse transcriptase，Pol/RT）和HBx（圖1）。HBc在HBV的復制周期中起到重要作用，它可以分為氨基端和羧基端，羧基端能夠調節病毒復制而氨基端參與HBc的組裝［14］。在HBV復制的起始階段，HBc會形成一個同源二聚體，而后90個或120個二聚體自我組裝成二十面體的核衣殼，該衣殼可以將Pol/RT、pgRNA以及其他對病毒復制起重要作用的因子如Hsp、蛋白激酶等共同封裝在其內部從而保護病毒DNA不受外界干擾。最終的病毒是由HBc與病毒基因組及其他蛋白組裝產生，因此HBc對病毒的成熟至關重要［15］。Shim等［16］的研究證實Hsp90可以與HBc二聚體結合以促進核衣殼形成，并且核衣殼的形成過程依賴其反應溫度，Hsp90可以降低不同溫度條件下核衣殼的分解。該研究還在HepG2.2.15細胞中發現，當Hsp90表達下調或其活性受到抑制后，HBV的復制將受到抑制。此外有實驗［17］證實了Hsp90表達下調或活性受到抑制并不影響HBc的表達，而是通過影響HBc的組裝來抑制HBV的復制。Zhao等［18］研究首次表明HBc二聚體在封裝pgRNA前是高度磷酸化狀態，而封裝之后則發生去磷酸化，在這一過程中Hsp90抑制劑可以通過抑制pgRNA的封裝來干擾HBc的去磷酸化，該研究結果表明了Hsp90對HBc的潛在增強機制。Makokha等［19］研究顯示Hsp90可以與TAR DNA結合蛋白（transactive response DNA-binding protein，TARDBP）相互作用，后者作為一種多功能蛋白可以調節HBV的復制，沉默或敲除TARDBP均會嚴重破壞病毒的復制過程。除Hsp90以外，TARDBP還可與許多其他支持HBV生命周期的蛋白如核仁磷酸蛋白1、多聚ADP核糖轉移酶1、脯氨酸和谷氨酰胺剪接因子等蛋白相結合。

圖1 HBV復制過程示意圖Figure 1 Diagram of HBV replication process

2.2 Hsp90促進pgRNA的逆轉錄 HBV的基因組雖然是一組雙鏈DNA，但其復制是由pgRNA經過逆轉錄形成的。此外，pgRNA逆轉錄過程的關鍵酶是pgRNA自身表達所生成。在逆轉錄的起始階段，逆轉錄酶識別pgRNA 5'端的ε結構，以其內部凸起（5'-UUC-3'）為模板，并由自身的第63個酪氨酸充當引物［20-21］，形成逆轉錄酶-dGAA復合體，然后逆轉錄酶再轉運至pgRNA 3'端的直接重復序列1來完成DNA負鏈的合成。在HBV的生命周期中，逆轉錄酶與pgRNA的結合啟動了HBV復制早期的兩個關鍵事件，即逆轉錄和核衣殼封裝。前者實現了pgRNA的逆轉錄，后者導致逆轉錄酶和pgRNA被HBc選擇性的封裝［13］。Hu等［22］實驗證實在逆轉錄酶與pgRNA的結合過程中Hsp90不可或缺，抑制Hsp90的表達將導致封裝進核衣殼的pgRNA數量下降，并且此過程依賴于ATP的水解。盡管Hsp70或Hsp40也可以促進逆轉錄酶與pgRNA的結合，但只有在Hsp90共同參與的情況下，Hsp70或Hsp40才能最大程度地促進逆轉錄酶與pgRNA的結合［23］。Gyoo Park等［24］研究表明Hsp90通過與逆轉錄酶的結合影響pgRNA逆轉錄的起始，加入Hsp90抗體（3G3）將降低逆轉錄酶的逆轉錄活性，從而表明Hsp90對逆轉錄酶在逆轉錄過程中發揮正常功能十分重要。

3 Hsp90與其他分子相互作用參與HBV的復制過程

3.1 Hsp90與Hsp70相互作用 Hsp70也是細胞內分子伴侶網絡中的組成成分，并且與Hsp90常常組成蛋白復合體共同發揮作用［25］。在HBV相關肝細胞癌的進展中，Hsp70與Hsp90的表達上調，并通過逆轉錄酶-Hsp復合體的形式影響核衣殼封裝與病毒DNA的合成［26］。Seo等［27］研究證實，Hsp70可以與Hsp90協同增加病毒衣殼的形成，隨著Hsp70水平的提高，核衣殼形成的速率也會增加，并且這種協同效應來自于HBc六聚體的形成。此外，核仁磷蛋白同樣具有促進核衣殼形成的效應，但不具備與Hsp90的協同作用。

3.2 Hsp90與ROS相互作用 HBV在感染過程中會影響線粒體功能從而產生ROS，ROS又可以通過改變細胞的氧化還原狀態和激活類似核因子-κB的轉錄因子從而提高病毒的復制水平。不斷積累的ROS會導致細胞增殖異常和染色體突變，從而促進肝細胞癌的發展，而Hsp90和谷胱甘肽可以作為抗氧化成分發揮抗氧化防御作用［28］。Kim等［25］研究發現當Hsp90存在時，ROS可以促進HBV的核衣殼形成，而Hsp90不存在時ROS則會抑制HBV的核衣殼形成。此外，谷胱甘肽可以通過抑制Hsp90的功能來減慢核衣殼形成。ROS和谷胱甘肽都會引起Hsp90與p23、ATP復合體的構象改變，前者會引起a-螺旋的輕度降低，而后者會導致a-螺旋升高。

3.3 Hsp90與A3G相互作用 A3G是在細胞內廣泛表達的RNA編輯酶，具有胞苷脫氨酶活性，可誘導胞嘧啶突變為尿嘧啶。A3G不僅在癌變過程中經常表達上調，而且能夠抑制包括HBV在內的多種逆轉錄病毒，常參與宿主對抗病毒的免疫過程。Turelli等［29］發現A3G具有抑制DNA復制的作用，并進一步推測該機制與A3G阻斷HBV前基因組pgRNA封裝至衣殼的過程有關。Nguyen等［30］研究發現A3G進入核衣殼發揮效應的同時需要HBV逆轉錄酶和pgRNA片段ε以及自身氨基末端的完整性。Chen等［31］在HepG2細胞實驗中發現Hsp90可以刺激A3G的脫氨酶活性，進一步的測序分析顯示Hsp90增加了A3G介導的HBV基因的胞嘧啶突變效率和總HBV基因突變頻率，并且能夠改變A3G對HBV基因的胞嘧啶區域選擇性，而Hsp90抑制劑呈劑量依賴性地抑制HBV的A3G突變活性，從而表明Hsp90在固有免疫抗病毒的過程中有一定的潛在作用，而Hsp90是否能通過影響A3G的脫氨酶活性對HBV復制產生影響有待進一步探究。

4 Hsp90抑制劑對HBV復制的作用

由于Hsp90參與pol-ε復合體的形成，并且可以和HBc相互作用穩定核衣殼，因此Hsp90小分子抑制劑均具有抑制HBV復制的潛力［32］。目前Hsp90的抑制機理主要圍繞氨基端的ATP競爭抑制。格爾德霉素（Geldanamycin，GM）是天然的小分子Hsp90抑制劑，其可以在Hsp90氨基端的口袋結構模擬核苷酸結構達到抑制效果，但是存在嚴重的肝毒性和溶解性差的問題。為了克服GM系列物的副作用，Brough等開發出基于間苯二酚的抑制劑Luminespib（NVPAUY922）［33］，后續同類型的抑制劑還有AT13387，其作用方式與GM類似，此外還有基于嘌呤環結構的衍生物Zelavespib（PU-H71）、Icapamespib（PU-AD）、BIIB021等［3］。另有研究［34］顯示KNK437能夠通過抑制Hsp90的活性來抑制HBV的復制和轉錄。此外Hsp90抑制劑對腫瘤細胞的敏感性高于正常細胞，新型Hsp90抑制劑SNX-2112可加強肝癌細胞凋亡［35］，Hsp90抑制劑Ganetespib（STA-9090）能夠抑制c-Myc依賴性食管鱗狀腫瘤生長［36］。

綜上所述，本文對Hsp90的生理功能進行了簡介，并重點歸納總結了Hsp90在HBV復制過程中的作用，即參與促進核衣殼的形成，并對HBV逆轉錄酶的活性有重要調節作用，能夠直接影響HBV的復制效率，以及與胞內其他分子相互作用來促進HBV的復制。這些研究充分證明了Hsp90在HBV復制過程中的關鍵作用，表明Hsp90可作為潛在的生物靶點來開展抗HBV的藥物研發，為慢性乙型肝炎的防治提供新的理論指導和方向。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：花胤負責撰寫和修改論文；方海麗、劉守勝負責參與文獻的收集和整理；宣世英、張梅、辛永寧負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。