豉香型白酒主要風味成分調節醉酒效果及肝損傷保護作用

張敬媛，杜壽杰，關菁怡，何松貴，張仁杰，3，吳振強*

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山 528203；3.江門市泛亞生物工程與健康研究院，廣東 江門 529000）

豉香型白酒有著十分悠久的歷史，是我國珠江三角洲地區傳統地域性產品，其入口順喉綿甜，回味悠遠，俗稱“玉冰燒”或“肉冰燒”[1]，該產品已錄入廣東省非物質文化遺產，以及國家地理標志產品[2]。有研究表明，適度飲酒有助于抗類風濕性關節炎[3]、預防肥胖[4]、非酒精性肝病[5]、心腦血管疾病[6]、癡呆[7]等；也有研究指出，過量飲酒將會增加頭疼眩暈[8]、腸道損傷、患高血壓、糖尿病[9]、高乳酸血癥[10]、癌癥的風險[11]。豉香型白酒中2%的微量成分[12]的配比和平衡關系是保證其香氣、味道、醉酒效果的關鍵因素[13]。關于這些微量成分對風味的影響已有部分研究[14-15]，而關于其對醉酒效果影響的研究還有待深入。

為了量化酒類產品中物質的致醉作用，WU Z Q等[16]結合小鼠酒后血液乙醇濃度變化和運動能力的測試，推算小鼠的綜合醉酒情況，形成了一個科學、精確且相對快速的醉酒程度評價動物模型。彭斌[14]通過藥物代謝動力學軟件處理數據，再結合水迷宮實驗增加記憶能力檢測，對醉酒程度的檢測方式進行了優化。該研究完善了醉酒程度評價體系，為探究微量成分對酒類產品的致醉效果提供了更可靠和完善的技術。XIE J等[17]通過對不同白酒關鍵微量醇、酸、酯配比的致醉程度進行研究，揭示了其主要通過影響乙醇代謝導致致醉程度差異。其中乙酸和乙酸乙酯可以顯著降低醉酒程度，異丁醇和異戊醇則相反。彭斌等[18]進一步研究了白酒中醇、酸、酯等微量成分的濃度和比例對酒后小鼠的作用，結果發現，適量高濃度的乙酸有利于促進乙醇代謝，同時減緩其他組分對乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）活性的抑制作用，能夠刺激小鼠記憶能力，顯著降低逃逸潛伏時間，過高的雜醇，尤其是異戊醇，作用效果則相反。

本研究將通過研究豉香型白酒的主要香氣成分對小鼠血液乙醇代謝、行為能力和急性酒精性肝損傷的作用程度及作用機理，挖掘豉香型白酒降低醉酒程度的因子，進一步為低醉酒程度白酒的研制和生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗小鼠：無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級雄性昆明小鼠，體質量18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，小鼠在溫度25～28 ℃、相對濕度60%、自然光照環境中適應性飼養一周，期間自由進食進水，實驗前一晚禁食不禁水。按照《廣東省動物實驗管理條例》（2010年10月1日）要求進行。

肝素鈉（≥180 U/mg）、無水乙醇、乙腈、乙縮醛、反-2,4-癸二烯醛、丁二酸二乙酯、庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯、苯甲醇、β-苯乙醇（均為色譜純）、壬醛、反-2-辛烯醛、反-2-癸烯醛、庚二酸、辛二酸、壬二酸、3-甲硫基-1-丙醇（均為分析純）：Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司；乙醛（色譜純）、叔丁醇、辛醛、反-2-壬烯醛、壬二酸二乙酯（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

總蛋白定量測試盒、乙醇脫氫酶測試盒、乙醛脫氫酶測試盒、谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）測試盒、谷草轉氨酶（aminotransferase aspartate，AST）測試盒、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒：南京建成生物工程研究所。

豉香型白酒五年陳酒（酒精度為38%vol）：由廣東省九江酒廠有限公司提供，其主要的風味物質種類及含量見表1[19-22]。

表1 五年陳酒中主要風味物質種類及含量Table 1 Types and contents of major flavor substances in five-year aged Baijiu

1.2 儀器與設備

Morris水迷宮：上海欣軟信息科技有限公司；KK24E78TI西門子冰箱：博西華家用電器有限公司；5804R冷凍離心機：德國Eppendorf公司；GC-2014C氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、GsBP-Inowax色譜柱（30 m×0.32 mm×0.40 μm）：日本島津公司；BS224S分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；HH-S水浴鍋：上海程造儀器設備有限公司；KQ-400KDE型超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；MX-S可調式混勻儀：大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；FJ200-SH數顯恒速高速分散均質機：上海滬析實業有限公司；TGL-16G型高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；SpectraMax M5多功能酶標儀：美國Molecular Devices公司；UV-2802S型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 主要風味成分缺失配制酒的制備

以體積分數為30%的乙醇為基酒，添加表1中所有物質制備對照組；依據表1中五年陳酒的主要風味物質成分含量，刪除某些成分或某類物質，配制出酒精度為30%vol的相應風味成分缺失的配制酒酒樣（formula liquors，FLs），具體見表2，用以探討主要風味成分缺失對醉酒程度、小鼠酒精代謝和急性酒精性肝臟損傷的作用。

表2 配制酒酒樣及相應缺失組分Table 2 Blending liquors samples and corresponding missing components

1.3.2 血液乙醇濃度測定

小鼠隨機分組，每組24只，再隨機分為3小組，作為3組平行實驗。對照組小鼠灌胃對照溶液（4 g/kg體質量），實驗組小鼠灌胃相同劑量的FLs，均只灌胃一次。每小組小鼠分別在灌胃后30 min、60 min、75 min、90 min、120 min、180 min、240 min用尾靜脈穿刺法采集血液50 μL，收集于含烘干肝素鈉（配制1 800 U/mL的肝素鈉溶液潤濕離心管內壁，烘干）的1.5 mL離心管中，再加入425 μL乙腈、25 μL叔丁醇內標溶液（500 mg/L）混勻，12 000 r/min離心10 min，取上層液體經0.22 μm尼龍膜過濾至氣相瓶，采用GC法測定血液乙醇濃度（blood alcohol concentration，BAC）[14]。

為了更清晰直觀的分析各種酒樣對酒精代謝的作用，通過藥物代謝動力學程序DAS 2.0分析血液乙醇濃度隨時間變化的數據，由此得出了乙醇代謝的動力學參數，主要包括藥峰濃度（peak concentration，Cmax）和時間曲線下面積（area under curve，AUC）（0-∞）。血液乙醇濃度實驗從生理學角度反映醉酒程度變化，即Cmax值低，AUC（0-∞）值小，則血液乙醇代謝快，醉酒程度小；反之，Cmax值高，AUC（0-∞）值大，則血液乙醇代謝慢，醉酒程度大[14]。

1.3.3 記憶和行為能力測定

采用Morris水迷宮實驗研究小鼠空間學習記憶能力[14]。Morris水迷宮由直徑120 cm水池和直徑9 cm平臺組成，輔以錄像裝置、分析軟件和加熱裝置。實驗時將水灌至高于平臺1.5 cm處，用加熱器保持水溫在25.5～27.0 ℃。水池四周貼上不同的視覺標志，幫助小鼠記憶、尋找逃生平臺。小鼠先進行連續3 d的認知學習，開始訓練時將小鼠從一個隨機的位置放入迷宮中，若60 s內沒有找到水下平臺，則將其放在平臺上15 s加強記憶；若60 s內找到平臺，則將其取出擦干，放入墊有干燥墊料的塑料籠中。第4天正式進行實驗，小鼠隨機分組，每組4只，對照組小鼠灌胃對照溶液（4 g/kg體質量），實驗組小鼠灌胃相同劑量FLs，均只灌胃一次。每只小鼠分別在灌胃后1 h、2 h、3 h、4 h從一個隨機的位置放入迷宮中，計時90 s，直至小鼠找到平臺或時間至90 s（90 s內小鼠未找到平臺則記為90 s），將小鼠取出擦干，放入墊有干燥墊料的塑料籠中。錄像裝置將全程記錄小鼠實驗過程，得到小鼠找到平臺時間，即逃逸潛伏期（escape latency，ELT）和游泳速度（velocity，V）。水迷宮實驗從行為學角度反映醉酒程度變化，即ELT短，V快，則認知記憶能力強，行動能力強，醉酒程度小；反之，ELT長，V慢，則認知記憶能力弱，行動能力弱，醉酒程度大[14]。

1.3.4 小鼠乙醇代謝酶分析

小鼠隨機分組，每組4只，作為4組平行實驗。對照組小鼠灌胃對照溶液（4 g/kg體質量），實驗組小鼠灌胃相同劑量FLs，均只灌胃一次。每小組小鼠在灌胃后2 h摘眼球取血，再頸椎脫臼處死，取肝臟。肝臟先用4 ℃的預冷生理鹽水洗去血水，用濾紙片吸干后稱取0.1 g左右的肝組織放入10 mL離心管內，然后再加入9倍體積的預冷生理鹽水（或ALDH測試盒中的提取液），并在冰水浴條件下機械勻漿至10%的肝組織勻漿，4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min后，收集上清，采用預冷生理鹽水（或ALDH測試盒中的提取液）稀釋成1.0%、0.5%肝組織勻漿，待測。根據試劑盒說明，測定樣品總蛋白含量、ADH活性、ALDH活性。

1.3.5 小鼠急性酒精性肝損傷分析

小鼠隨機分組，每組4只，作為4組平行實驗。對照組小鼠灌胃對照溶液（6 g/kg體質量），實驗組小鼠灌胃相同劑量FLs，均只灌胃一次。每組小鼠在灌胃后6 h摘眼球取血，再頸椎脫臼處死，取肝臟。血樣于常溫靜置1 h后，4 ℃條件下6 000 r/min離心10 min，收集上清，待測。根據試劑盒說明，測定樣品ALT、AST活性。肝臟勻漿制備方法同1.3.4，稀釋成1.0%、0.5%、0.04%肝組織勻漿，待測。根據試劑盒說明，測定樣品總蛋白含量、SOD活性、MDA活性。

1.3.6 數據處理及統計分析

血液乙醇濃度實驗數據為3組平行，記憶和行為能力實驗數據為4組平行，結果用“平均值±標準差”表示。采用IBM SPSS 26.0軟件進行組間差異顯著性分析，用Origin 2018軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 主要風味成分缺失對血液乙醇代謝的影響

BAC通常被用作酒精中毒的法定、醫療指標，有報道稱BAC對人類行為和損傷有漸進性影響[23]。不同主要風味成分缺失配制酒酒樣對小鼠血液乙醇代謝動力學參數的影響見表3。

表3 不同配制酒酒樣對小鼠血液乙醇代謝動力學參數的影響Table 3 Effect of different blending liquors samples on the kinetic parameters of alcohol metabolism in blood of mice

由表3可知，與對照組相比，A組（所有醛缺失）的Cmax和AUC極顯著降低（P＜0.01），D組（所有醇缺失）的Cmax和AUC顯著降低（P＜0.05），小鼠血液乙醇代謝加強；B組（所有二元酸缺失）的AUC極顯著升高（P＜0.01），小鼠血液乙醇代謝減弱；C組（所有二元酸二乙酯缺失）的Cmax和AUC無顯著變化（P＞0.05），對小鼠血液乙醇代謝影響不明顯。結果表明，缺失的醛類物質以及醇類物質是起關鍵致醉效果的成分，缺失的二元酸類物質是起關鍵降低醉酒效果的成分，缺失的酯類物質對醉酒效果影響不明顯。

白酒中的部分醛類物質濃度過高時，會使白酒出現強烈的刺激性和辣味，對口腔和食道黏膜產生影響[24]，且某些醛類化合物會損傷肝臟、心腦血管、增加癌癥風險[25]，所以應將其含量控制在適當范圍內。白酒中的高級醇，在水溶液中呈油狀液體，又稱“雜醇油”[26]。雜醇油含量不協調時，白酒苦澀、辛辣增加，風味及風格破壞，同時引起嗓子發干，使人“上臉”，麻醉人體神經系統，損害腦神經細胞，使人“上頭”，引發肝損傷、心跳加速、血壓上升等[27]。白酒中的酸類物質含量合適時，有助于新酒老熟，使白酒的香氣穩定、豐滿、柔和而清爽[28]。并且能在降低喝酒后上頭、口感不適等現象的同時，具有如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗血管硬化、助消化、降肺火等多種生物活性[29-31]。

A-1組（乙醛缺失）的Cmax和AUC顯著降低（P＜0.05），小鼠血液乙醇代謝加強。B-1組（辛二酸缺失）的AUC顯著升高（P＜0.05），小鼠血液乙醇代謝減弱。結果表明，醛類物質中乙醛起主要作用，二元酸類物質辛二酸起主要作用，其他物質雖然有一定作用趨勢但是作用效果不明顯。

乙醇在人體內的代謝是一個復雜、漫長的過程，進入人體后小部分先在胃和腸道吸收，大部分進入肝臟進行主要代謝，還有小部分隨汗液和尿液排出[32]。乙醇在肝臟中的代謝分為三類：主要通過ADH催化轉化成乙醛，乙醛再通過ALDH催化轉化成乙酸，剩余部分通過氧化氫酶和微粒體乙醇氧化系統處理[33]。所以乙醛的堆積，也是導致乙醇代謝緩慢的關鍵因素。有研究表明，在豉香型白酒肥肉浸壇的過程中，肉中油脂通過水解和ω-氧化分解后產生的羧酸類物質，其中庚二酸、辛二酸和壬二酸等，合稱“二元酸”，可與酒中的醇類物質酯化形成二元酸二乙酯及高級不飽和脂肪酸，這些物質能夠提高酒中各組分的穩定性，在飲酒后也更利于產生競爭性吸收，減少酒精的消化吸收速率，從而降低機體在吸收酒精后帶來的刺激性和傷害[15]。且有研究表明，辛二酸具有緩解皮膚老化的作用[34]。因此，辛二酸具有緩解醉酒程度的作用，同時辛二酸為二元酸，是可代謝脂肪酸，對人身體無毒害作用[35]。作用不明顯的物質可能與其含量較低相關，自然發酵產生的這些物質本身很少，如果加其濃度能顯著的探究出其降低醉酒程度作用，可以通過額外添加或者探索發酵途徑或者跟別的物質相互影響達到降低醉酒程度的目的，但需要注意的是額外添加物質可能對白酒風味或者其他方面產生影響。

2.2 主要風味成分缺失對記憶和行為能力的影響

根據酒后小鼠在水迷宮實驗中的ELT和V，可判斷小鼠認知記憶和行為能力，不同主要風味成分缺失配制酒酒樣對小鼠記憶和行為能力的影響見圖1。

圖1 不同配制酒酒樣對小鼠行為學參數的影響Fig.1 Effect of different blending liquors samples on behavioral parameters of mice

由圖1可知，與對照組相比，3 h時，A組（所有醛缺失）、D組（所有醇缺失）小鼠逃逸潛伏時間極顯著減短（P＜0.01），小鼠認知記憶能力增強，B組（所有二元酸缺失）小鼠逃逸潛伏時間極顯著加長（P＜0.01），小鼠認知記憶能力減弱，C組（所有二元酸二乙酯缺失）小鼠逃逸潛伏時間無顯著變化（P＞0.05），對小鼠認知記憶能力影響不明顯。3 h時，A組（所有醛缺失）和D組（所有醇缺失）小鼠游泳速度極顯著加快（P＜0.01），小鼠運動能力增強；4 h時，B組（所有二元酸缺失）小鼠游泳速度顯著減慢（P＜0.05），小鼠運動能力減弱。C組（所有二元酸二乙酯缺失）小鼠逃逸潛伏時間無顯著變化（P＞0.05），對小鼠運動能力影響不明顯。這些物質對行為學的影響印證了2.1的結果，說明這些物質對醉酒程度的影響不僅只通過對血液乙醇代謝產生影響，還通過對運動記憶能力產生影響。

高級醇化學構造比乙醇更加復雜，在人體內的氧化分解代謝速度較乙醇慢，對機體的刺激作用持續時間較長，對中樞神經系統產生的毒害影響是直接而持久的[36]，對人類神經所形成的抑制、毒害和麻醉效果比乙醇強，因此對小鼠的行為造成比較持續性的影響。白酒中過高濃度的雜醇可抑制三羧酸循環，并引起由醇代謝的有機酸在體內累積而帶來的興奮抑制[37]。某些白酒成分如有機酸等，則對人體酒精代謝可起到促進作用，有減輕乙醇毒害的作用[38]。

由圖1亦可知，與對照組相比，3 h和4 h時，A-1組（乙醛缺失）小鼠逃逸潛伏時間顯著減短（P＜0.05），D-1組（β-苯乙醇缺失）小鼠逃逸潛伏時間極顯著減短（P＜0.01），小鼠認知記憶能力增強。3 h時，B-1組（辛二酸缺失）小鼠逃逸潛伏時間極顯著加長（P＜0.01），B-2組（壬二酸缺失）小鼠逃逸潛伏時間顯著加長（P＜0.05），小鼠認知記憶能力減弱。其他單物質缺失組逃逸潛伏時間無明顯變化（P＞0.05），對小鼠運動能力影響不明顯。1 h時，D-1組（β-苯乙醇缺失）小鼠游泳速度顯著加快（P＜0.05），3 h時，A-1組（乙醛缺失）和D-1組（β-苯乙醇缺失）小鼠游泳速度極顯著加快（P＜0.01），小鼠運動能力增強。其他單物質缺失組游泳速度無明顯變化（P＞0.05），對小鼠運動能力影響不明顯。說明醛類物質起主要作用的是乙醛，醇類物質起主要作用的是β-苯乙醇，二元酸類物質起主要作用的是辛二酸、壬二酸，其他物質雖然有一定作用趨勢但是作用效果不明顯。

乙醛是飲酒養成“酒癮”的原因，可與人體內的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和蛋白質共價結合，形成的各種DNA加成產物和乙醛-蛋白質加成產物（acetaldehyde protein adduct，APA）干擾細胞功能，引起酶活性降低或丟失、DNA修復蛋白功能異常[39]、線粒體和肝組織的微管結構損傷、脂過氧化反應，損害肝細胞[40]。同時乙醛也會干擾谷胱甘肽過氧化物酶水平，提高機體的抗氧化壓力；造成局部結腸黏膜的損害，引發大腸道黏膜的惡變[15]；導致微管功能障礙，產生糖缺失轉鐵蛋白（酒精性肝病特異性標志物），干擾營養產物的運送[41]，對小鼠的行為能力影響較大。β-苯乙醇的攝入或經由肌膚直接接觸后，對眼部、肌膚、黏膜和呼吸道產生強烈刺激作用，接觸后引起頭痛、眩暈、惡心、腹瀉、咳嗽、氣短等[42]，對小鼠的行為能力產生負作用。有研究證明，壬二酸具有抗炎功能[43]，可以減少活性氧和炎性因子[44]，具有抗增生和抗細胞毒素[45]以及抗動脈粥樣硬化作用[46]，利于增強小鼠行為能力。

綜上所述，乙醛、β-苯乙醛是豉香型白酒主要的致醉物質，在實際生產中，應控制其含量。而辛二酸、壬二酸都對豉香型白酒有降低醉酒程度作用，在實際生產中，可以適當的增加其含量。

2.3 主要風味成分缺失對乙醇代謝酶及急性酒精性肝損傷的影響

根據酒后小鼠肝臟ADH、ALDH活性，血清ALT、AST濃度和肝臟SOD、MDA水平的變化，可判斷小鼠乙醇代謝變化的機理以及急性酒精性肝損傷的歸因，不同主要風味成分缺失配制酒酒樣對小鼠乙醇代謝酶和急性酒精性肝損傷的影響見圖2。

圖2 不同配制酒酒樣對乙醇代謝酶和急性酒精性肝損傷的影響Fig.2 Effect of different blending liquors samples on ethanol metabolizing enzymes and acute alcoholic liver injury

由圖2可知，與對照組相比，灌胃不同的豉香型主要風味成分缺失酒樣后，關于ADH活性，A組（所有醛缺失）極顯著升高25.94%（P＜0.01），A-1組（乙醛缺失）顯著升高21.06%（P＜0.05），B組（所有二元酸缺失）顯著降低22.43%（P＜0.05），D組（所有醇缺失）顯著升高20.83%（P＜0.05）；關于ALDH活性，A組（所有醛缺失）極顯著升高37.58%（P＜0.01），說明小鼠主要通過影響ADH活性影響乙醇代謝。對于血清ALT，各組無顯著性差異（P＞0.05）；對于血清AST，A組（所有醛缺失）極顯著降低23.36%（P＜0.01），A-1組（乙醛缺失）極顯著降低29.37%（P＜0.01）；B組（二元酸缺失）極顯著升高14.63%（P＜0.01），說明小鼠主要通過影響血清AST水平影響肝臟抗氧化能力。對于肝臟SOD，A組（所有醛缺失）極顯著升高26.77%（P＜0.01），A-1組（乙醛缺失）極顯著升高22.98%（P＜0.01）；對于肝臟MDA，A組（所有醛缺失）極顯著降低34.51%（P＜0.01），A-1組（乙醛缺失）極顯著降低26.36%（P＜0.01），B組（二元酸缺失）顯著升高35.47%（P＜0.05），B-2組（壬二酸缺失）顯著升高19.66%（P＜0.05），D組（所有醇缺失）顯著降低19.34%（P＜0.05），D-1組（β-苯乙醇缺失）極顯著降低28.45%（P＜0.01），說明小鼠主要通過影響肝臟MDA水平影響肝臟抗氧化、抗脂質過氧化能力。

總的來說，豉香型白酒中主要風味成分對醉酒程度的調節作用主要是通過抑制ADH活性，影響肝臟乙醇代謝；通過調節血清AST水平，影響急性酒精性肝損傷；調節肝臟MDA水平，影響肝臟抗氧化、抗脂質過氧化。

3 結論

本研究著重探討了豉香型白酒的主要風味成分對其醉酒程度的調節作用，同時還通過對小鼠體內乙醇代謝關鍵酶及急性肝損傷中關鍵生物參數的檢測，研究了醉酒程度調控與乙醇代謝以及急性酒精性肝損傷之間的交叉關聯。結果發現，豉香型白酒主要風味成分對酒的醉酒程度及乙醇代謝和急性酒精性肝損傷保護具有重要作用。其中，二元酸類物質是主要的降低醉酒程度的因子，醛類物質和醇類物質則相反，二元酸二乙酯類物質對醉酒程度的作用不大。二元酸類物質中辛二酸和壬二酸都有較好的降低醉酒程度的作用，能有利于促進血液乙醇代謝，同時提升小鼠記憶、運動能力。醛類、醇類物質中乙醛、β-苯乙醛則相反。這些成分對乙醇代謝以及急性酒精性損傷的調節作用主要是通過影響酒后肝臟乙醇脫氫酶活性以及血清谷草轉氨酶活性和肝臟丙二醛含量。本研究探究豉香型白酒醉酒程度中醛類物質和豉香型白酒主要風味成分對醉酒程度的調節作用及作用機理，挖掘了新的低醉酒程度調控因子，對白酒的生產工藝提供了方向，為高質量白酒的生產提供了理論支持，為解酒保肝類藥物的研制提供了數據支撐。后續可補充完善其他酒類成分或者外加解酒保肝類物質調節醉酒效果；與酒類產品實際生產相結合，進一步明確具體控制參數；繼續利用豚鼠、兔、犬等試驗加以證明，最后再與人體醉酒研究相結合，從而確立小鼠醉酒程度評價和人體醉酒程度研究之間的關聯，進行進一步研究。