脈沖強光誘變選育高產(chǎn)乳酸植物乳桿菌及其益生特性研究

葛善贏，張海濤，王士佳，李佳宸，吳學智，張佰清*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，遼寧 營口 115009）

益生菌作為有益微生物（酵母或細菌），在與宿主共生時能給人體帶來有益的保健作用[1]。目前，在發(fā)酵食品加工中利用率最廣的益生菌為乳酸菌。乳酸菌是一類革蘭氏染色陽性、無芽孢的菌株，其可以通過發(fā)酵糖類而產(chǎn)生大量的乳酸，在自然界中廣泛地存在[2]，是一類應(yīng)用較早的微生物，主要用于生產(chǎn)發(fā)酵食品，賦予產(chǎn)品豐富的滋味和香氣特征，提高其益生性能及抗氧化性能[3-4]。

目前，通過誘變育種來提高乳酸菌菌株的產(chǎn)乳酸能力，常見的誘變技術(shù)有紫外誘變、化學試劑誘變、常壓室溫等離子體技術(shù)等[5-7]，然而，國內(nèi)關(guān)于利用脈沖強光技術(shù)誘變選育高產(chǎn)酸乳酸菌的研究鮮有報道。與其他誘變技術(shù)相比，脈沖強光技術(shù)作為一種新型誘變技術(shù)，具有耗能低、效率高、處理時間短、操作簡單等優(yōu)點[8-9]。在對枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等菌株中成功運用，可篩選出耐熱、耐酸、耐膽鹽等性能良好的突變株[10-13]。

為進一步提高植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC 6240的產(chǎn)乳酸能力，本研究以其為研究對象，采用脈沖強光進行誘變處理，并以乳酸含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法優(yōu)化最佳處理條件。采用最佳脈沖強光對植物乳桿菌CICC 6240進行誘變后，通過溶鈣圈法和乳酸產(chǎn)量測定選育產(chǎn)乳酸能力高的突變株，并對其耐酸、耐膽鹽、人工胃腸液耐受性、疏水性、自聚集能力進行研究，初步探究突變菌株的益生性能，考察脈沖強光作為一種新型的誘變技術(shù)應(yīng)用于植物乳桿菌誘變的可行性，為誘變技術(shù)的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC 6240：沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院保藏。

1.1.2 試劑

胃蛋白酶（800 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、碳酸鈣、瓊脂粉、氫氧化鈉：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；無水乳酸鋰、對羥基聯(lián)苯、鎢酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈣、濃硫酸、鹽酸、豬膽鹽、二甲苯、氯仿、乙酸乙酯：沈陽伽瑪商貿(mào)有限公司；葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、吐溫80：沈陽萊博科貿(mào)有限公司。本研究所用試劑均為分析純或生化試劑。

人工胃液：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersaline，PBS）、胃蛋白酶3.0 g/L，鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5，過0.45 μm濾膜除菌。人工腸液：磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶1.0 g/L，氫氧化鈉調(diào)pH至8.0，過0.45 μm濾膜除菌。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液（固）體培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QL-10152氙燈管：沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院研制；YX-280A高壓蒸汽滅菌鍋、DK-S22恒溫水浴鍋：常州國華科技有限公司；250Lwi17192恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；2-16KL離心機：美國Sigma公司；Libra S50紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化和菌懸液的制備

將保藏于-80 ℃冰箱的植物乳桿菌CICC6240接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，將菌株活化3次后培養(yǎng)至對數(shù)期，8 000 r/min離心10 min，去上清，用0.85%無菌生理鹽水清洗菌體表面3次，采用等體積的0.85%無菌生理鹽水重懸菌體并稀釋106倍制成菌懸液。

1.3.2 脈沖強光誘變條件的確定

取10 mL菌懸液進行脈沖強光照射，在單因素試驗結(jié)果（脈沖電壓1 600 V、脈沖次數(shù)16次、脈沖距離9 cm）的基礎(chǔ)上，以脈沖電壓（A）、脈沖次數(shù)（B）、脈沖距離（C）為考察因素，乳酸產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert V12.0.3.0設(shè)計3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗，試驗因素與水平見表1[14-15]。

表1 脈沖強光誘變條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for pulsed light mutagenesis conditions optimization

1.3.3 致死率的計算

取200 μL脈沖強光照射處理后的菌懸液均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，記錄誘變后菌落數(shù)；取200 μL未經(jīng)脈沖處理菌懸液，相同條件涂布培養(yǎng)，記錄誘變前菌落數(shù)，并計算致死率，其計算公式如下：

式中：X為菌株致死率，%；N1為誘變前菌落數(shù)，CFU/mL；N2為誘變后菌落數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 高產(chǎn)乳酸突變菌株的篩選

（1）初篩

取200 μL脈沖強光處理后的細胞懸浮液均勻涂布于含有1.5%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)，每組做3次平行。測量誘變菌株的溶鈣圈直徑（H）及菌落直徑（C），計算HC值，挑選其中HC值相比于原始菌株HC值大30%的菌株進行復篩[16]。

（2）復篩

將初篩菌株活化后以2%（V/V）的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)14 h，采用對羥基聯(lián)苯法測定發(fā)酵液乳酸產(chǎn)量[17]，挑選高產(chǎn)乳酸菌株。

1.3.5 益生特性的測定

（1）耐酸能力的測定

將活化3次的菌液以2%（V/V）的接種量接種至pH值分別為2.0、3.0、6.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，試驗重復3次，活菌計數(shù)，計算存活率，其計算公式如下：

式中：X為菌株存活率，%；Nt為不同條件下培養(yǎng)后的活菌數(shù)，CFU/mL；N為初始活菌數(shù)，CFU/mL。

（2）耐人工模擬胃腸液能力的測定

將活化3次的菌液于4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，采用等體積0.85%無菌生理鹽水重懸菌體制備菌懸液。移取1 mL菌懸液于9 mL人工模擬胃液，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，活菌計數(shù)。再取胃液處理后的菌液1 mL接種至9 mL人工模擬腸液，37 ℃培養(yǎng)4 h，活菌計數(shù)，并按照公式（2）計算其存活率。

（3）耐膽鹽能力的測定

將活化3次的菌液以2%（V/V）的接種量接種膽鹽含量分別為0.3%、0.5%、1.0%的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，活菌計數(shù)，并按照公式（2）計算其存活率。

（4）自凝集性的測定

將1.3.1所制備的菌懸液調(diào)整OD600nm值至0.6±0.05，為A0。于37 ℃恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)0 h、3 h、6 h和24 h時，移取上層培養(yǎng)液，測定OD600nm值，為At，試驗重復3次，計算自凝集率，其計算公式如下：

式中：X為自凝集率，%；A0為培養(yǎng)0 h時的OD600nm值；At為不同培養(yǎng)時間的OD600nm值。

（5）表面疏水性的測定

取2 mL菌懸液分別與2 mL二甲苯、氯仿、乙酸乙酯混合，漩渦振蕩10 min，室溫靜置30 min。取水相測定OD600nm值，重復試驗3次，計算疏水率，其計算公式如下：

式中：X為疏水率，%；A0為試劑萃取前水相的OD600nm值；At為試劑萃取后水相的OD600nm值。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個試驗均平行重復3次，測定結(jié)果以“平均值±標準差”表示，使用IBM SPSS Statistics 25.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脈沖強光誘變條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

利用Design-Expert V12.0.3.0軟件進行3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 脈沖強光誘變條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for pulsed light mutagenesis conditions optimization

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert V12.0.3.0軟件對表2結(jié)果進行二次多元回歸擬合，得到多元二次回歸方程：

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型的決定系數(shù)R2為0.983 3，校正決定系數(shù)R2Adj為0.961 8，表明該模型合理，方程與實際擬合較好，能有效反映出菌株產(chǎn)乳酸與脈沖電壓、脈沖次數(shù)和照射距離之間的關(guān)系。由表3亦可知，一次項A、C，交互項AC，二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項B對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其余項則不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對乳酸產(chǎn)量影響大小順序為A（脈沖電壓）＞C（脈沖距離）＞B（脈沖次數(shù)）。

對回歸方程進行最優(yōu)求解，確定最佳誘變條件為：脈沖電壓1 702.15 V、脈沖次數(shù)18.205 4次、脈沖距離9.068 12 cm，在此條件下，乳酸產(chǎn)量預(yù)測值為72.7104μg/mL。為便于實際操作，將最優(yōu)脈沖強光處理條件修訂為：脈沖電壓1 700 V，脈沖次數(shù)18次，脈沖距離9 cm。在此條件下重復進行3次試驗，乳酸產(chǎn)量為69.48 μg/mL，與預(yù)測值相近，且在此條件下，致死率達到82.56%，說明所建模型擬合條件可行，具有實際參考意義。

2.2 脈沖強光誘變選育

2.2.1 初篩

采用最佳脈沖強光誘變處理植物乳桿菌CICC6240，對高產(chǎn)乳酸菌株進行初篩，結(jié)果見圖1。

圖1 高產(chǎn)乳酸突變株的初篩結(jié)果Fig.1 Preliminary screening results of mutant strains with high-yield lactic acid

由圖1可知，27株突變菌株的HC值高于原始菌株HC值（2.6），其中，突變菌株G2、G8、G10、G11、G14、G16、G17、G19的HC值較高，為3.5～4.2。因此，對初篩出的8株突變菌株進行復篩。

2.2.2 復篩

初篩突變菌株的乳酸產(chǎn)量見表4。由表4可知，相較于原始菌株的乳酸產(chǎn)量[（48.22±0.61）μg/mL]，突變菌株的產(chǎn)乳酸能力均有顯著提升（P＜0.05）。其中，突變菌株G10和G16的產(chǎn)乳酸能力較強，分別為76.65 μg/mL、75.48 μg/mL，比原始菌株分別提高58.96%和56.53%。因此，選取突變菌株G10和G16為高產(chǎn)乳酸突變株。

2.3 體外益生特性研究

2.3.1 耐酸性試驗

耐酸能力的強弱是評價乳酸菌益生性能的重要指標之一，具有良好的耐酸能力才可以通過胃腸環(huán)境且發(fā)揮其益生作用，因此，乳酸菌在低pH值下生存是保持胃液環(huán)境下存活的條件之一[18-19]，原始菌株和突變株G10、G16的耐酸性見圖2。

圖2 原始菌株與突變株G10和G16的酸耐受性Fig.2 Acid tolerance of original and mutant strains G10 and G16

由圖2可知，在pH值6.0的條件下，3株菌株的存活率均＞90%；在pH值2.0和3.0的條件下，突變株G10、G16的存活率均顯著高于原始菌株（P＜0.05），且突變株G10的存活率顯著高于突變株G16（P＜0.05）。在pH值3.0時培養(yǎng)3 h后，突變株G10、G16的存活率分別為89.30%、82.32%；在pH值2.0時培養(yǎng)3 h后，突變株G10、G16的存活率分別為77.72%、72.55%。

2.3.2 人工模擬胃腸液的耐受性

耐受胃腸液能力是益生菌篩選的另一個重要指標[20]，原始菌株和突變菌株G10、G16的人工模擬胃腸液耐受性見圖3。

圖3 原始菌株與突變株G10和G16的人工模擬胃腸液耐受性Fig.3 Artificial simulated gastrointestinal fluid tolerance of original and mutant strains G10 and G16

由圖3可知，人工模擬胃液處理3 h后，3株菌株的存活率均＞80%，且突變株G10、G16的存活率（89.44%和92.02%）均顯著高于原始菌株（83.14%）（P＜0.05），這與SON S H等[21]研究泡菜中鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamonsus）KCTC 12202BP和布氏乳桿菌（Lactobacillus brevis）G1在同等胃液條件下的存活率（81.28%和87.09%）相似。3株菌株再經(jīng)人工模擬腸液處理4 h后，活菌數(shù)呈下降的趨勢，原因可能是菌株所形成的初始被膜可能會被胃腸液所含有的胃、胰蛋白酶抑制，同時破壞成熟的被膜，導致抑制菌株生長甚至死亡的情況[22]。原始菌株在經(jīng)人工模擬腸液處理后存活率僅為64.98%，而突變株G10、G16的存活率均維持在70%以上，分別為71.40%、78.16%，顯著高于原始菌株（P＜0.05），表明突變株能夠以較高的活性在腸液環(huán)境下存活，這與何宇星等[23]的研究結(jié)果相似。總體而言，經(jīng)過脈沖強光誘變的突變株G10和G16具有較強的胃腸液耐受性，在發(fā)酵食品中具備一定的應(yīng)用潛力。

2.3.3 耐膽鹽性試驗

益生菌菌株需要在十二指腸膽鹽中存活，以在腸道發(fā)揮其有益作用，促進腸道菌群微生態(tài)平衡，被認為是益生菌微生物最重要的特性之一[24-25]。原始菌株和突變菌株G10、G16的膽鹽耐受性見圖4。

圖4 原始菌株與突變株G10和G16的膽鹽耐受性Fig.4 Bile salt tolerance of original and mutant strains G10 and G16

由圖4可知，在0.3%、0.5%的膽鹽條件下，3株菌株的存活率均＞80%，其中突變株G10的存活率最高，分別為92.98%和87.17%，其次為突變株G16，分別為91.85%和84.61%，均高于原始菌株（90.54%和84.00%）。在1.0%的膽鹽條件下，突變株G10的存活率（75.32%）顯著高于原始菌株（62.94%）（P＜0.05），說明其具有良好的膽鹽耐受性。

2.3.4 自凝集能力

細菌的自凝集能力是決定細菌對宿主組織粘附程度的一個重要指標[26]，原始菌株和突變株G10、G16的自凝集能力見圖5。

圖5 原始菌株與突變株G10和G16的自凝集性Fig.5 Autoagglutination of original and mutant strains G10 and G16

由圖5可知，3株菌株于37℃培養(yǎng)3h后，自凝集率在16%～20%；培養(yǎng)6 h后，自凝集率在30%～35%；培養(yǎng)24 h后，自凝集率在70%～80%。其中，突變株G10在培養(yǎng)24 h時具有最高的自凝集率（76.49%），其次為突變株G16（74.80%），均顯著高于原始菌株（70.24%）（P＜0.05）。有研究表明，分離出的乳酸菌孵育4 h時的自凝集率在18%～25%，且隨著孵育時間愈長，自凝集率越高[27]，這與本研究結(jié)果一致。

2.3.5 表面疏水性

細胞表面的高疏水性有助于細菌在腸黏膜表面定植，促進細菌與腸上皮細胞的粘附[28]。采用二甲苯（非極性溶劑）、氯仿（單極性，酸性有機溶劑，電子受體）和乙酸乙酯（單極性，堿性有機溶劑，電子供體）檢測原始菌株和突變株G10和G16的表面疏水性，結(jié)果見圖6。

圖6 菌株的表面疏水性Fig.6 Surface hydrophobicity of strains

由圖6可知，不同菌株的表面疏水性有顯著差異（P＜0.05），且突變株G10和G16的疏水性顯著高于原始菌株（P＜0.05）。原始菌株和突變株G10、G16對二甲苯（70.30%、83.33%、75.26%）和氯仿（74.16%、78.00%、80.36%）的疏水性均高于對乙酸乙酯的疏水性（47.2%、53.16%、50.36%），表明突變株均具備疏水細胞表面，具有強電子供體。綜上，突變株G10具有良好的表面疏水性。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗確定植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC 6240的最優(yōu)脈沖強光誘變條件為脈沖電壓1 700 V，脈沖次數(shù)18次，脈沖距離9 cm。在此條件下對植物乳桿菌CICC 6240進行誘變處理，通過鈣透明圈法和乳酸含量測定，篩選得到兩株高產(chǎn)乳酸的突變菌株，分別為G10、G16，其乳酸產(chǎn)量分別為76.65 μg/mL和75.48 μg/mL，比原始菌株分別提高58.96%和56.53%。突變株G10及G16在pH2.0的條件下培養(yǎng)3 h后存活率分別為77.72%和72.55%；在人工模擬胃腸液中培養(yǎng)后，突變株G10、G16的存活率分別為71.40%、78.16%；在1.0%膽鹽條件下培養(yǎng)3 h后，突變株G10及G16的存活率分別為75.32%、62.96%；突變株G10、G16在培養(yǎng)24 h時自凝集率分別為76.49%、74.80%；突變株具有良好的表面疏水性，尤其是突變株G10，其對二甲苯的疏水率為83.33%，對氯仿的疏水率為78.00%，對乙酸乙酯的疏水率為53.16%，說明脈沖強光誘變處理的突變株具有較強的益生特性。綜上，突變株G10為高產(chǎn)乳酸的優(yōu)良菌株。