產果膠酶菌株的分離鑒定及其產酶條件優化

彭潔英，黃琳茹，方堅濠，李昆太*

（1.廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.廣東省海洋食品工程技術研發中心，廣東 湛江 524088）

果膠酶是指能夠分解高等植物細胞壁的重要組成部分，果膠類物質中半乳糖醛酸長鏈殘基的糖苷鍵的一類酶的總稱，主要包括原果膠酶、果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類，屬于復合酶，廣泛分布于高等植物和微生物中，是全球四大工業酶制劑之一[1]。研究表明，優良的果膠酶產生菌主要為細菌和真菌[2]。AHLAWAT S等[3]使用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生產果膠酶，其所產酶展現出廣泛的pH適應性和熱穩定性，為高溫和極端pH下的果膠處理工藝提供了酶學基礎。KHATRI B P等[4]分離出一株能夠產生堿性果膠酶的黑曲霉（Aspergillus oryzae）菌株，能應用于植物纖維脫膠、廢水處理等過程。池彬彬等[5]從鹽井土壤樣品中分離得到一株產果膠酶的中度嗜鹽菌，解決了果膠酶在高濃度鹽溶液下酶活性較低的缺陷。除對產果膠酶菌進行分離鑒定以外，眾多學者對產果膠酶菌的最佳發酵條件進行了研究[6-8]，KASHYAP D R等[7]從農場的土壤中分離出產果膠酶菌株，通過響應面法優化了其發酵產酶條件，即在含有果膠10 g/L和K2HPO40.8 g/L的培養基中，28 ℃下發酵3 d后的最高酶活力為14.16 U/mL，約是優化前的12倍。

果膠酶是重要的商用酶之一，在食品工業和紡織行業占有重要地位。以食品工業為例，微生物果膠酶占全球食品酶銷售總額的25%，年銷售達到100多萬t[9-11]。其在果蔬汁的澄清[12]、果蔬出汁率的提高[13]、改善果酒品質[14]、提取天然產物[15]、提取油脂[16]、生產果膠低聚糖[17]以及咖啡和茶葉加工[18]等方面都有應用。由于果膠酶在食品工業中應用廣泛，使得人們對于果膠酶的來源研究也越來越深入。果膠酶可以從微生物或植物中分離獲得，植物中的果膠酶產量較低、提取成本高且提純方法繁瑣，不利于進行大規模生產。所以目前果膠酶的生產主要依靠微生物代謝產生，其中黑曲霉（Aspergillus niger）是工業生產上較為常見的產果膠酶菌株，但其果膠酶的產量與酶活性仍然不能滿足市場發展的需求[19]。因此，亟需選育新的高產果膠酶菌株，更好地滿足市場發展與工業生產的需求。此外，對篩選的果膠酶產生菌進行發酵工藝優化也是提高其產酶經濟效益的一個重要方式[20]，響應面法可以在幾次試驗中確定幾個變量之間的相互作用，并在盡可能短的時間內獲得最佳結果[21-22]。

菠蘿富含果膠且易分泌果膠膠液，本研究擬從菠蘿種植地靶向分離篩選產果膠酶的微生物菌種，并通過單因素試驗和響應面法對其產酶發酵培養基和產酶條件進行優化，以提高菌株產果膠酶的能力，為該菌的工業化應用提供源頭資源和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土樣來源

土樣采自廣東省湛江市徐聞縣曲界鎮菠蘿種植地。

1.1.2 試劑

果膠、D+（-）半乳糖醛酸：上海麥克林生化科技有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵、剛果紅、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、檸檬酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、磷酸氫二鈉、氯化鋅、氯化銅、氯化錳、六水合氯化鈷：上海麥克林生化科技有限公司；革蘭氏染液、微生物檢測配套試劑、氯化銨、技術瓊脂粉、酵母浸膏：廣東環凱微生物科技有限公司。以上試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

分離培養基：果膠3.0 g/L，NH4C1 0.4 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，K2HPO41 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

LB固體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.4，瓊脂粉15 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。LB液體培養基中不添加瓊脂。

復篩培養基：果膠20 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，K2HPO41 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，121 ℃滅菌30 min。

初始發酵培養基：果膠30 g/L，蛋白胨20 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

HZQ-F160振蕩培養箱：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；DM500生物顯微鏡：上海Leica顯微系統有限公司；UV-5800PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；BPMJ-150F生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋：寧波久興醫療器械有限公司；3K-15 SIGMR臺式高速冷凍離心機：揚州離心機有限公司；SSW-420-2S電熱恒溫水槽：上海博遠實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 產果膠酶微生物的分離

稱取土壤樣品10 g加入到盛有90 mL無菌水且帶有玻璃珠的200 mL錐形瓶中，將土樣充分打散、混勻，即成10-1泥漿稀釋液，然后再按10倍稀釋法依次稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5等梯度。吸取10-3、10-4、10-5梯度稀釋液各200 μL分別涂布至分離培養基平板上，放入30℃培養箱中培養約2～3d。分離出能在以果膠為唯一碳源的固體培養基上生長的微生物。

1.3.2 產果膠酶菌株的初篩

將步驟1.3.1分離得到的菌株接種到分離培養基上，待菌落明顯長出后，將平板倒浸于剛果紅溶液（5 mg/mL水溶液）中靜置15 min。取出平板倒去剛果紅溶液，用氯化鈉溶液（1 mol/L）重新覆蓋平板表面，靜置15 min，觀測菌落旁有無明顯水解圈的出現。挑取平板上水解圈較大的菌落平板劃線于LB固體培養基上，反復純化直至得到純培養物后轉接至LB斜面培養24 h，置于4 ℃冰箱短時間保存備用。

1.3.3 產果膠酶菌株的復篩

將初篩菌株的新鮮斜面以10 mL無菌水洗下菌體，打散均勻后取1 mL菌懸液接種于裝有50 mL LB液體培養基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養箱中160 r/min、30 ℃振蕩培養16 h，獲得種子液。將種子液以5%（V/V）的接種量接種于裝液量為40 mL/250 mL三角瓶的初始發酵培養基中，30 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養24 h。所得發酵液裝入50 mL離心管中，于4 ℃、3 000 r/min離心5 min，收集上清液并使用DNS法測定果膠酶的酶活力，復篩出所產果膠酶酶活力高的菌株。

1.3.4 果膠酶酶活力的測定

果膠酶酶活力的測定方法參照谷藝明[23]的方法并稍加改進。吸取0.8 mL果膠溶液加入50 mL的比色管中，50 ℃水浴加熱5 min，加入0.2 mL的稀釋粗酶液，50 ℃水浴30 min，加入3 mL的DNS試劑，沸水浴10 min，流水冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，混合均勻，10 000 r/min離心10 min，以滅活的粗酶液為對照，用分光光度計在波長540 nm處測溶液的OD540nm值。根據半乳糖醛酸標準曲線測定果膠酶酶活力。酶活力定義：在50 ℃的條件下，每1 min水解果膠產生1 μg半乳糖醛酸為一個酶活力單位，計算公式如下[23]：

式中：UI表示果膠酶酶活力，U/mL；N表示粗酶液稀釋倍數；A1表示粗酶液在波長540 nm處的吸光度值（OD540nm值）；1 000表示mg與μg的換算系數；A2表示滅活的粗酶液在波長540 nm處的吸光度值（OD540nm值）；0.2表示粗酶液添加量，mL；K表示半乳糖醛酸標準曲線斜率；t表示反應時間，min。

1.3.5 產果膠酶菌株的鑒定（1）形態觀察

將分離篩選得到的菌株劃線于LB平板，30 ℃培養24 h，觀察并記錄單菌落的顏色、形狀、透明度、大小、表面隆起和菌落培養基的顏色等。利用掃描電子顯微鏡[24]，對所篩菌株的微觀形態和大小進行分析觀察。

（2）生理生化鑒定

菌株的生理生化試驗參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第8版）和《常見細菌系統鑒定手冊》中菌種鑒定方法對菌株的部分生理生化進行鑒定[25-26]。

（3）分子生物學鑒定

參考楊逸飛等[27]的方法，將純化后的菌種送至上海生工生物工程有限有限公司進行測序，采用細菌通用引物7F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）和1540R（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增16S rRNA。PCR擴增體系（25 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL（含Mg2+），脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）各2.5 mmol/L，TaqPlus脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，引物7F（10 μmol/L）和1540R（10 μmol/L）各0.5 μL，模板（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃再延伸10 min。對擴增的產物進行測序。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center or biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，在比對結果中下載同源性較高的序列，采用鄰位相連法將目的菌種的16S rDNA與下載的序列一起構建進化樹，利用Bootstrap自舉法檢測序列1 000次后建立系統進化樹。

1.3.6 產果膠酶發酵條件優化單因素試驗

設置初始發酵條件：蔗糖30 g/L，蛋白胨20 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 7.0，發酵溫度30 ℃；裝液量40 mL/250 mL，接種量5%（V/V），發酵時間24 h。

考察碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果膠、可溶性淀粉、玉米漿干粉）、最佳碳源添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L）、有機氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、黃豆餅粉）、最佳氮源添加量（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）、微量元素（Zn2+、Cu2+、Mn2+、Co2+）、發酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、37 ℃）以及pH（3、5、7、9、11、13）對菌株產果膠酶的影響。

1.3.7 響應面法優化

根據上述單因素試驗的結果，利用Design-Expert V12.0.3.0軟件設計3因素3水平的響應面試驗，探究篩選菌株產果膠酶的最優產酶條件，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 產酶條件優化響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for enzyme production conditions optimization

1.3.8 數據分析

使用Excel 2016進行數據統計，使用Origin 2022對數據進行作圖分析，使用Design-Expert V12.0.3.0軟件設計響應面試驗。

2 結果與分析

2.1 產果膠酶微生物的初篩

果膠經果膠酶分解后，其多糖水解物可與剛果紅染料形成有紅色透明圈的復合物，由此可判別菌株是否具有產果膠酶的能力[28]。經過以果膠為唯一碳源的分離培養基的篩選分離，從采集的土樣中一共初篩到9株能夠產生水解圈的菌株，并分別命名為XW-1、XW-7、XW-12、XW-14、XW-15、XW-18、XW-19、XW-20、XW-23。代表菌株XW-18的水解圈見圖1。

圖1 菌株XW-18降解果膠所產的水解圈Fig.1 Hydrolysis circle of strain XW-18 by degrading pectin

2.2 產果膠酶微生物的復篩

初篩獲得的9株微生物經發酵后，利用DNS法測定其所產的果膠酶酶活，結果見圖2。由圖2可知，果膠酶活力＞200 U/mL的菌株有XW-1、XW-7、XW-14、XW-15、XW-18、XW-20。其中菌株XW-18所產果膠酶酶活最高，達到（306.22±0.59）U/mL，因此將菌株XW-18作為進一步研究對象。

圖2 篩選菌株的酶活力測定結果Fig.2 Determination results of enzyme activity of re-screening strains

2.3 菌株XW-18的鑒定

2.3.1 形態觀察結果

將菌株XW-18點接于LB固體培養基上，觀察其菌落形態特征，結果見圖3。由圖3可知，該菌單菌落為橢圓狀突起，呈現明顯的細菌菌落特征。菌落生長初期為乳白色，表面濕潤，有黏性，培養時間稍長后，菌落表面變干燥，有褶皺。掃描電子顯微鏡觀察結果顯示，菌株呈短桿狀，周生鞭毛。

圖3 菌株XW-18的菌落形態（a）及細胞形態（b）Fig.3 Colony morphology(a)and cell morphology(b)of strain XW-18

2.3.2 生理生化試驗結果

菌株的生理生化試驗結果見表2。由表2可知，菌株XW-18的葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖、木糖、麥芽糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇發酵結果以及吲哚、2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（2-nitrophenyl-β-D-galactoside，ONPG）、M.R.、H2S、脂肪酶、淀粉酶、明膠液化試驗結果均為陽性；V.P.、幾丁質酶、脲酶試驗結果均為陰性。通過對菌株的形態觀察、生理生化檢測結果和檢索《伯杰式細菌鑒定手冊》，菌株XW-18與芽孢桿菌生理生化特征較吻合。因此，初步判定菌株XW-18屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

表2 菌株XW-18的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain XW-18

2.3.3 分子生物學鑒定

菌株XW-18的16S rDNA基因序列總長為1 481 bp（GenBank登錄號：OP430540），通過在NCBI的GenBank數據庫中進行BLAST序列比對分析，結果表明，該菌株與枯草芽孢桿菌親源性最近，同源性達到99%。利用MEGA7.0.26軟件構建菌株XW-18的系統發育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株XW-18與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilissubsp.subtilis）168的遺傳距離最近，結合該菌株的形態特征，將菌株XW-18鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4 基于16S rRNA基因序列菌株XW-18的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain XW-18 based on 16S rRNA gene sequence

2.4 枯草芽孢桿菌XW-18產果膠酶條件優化

2.4.1 碳源及其添加量對菌株的影響

碳源在微生物的培養過程中起著非常重要的作用，為微生物正常生長發育提供了物質基礎。不同的碳源對菌株的生長和產酶能力都會產生影響。在發酵培養基中分別加入30 g/L不同的碳源，探究碳源對枯草芽孢桿菌XW-18菌體生長和產果膠酶的影響，結果見圖5。由圖5可知，當選擇蔗糖為碳源時，所產酶果膠酶活力最高，達到（970.78±7.37）U/mL。而以玉米漿干粉作為碳源時，果膠酶活力最低。此外，以可溶性淀粉作為碳源時，菌體量最高，說明以可溶性淀粉作為碳源有利于菌株的生長，但是會抑制菌株的產酶能力，降低菌株的產酶活性。而以蔗糖為碳源時，不僅能促進菌株生長，還能提高菌株的產酶活性，因此選擇蔗糖作為枯草芽孢桿菌XW-18發酵產酶的碳源。

圖5 不同碳源對菌株XW-18生長量和產果膠酶活性的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on growth and pectinaseproducing activity of strain XW-18

不同蔗糖添加量對菌株生長和產酶活性的影響見圖6。由圖6可知，隨著蔗糖添加量的增加，菌株所產果膠酶的活性逐漸升高，在蔗糖添加量為40 g/L時果膠酶酶活達到最高值，為（1 702.43±13.14）U/mL。因此最適蔗糖添加量為40 g/L。

圖6 蔗糖添加量對菌株XW-18生長量和產果膠酶活性的影響Fig.6 Effect of sucrose addition on growth and pectinase-producing activity of strain XW-18

2.4.2 氮源及其添加量對菌株的影響

氮源作為營養物質廣泛參與到微生物的生長代謝、次生代謝產物合成中，其種類與用量會對微生物發酵過程產生重要影響[29]。在最優碳源以及其添加量的基礎下，探究氮源種類及最佳氮源添加量對枯草芽孢桿菌XW-18菌體生長量和產果膠酶能力的影響，結果見圖7和圖8。

圖7 不同氮源對菌株XW-18生長量和產果膠酶活性的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on growth and pectinase-producing activity of strain XW-18

圖8 蛋白胨添加量對菌株XW-18生長量和產果膠酶活性的影響Fig.8 Effect of peptone addition on growth and pectinase-producing activity of strain XW-18

由圖7可知，當發酵氮源為蛋白胨時，菌體生長量（OD600nm值=4.69±0.09）及所產的果膠酶酶活[（1 406.77±2.36）U/mL]均為最高，因此選擇蛋白胨作為枯草芽孢桿菌XW-18發酵產果膠酶的氮源。由圖8可知，隨著蛋白胨添加量的增加，菌株的菌體量和果膠酶酶活也隨著提高。當蛋白胨添加量為20 g/L時，枯草芽孢桿菌XW-18的菌體量（OD600nm值=6.81±0.04）和產酶活性[（1 563.35±4.96）U/mL]達到最高。隨后增加蛋白胨的含量，酶活跟生長量均下降，這可能是蛋白胨含量過高，使得發酵培養基中C/N比例不適于菌株生長及產酶，導致菌體含量和酶活都降低。因此最佳蛋白胨添加量為20 g/L。

2.4.3 微量金屬元素對菌株的影響

在最佳碳源、氮源以及其添加量的基礎上，考察了1 mmol/L Zn2+、Cu2+、Mn2+、Co2+微量金屬元素的加入對枯草芽孢桿菌XW-18菌體生長量和產果膠酶能力的影響，結果見圖9。由圖9可知，Mn2+能夠有效促進菌體生長，但會抑制菌株的產酶活性，而Zn2+和Co2+會抑制菌株的生長，但Co2+能夠稍微促進菌株產果膠酶。此外，Cu2+對菌體生長和菌株產酶活性均產生嚴重的抑制作用。尤其是Zn2+和Co2+添加下的菌體量受到明顯抑制，但是果膠酶酶活卻未出現明顯下降。因此，選擇不添加微量金屬元素進行發酵培養。

圖9 不同微量金屬元素對菌株XW-18生長量和產果膠酶活性的影響Fig.9 Effect of different trace metal elements on growth and pectinase-producing activity of strain XW-18

2.4.4 發酵溫度對菌株的影響

不同發酵溫度對菌株XW-18菌體生物量及產果膠酶活性的影響見圖10。由圖10可知，隨著溫度的升高，菌株的生物量及產果膠酶活力均呈現先升高后降低的趨勢，當培養溫度為30 ℃時，枯草芽孢桿菌XW-18的菌體量（OD600nm值=5.59±0.03）和產酶最高，果膠酶酶活力達到（1 332.06±3.64）U/mL。當培養溫度高于30 ℃后，菌株的產酶活力開始下降。培養溫度是影響微生物代謝的關鍵因素之一，有研究表明果膠酶產生菌發酵溫度過高或過低都不利于菌株生長，進而影響果膠酶的產生和釋放[13]。因此，選擇30 ℃作為枯草芽孢桿菌XW-18發酵產果膠酶的最適溫度。

圖10 不同發酵溫度對菌株XW-18生長量和產果膠酶活性的影響Fig.10 Effect of different fermentation temperature on growth and pectinase-producing activity of strain XW-18

2.4.5 初始pH值對菌株的影響

探究了培養基初始pH值對枯草芽孢桿菌XW-18菌體生長和產果膠酶能力的影響，結果見圖11。由圖11可知，隨著初始pH值的不斷升高，菌株的產酶活力先升高后下降，當pH值為7時，菌株產酶能力最高，酶活力達到（1 556.19±2.75）U/mL，說明菌株產果膠酶的最佳初始pH值為7。此外，該菌株在初始pH 5～11之間生長良好，其中，當初始pH為9時，菌體生物量最大，OD600nm值為5.51±0.01，但在初始pH為9時的果膠酶酶活[（1 030.84±4.96）U/mL]要遠低于初始pH為7時的果膠酶酶活[（1 556.19±2.75）U/mL]。而兩者的菌體生物量相差不大（pH 7時的OD600nm值為5.41±0.01）。因此，菌株生長發酵產酶的最佳初始pH為7。值得注意的是，除了在最適初始pH下，枯草芽孢桿菌XW-18在初始pH值范圍為3.0～13.0之間均具有產酶活力，說明該菌株的生長和產果膠酶均展現出了廣泛的pH適應性。

圖11 不同初始pH對菌株XW-18生長量和產果膠酶活性的影響Fig.11 Effect of different initial pH on growth and pectinaseproducing activity of strain XW-18

2.5 響應面試驗設計及結果

根據上述單因素試驗的結果，以蔗糖添加量（A）、蛋白胨添加量（B）、發酵溫度（C）、初始pH值（D）為評價因素，果膠酶酶活力（Y）作為考察指標，用Design-Expert V12.0.3.0軟件設計4因素3水平的響應面試驗，響應面試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 菌株XW-18產酶條件優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments for enzyme production conditions optimization of strain XW-18

續表

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert V12.0.3.0軟件對試驗數據進行分析，得到以酶活性為響應值的回歸方程為：Y=1 804.32+128.29A+18.84B-21.53C-113.19D+6.76AB+13.91AC+111.47AD-47.09BC-58.02BD-7.55CD-253.72A2-187.75B2-79.66C2-134.10D2。

由表4可知，回歸方程的決定系數R2=0.855 5，表明其擬合度較好；而變異系數（coefficient of variation，CV）=7.20%表明試驗的重復性較高；模型的P值=0.001 0＜0.05，說明對結果影響極顯著；而失擬項的P值=0.063＞0.05，說明失擬項不顯著。發酵條件的4個因素對酶活性的影響大小為A＞D＞C＞B，其中因素A和D對結果影響極顯著（P＜0.01），說明蔗糖添加量及培養基初始pH會對枯草芽孢桿菌XW-18產果膠酶產生極顯著的影響，此外，二次項A2、B2、D2對結果影響也極顯著（P＜0.01），其余因素影響不顯著（P＞0.05）。利用Design-Expert V12.0.3.0軟件對蔗糖添加量、蛋白胨添加量、發酵溫度以及初始pH這4個因素之間的交互作用進行了響應面圖繪制，結果見圖12。

圖12 各因素間交互作用對果膠酶活性影響的響應面和等高線Fig.12 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on pectinase activities

由圖12可知，蛋白胨添加量與蔗糖添加量之間所形成的交互作用最弱，而初始pH與蔗糖添加量所形成的交互作用最強。結合方差分析可知各因素交互作用大小為AD＞BD＞BC＞AC＞CD＞AB。綜合響應面結果，得出枯草芽孢桿菌XW-18產果膠酶的最優發酵條件為：蔗糖添加量41.69 g/L，蛋白胨添加量20.64 g/L，發酵溫度29.72 ℃，初始pH 6.25，此方程預測的最大酶活可達1 839.07 U/mL。為了操作方便，修正發酵參數為：蔗糖添加量40 g/L，蛋白胨添加量20 g/L，發酵溫度30 ℃，初始pH 7.0。在此優化條件下進行3次重復性試驗，其果膠酶酶活力為（1 804.32±55.28）U/mL，結果與預測值基本符合，表示該模型與實際情況基本吻合，擬合良好。

3 結論

本研究從廣東省湛江市徐聞縣曲界鎮菠蘿種植地里的土壤中分離到一株產果膠酶的菌株XW-18，經鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），同時對其發酵產酶工藝進行了優化，得到該菌最佳產果膠酶發酵條件為：蔗糖添加量40 g/L，蛋白胨添加量20 g/L，發酵溫度30 ℃，培養基初始pH 7.0，在此條件下，果膠酶酶活力提高到（1 804.32±55.28）U/mL。可見，本研究不僅豐富了產果膠酶的微生物種質資源，而且通過發酵工藝優化使其產酶得到大幅提高，為后續的工業應用提供了基礎。