天然曬露法醬油減鹽工藝條件優化

施 思，徐雪姣，施 林

（1.浙江藥科職業大學 食品學院，浙江 寧波 315000；2.浙江樹人學院 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310015；3.寧波統一食品有限公司，浙江 寧波 315000）

醬油起源于中國，以大豆、麩皮等為原料釀造而成，是人民餐桌上不可或缺的重要調味品之一[1]。我國醬油生產工藝常采用高鹽稀態法和天然曬露法。近年來，高鹽稀態法被廣泛使用，經濟高效，品質穩定，但其發酵周期較長[1]。寧波傳統天然曬露法醬油發酵工藝已具有上千年的歷史，它采用大豆和小麥粉為原料，混合制曲后下缸，利用自然氣溫變化規律進行露天發酵[2]。因長時間日曬夜露，定期打耙，水分蒸發較多，最終形成濃醪。采用該法釀成的醬油，具有醬香濃厚、滋味醇和、鮮美、體態濃稠的優點，在華東地區久負盛名。隨著消費觀念的提升，消費觀念趨向于“減鹽、健康、傳統、定制化”方向。如何在遵循傳統工藝的基礎上進行釀造技術的升級，開發出“高風味、減鹽、健康”的醬油產品，是我國傳統釀造企業亟需解決的現實問題。目前，針對減鹽醬油的工藝研究大多基于高鹽稀態法，很少有通過乙醇代替部分氯化鈉法來降低天然曬露法醬油鹽含量的研究，且對該傳統發酵工藝醬油的風味和安全性缺少綜合全面的研究。

目前，關于減鹽醬油的生產尚未出臺統一的國家標準。醬油企業通常采用膜分離法或食鹽替代法進行減鹽處理[3]。減鹽醬油的膜分離技術主要有電滲析、納濾膜、離子交換等，可以有效降低醬油中的鹽含量，但是風味物質損失量較大[4]，且該設備較為昂貴，并不適用于我國的中小型釀造企業。常見的食鹽替代物主要包括氯化鉀和乙醇等[3]。相較于氯化鉀，使用乙醇作為替代物可以有效控制雜菌污染，醬油苦澀感不突出，并且具有明顯的價格優勢[5]。除此之外，乙醇作為醬油的重要風味物質，還可以與酸類物質反應生成酯類[2]。宋小焱等[6]在乙醇代鹽生產低鹽醬油的研究中發現，與氯化鈉相比，乙醇對于蛋白酶活性的抑制作用較弱，濃度過高的乙醇有可能抑制酵母菌的生長，從而對醬油發酵生產產生不利影響。

因此，本研究在傳統天然曬露法制備醬油的工藝基礎上制備醬油，并采用乙醇代鹽法對醬油進行降鹽處理，分別考察不同乙醇和食鹽比例對醬油發酵過程中氨基酸態氮、總酸含量、pH值的影響，并對醬油樣品的NaCl含量及感官品質進行分析，明確減鹽醬油的最佳配方設計，旨在為實現天然曬露法醬油的減鹽生產提供一定的理論基礎，進一步振興傳統釀造工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）（滬釀3.042）：上海迪發有限公司；大豆、小麥粉、食鹽：市售；氫氧化鈉、甲醛（37%）、鉻酸鉀、酚酞（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；硝酸銀（分析純）：河南邦潤化工產品有限公司；乙醇（體積分數為95%）（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

QL-Y01振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；PHS-3C酸度計：安萊立思儀器科技（上海）有限公司；8HW-1型恒溫磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；320XB電子分析天平：上海精科實業有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生醬油的加工工藝流程及操作要點

大豆、小麥粉→混合→潤水→蒸煮→冷卻→接種、發酵→加入氯化鈉溶液→制醪→露天發酵→浸泡醬醅→壓榨→生醬油操作要點：

將大豆和小麥粉以7∶3的質量比混合，每1 250 kg混合干料加入700 kg清水進行潤水，浸泡7 h。采用旋轉蒸罐蒸料，蒸料壓力為0.15～0.20 MPa（蒸汽壓），保壓時間為5～15 min。熟料冷卻到45 ℃以下，接入米曲霉0.3%，混合均勻，在35～37 ℃條件下發酵46 h，將上述發酵后的原料直接倒入露天發酵大缸中，加入18%的NaCl溶液。常溫日曬夜露發酵60 d，每5 d打耙一次。發酵結束后，用適量90 ℃熱水浸泡醬醅2 h，壓榨醬醅出油，即得到生醬油成品。

1.3.2 試驗設計

在生醬油的加工工藝流程基礎上，配制相應濃度的溶液替代NaCl溶液，將發酵后原料和溶液以5∶8的質量比混合，按照試驗設計的乙醇和氯化鈉添加量進行試驗，具體見表1。乙醇與氯化鈉的添加總量分別保持為17%（1#、4#、7#、10#、13#）、18%（2#、5#、8#、11#、14#）、19%（3#、6#、9#、12#、15#）。同時設置高鹽發酵組（0#）作為對照。每5 d打耙后，進行抽樣。

表1 乙醇和氯化鈉添加量的設計Table 1 Design of ethanol and sodium chloride additions

1.3.3 分析檢測

氯化鈉和氨基酸態氮的測定：參照GB/T 18186—2000《釀造醬油》中的甲醛滴定法和硝酸銀滴定法；總酸的測定：參照GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》中的酸堿指示劑滴定法；pH值的測定：采用酸度計。

1.3.4 醬油的感官評價

采用定量描述分析（quantative descriptive analysis，QDA）法評價不同發酵組醬油的感官特性[7-8]。所有感官分析均在特定的感官品評室進行，以所有小組成員打分的平均值作為最終結果。感官小組共9名成員（4男5女，年齡23～30歲），每人都有60 h的QDA醬油評估經驗。首先，評估成員確定了減鹽醬油的6個感官描述屬性（鮮味、咸味、甜味、醬香、酯香、綜合復雜性）。評估成員被要求在0～5分的范圍內記錄每種屬性的強度（0：不存在，1：剛好可以識別，2：弱，3：中，4：強，5：很強）。

1.3.5 數據處理采用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析，以P＜0.05為差異顯著；使用Origin 9.0進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 醬油發酵過程中氨基酸態氮含量的變化

鮮味是醬油最重要的風味之一，氨基酸態氮含量與醬油的鮮味表現緊密相關，也是醬油國標GB 18186—2000《釀造醬油》評定醬油等級的重要參數。當發酵時間為5～60 d時，15組樣品的氨基酸態氮含量呈現整體上升趨勢；當發酵時間為5～10 d時，氨基酸態氮含量明顯增長（P＜0.05）；發酵時間＞10 d時，氨基酸態氮含量變化趨于平緩。其原因可能是，發酵前期，醬醪中微生物生長迅速，中性蛋白酶和酸性蛋白酶的活力較高，原料中的蛋白質發生水解生成各類呈味氨基酸[9]。隨著發酵的進行，醬醪的pH不斷下降，蛋白酶活力受到一定抑制，且發酵中后期，部分氨基酸轉化成其他風味物質，從而使醬醪中的氨基酸態氮含量升幅變緩[2]。當發酵時間為60 d時，1#、2#和3#的氨基酸態氮含量分別為（0.93±0.01）g/100 mL、（0.82±0.04）g/100 mL和（0.86±0.02）g/100 mL；4#、5#和6#的氨基酸態氮含量分別為（0.91±0.07）g/100 mL、（0.88±0.04）g/100 mL和（0.81±0.04）g/100 mL；7#、8#和9#的氨基酸態氮含量分別為（0.89±0.04）g/100 mL、（0.86±0.03）g/100 mL和（0.85±0.03）g/100 mL；10#、11#和12#的氨基酸態氮含量分別為（0.91±0.04）g/100 mL、（0.84±0.05）g/100 mL和（0.84±0.04）g/100 mL。當氯化鈉含量為7%～9%時，氨基酸態氮含量隨著乙醇含量的增加而降低。當乙醇含量為10%和11%時，氯化鈉含量越高，醬油的氨基酸含量越低。乙醇對氨基酸態氮含量的影響主要是通過對蛋白酶的影響來實現，尤其是對堿性蛋白酶的影響最明顯[10]。15組樣品的氨基酸態氮含量均達0.8 g/100 mL，均符合國標GB/T 18186—2000《釀造醬油》中特級醬油的標準，0#的氨基酸態氮含量為（1.16±0.01）g/100 mL。其中，13#的氨基酸態氮含量最高，達到了（0.97±0.03）g/100 mL，與其他組組間具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，13#能明顯增加發酵醬油中的氨基酸態氮含量。

圖1 不同醬油樣品在發酵過程中氨基酸態氮含量的變化Fig.1 Changes of amino acidic nitrogen contents in different soy sauce samples during fermentation

2.2 醬油發酵過程中總酸含量的變化

在醬油發酵過程中，總酸含量的高低與醬油的品質密切相關。有機酸本身是醬油重要的風味物質，可以帶來清爽的酸味，同時提高醬油的香氣表現，但過量的有機酸會破壞醬油的風味，造成醬油咸味的失衡。醬醪中的總酸含量也可以體現微生物在發酵過程中的生長代謝情況，過高或過低都會對微生物生長代謝和各類生化反應造成不利影響，從而影響醬油品質[11-13]。當發酵時間為5～60 d時，15組樣品的總酸含量整體呈上升趨勢。發酵時間為5～10 d時，各樣品的總酸含量快速增加，說明原料中的蛋白質和脂肪被米曲霉酶系水解生成大量有機酸、脂肪酸和谷氨酸等酸性物質；乳酸菌等微生物在發酵前期大量繁殖產生有機酸，造成總酸含量快速增加[14-17]。發酵時間＞10 d，總酸含量增長緩慢，可能是由于醬醪中的乙醇與酸類物質發生酯化反應，造成有機酸生成含量下降[18-19]。發酵時間＞40 d后，可能是芽孢桿菌在發酵后期發揮作用，造成有機酸含量繼續快速上升[20]。當發酵時間為60 d時，對照樣品（0#）的總酸含量為（2.54±0.03）g/100 mL，1#、2#和3#的總酸含量分別為（2.04±0.04）g/100 mL、（1.79±0.05）g/100 mL和（1.79±0.01）g/100 mL；4#、5#和6#的總酸含量分別為（2.19±0.04）g/100 mL、（2.09±0.04）g/100 mL和（1.59±0.07）g/100 mL；7#、8#和9#的總酸含量分別為（1.84±0.02）g/100 mL、（1.84±0.05）g/100 mL和（1.59±0.06）g/100 mL。其中，13#的總酸含量為（2.34±0.03）g/100 mL，與0#最為接近，有利于兩者產生相似的風味物質。當氯化鈉含量≤8%（1#～9#）時，總酸含量隨著乙醇含量的增加而降低。過高的乙醇含量可能會抑制乳酸菌生長，造成總酸含量的降低[6，21]。15組樣品的總酸含量為1.59～2.34 g/100 mL。因此，13#醬油樣品總酸含量最佳。

圖2 不同醬油樣品在發酵過程中總酸含量的變化Fig.2 Changes of total acid contents in different soy sauce during fermentation

2.3 醬油發酵過程中pH值的變化

pH值是體現醬醪發酵狀態的重要指標，也與醬油品質有關[22]。當發酵時間為5～60 d時，pH值呈現整體下降趨勢；當發酵時間為5～10 d時，pH值基本不變；當發酵時間為10～35 d時，pH值緩慢下降；當發酵時間＞40 d后，pH值降低幅度變大。發酵過程中pH的變化，會對蛋白質利用率與雜菌污染控制造成不同影響。尤其是制醪后的pH快速下降，不僅會抑制堿性蛋白酶和中性蛋白酶的活性，使蛋白質水解率降低，直接影響醬油的鮮味，還會抑制耐鹽性乳酸菌的繁殖，引起不良后果[2，23]。當發酵時間為60 d時，0#樣品的pH值為4.85，15組樣品的pH值下降至4.81～5.53，其中13#的pH為4.81，與0#最為接近。該條件下可以抑制部分非耐酸微生物，有利于醬油的防腐，同時也促進了醬醪中酵母菌的繁殖和酒精發酵，有利于醬油風味物質的積累[2]。因此，13#樣品有利于產生風味物質。

圖3 不同醬油樣品在發酵過程中pH值的變化Fig.3 Changes of pH values in different soy sauce during fermentation

2.4 醬油氯化鈉含量檢測結果

不同醬油樣品氯化鈉含量檢測結果見表2。由表2可知，發酵時間為60 d時，15組醬油樣品中的鹽含量均可降低50%以上，其中1#、2#的氯化鈉含量較低，分別為（5.53±0.02）%、（5.53±0.03）%。結合氨基酸態氮、總酸等理化指標，13#的氯化鈉含量為（7.74±0.04）%，具有后續作為減鹽醬油進行開發的潛力。在相同氯化鈉添加量下，由于醬缸露天放置位置差異，水分散發速度不同等原因，造成發酵終點的氯化鈉含量略有不同。

表2 不同醬油樣品發酵完成時的氯化鈉含量檢測結果Table 2 Determination results of sodium chloride contents in different soy sauce samples at the end of fermentation

2.5 感官評價

感官評價可以直接反映消費者的喜好和接受程度。采用QDA法分析比較15組醬油樣品的風味，篩選出了6個描述減鹽醬油風味的詞匯，即鮮味、咸味、甜味、醬香、酯香和綜合復雜性，同時設置了高鹽發酵組作為對照組。不同醬油樣品感官評分見表3。由表3可知，1#～15#的鮮味評分為2.1～2.8分，0#的鮮味評分為1.9分，說明采用減鹽工藝條件可以保持甚至提高醬油的鮮味。1#～15#的咸味評分低于樣品0#，與氯化鈉含量的數據結果相符。與0#的甜味相比，其余15個生醬油樣品的甜味具有一定差異。從香氣方面看，16組醬油樣品并未顯示明顯差異，減鹽工藝條件并不能使香氣成分得到明顯提升，這可能是由于高鹽環境可以形成有效的菌種篩選機制，使與醬油風味形成密切相關的嗜鹽四鏈球菌（Tetragenococcus halophilus）、魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）及易變球擬酵母（Torulopsis versatilis）成為優勢菌種[24-26]。0#、10#、11#、12#、13#、14#和15#的綜合復雜性評分較高，為1.9分。結合理化指標，13#樣品最具有后續開發潛力。

表3 不同醬油樣品的感官評分Table 3 Sensory evaluation score of different soy sauce samples

3 結論

與傳統天然曬露法相比，減鹽新工藝能降低醬油的鹽含量50%以上。發酵60 d后，15組均未發現明顯腐敗現象，說明添加乙醇能有效抑制雜菌污染。發酵60 d后，13#醬油樣品（制備醬油的鹽水氯化鈉含量10%、乙醇含量7%）的氨基酸態氮含量最高，達到了（0.97±0.03）g/100 mL，總酸含量為（2.34±0.03）g/100 mL，pH為4.81，NaCl含量為（7.74±0.04）%。QDA感官評價結果表明，該樣品的鮮味評分為2.8分，咸味評分為2.6分，甜味評分為1.4分，醬香評分為2.9分，酯香評分為0.9分，綜合復雜性評分為1.9分，減鹽新工藝有效提高了醬油的鮮味和整體風味，可作為后續進行中試生產的工藝條件，為減鹽天然曬露法醬油的開發提供一定的參考依據。