離子色譜法測定白酒中10種陰離子

王 鑫，王小平*，劉忠瑩，張定秋，朱敏敏，何葉馨，劉云龍，鄭紅毅

（1.四川省食品檢驗研究院，四川 成都 610097；2.國家市場監管重點實驗室（白酒監管技術），四川 成都 610097）

白酒是我國獨具特色的酒，承載著我國的悠久歷史和文化[1-3]。近幾年，白酒行業負面新聞不斷，從“勾兌”、“塑化劑”、“年份酒”、“敵敵畏”等事件[4-8]，讓白酒蒙上了陰影，為讓消費者對中國白酒重樹信心，監管部門加大了對白酒的監管，特別是白酒的風險管控[9-10]。陰離子廣泛存在于自然界中，其關乎白酒的品質和安全，主要通過原料選取、加工助劑以及人為添加等步驟引入。一些陰離子會直接影響白酒口感，如氯離子（Cl-）、硝酸根離子（NO3-）、硫酸根離子（SO42-）使酒變得醇和，刺激感減弱，磷酸根離子（PO43-）使酒有苦澀感[11]。另一些陰離子會直接影響白酒的食用安全，如溴酸根離子（BrO3-）為2B類致癌物，會增加人類患癌癥的幾率[12-13]；氯酸根離子（ClO4-）會導致甲狀腺功能退化，影響人體發育，尤其對胚胎、孕婦、哺乳期婦女和少年兒童影響更為顯著，成年人持續攝入高氯酸鹽，機體會發生骨髓造血細胞再生障礙[14-16]；硫氰根離子（SCN-）在體內被轉化為氰根離子，其在體內很快與細胞色素氧化酶中的三價鐵離子結合，抑制酶的活性，使組織不能利用氧，引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等腸道功能紊亂，血壓波動，心率減慢等癥狀[17-19]。這些有毒有害的陰離子會在工業中應用或產生，如果一旦進入環境，會隨地下水和地表水快速擴散，造成污染的擴大化，即有可能造成白酒被污染[20-21]，因此有必要對白酒中的危害陰離子建立一個可行檢測方法，對其進行監控。

離子色譜（ion chromatography，IC）法是檢測陰離子最常用的方法，其具有快速、靈敏、重復性好、選擇性好等優點，在環境分析、食品分析及藥物分析中廣泛應用。目前出現了很多關于離子色譜在酒類中應用報道，鄒沫君等[22]建立了用離子色譜-電導檢測法測定白酒中氟離子的方法，其線性范圍廣，準確性和精密度良好，操作較簡便；魯廣秋等[23]應用離子色譜法測定出胡蜂酒中5種陰離子（氟（F-）、Cl-、溴（Br-）、NO3-、PO43-）含量，為評價胡蜂酒提供新思路；ZHONG F J 等[24]應用離子色譜法實現了在33 min內分離測定出白酒中甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、谷氨酸鹽、氟化物、氯化物和硫酸鹽等化合物；BILGˇI ALKAYA D等[25]建立了一種應用離子色譜法在22 min內分離測定出葡萄酒中七種無機陰離子（氟化物、氯化物、亞硝酸鹽、硝酸鹽、亞硫酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽）的方法，該方法定量限為0.5 mg/L；LI F等[26]建立了一種電導結合脈沖安培檢測的閥切換離子色譜法，能夠同時測定葡萄酒中的有機酸、無機陰離子和醛酚；WU J等[27]應用固相微萃取法結合離子色譜法測定出葡萄酒中的痕量陰離子。離子色譜法測定酒中糖醇、醛酸和離子等化合物是較為成熟的，但針對白酒中多種陰離子檢測相對較少，特別是污染物（BrO3-、次氯酸根（ClO3-）、SCN-、ClO4-）。為了更好地監控白酒安全風險，本研究建立一種離子色譜法測定白酒中10種陰離子（BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、碘（I-）、PO43-、SCN-、ClO4-）的方法，并進行方法學考察，旨在為白酒中多種陰離子測定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同廠家白酒（酒精度為36%vol、38%vol、40%vol、42%vol、45%vol、52%vol、60%vol）：市售；BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、I-、PO43-、SCN-、ClO4-標準溶液（質量濃度均為1 000 μg/mL）：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；C18小柱（60 mg/3 mL）：美國菲羅門公司。

1.2 儀器與設備

ICS-5000離子色譜儀（帶電導檢測器、氫氧化鉀自動淋洗液發生器）：美國Thermo Fisher公司；EG37C加熱板：北京萊博艾德科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 離子色譜條件

分析柱：IonPac AS19色譜柱（250 mm×4 mm）、IonPac AG19保護柱（50 mm×4 mm）：流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：25 μL；抑制電流：174 mA；梯度淋洗條件：0～15.0 min，3 mmol/L～20 mmol/L KOH；15.0～15.1 min，20 mmol/L～10 mmol/L KOH；15.1～30.1 min，10 mmol/L～70 mmol/L KOH，30.1 ～35 min，70 mmol/L ～3 mmol/L KOH[22]。

1.3.2 標準溶液配制

分別移取適量標準溶液至100 mL的容量瓶中，用去離子水定容，配制成BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、PO43-、SCN-、ClO4-質量濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L和I-質量濃度分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L混合標準系列溶液。

1.3.3 樣品前處理

移取10 mL白酒于50 mL燒杯中，置于180 ℃電熱板上，加熱濃縮至溶液至5 mL，取出樣品，冷卻至室溫，轉移至5 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，過0.45 μm有機濾膜和C18小柱（預先用甲醇和水活化），收集溶液至1.5 mL進樣小瓶[23，28]。

1.3.4 方法學考察

（1）重復性試驗

取1.3.2 中1 mg/L混合標準溶液重復測量6 次，以出峰時間的相對標準偏差說明方法的定性重復性和以峰面積的相對標準偏差說明方法的定量重復性。

（2）加標回收率和精密度試驗

取52%vol 白酒10 mL分別加入10種陰離子（BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、I-、PO43-、SCN-、ClO4-），均為2.5 μg（低）、10 μg（中）、25 μg（高），白酒樣品加標后的操作跟1.3.3一致，重復測定6次，計算精密度試驗及加標回收率試驗結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2010軟件對檢測數據進行統計分析和繪制表格，采用SPSS 26.0統計軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 白酒樣品經C18小柱預處理的結果

白酒中乙醇占比很高，如果不經過任何處理直接進樣，乙醇會影響目標物質的測定，且會損害儀器和色譜柱，為避免還原性離子（如I-）被氧化，本試驗采用高溫短時處理（180 ℃加熱約20 min）能夠解決以上問題[23，29]，去除白酒中乙醇，同時達到濃縮樣品、降低方法檢出限的目的。有文獻報道C18小柱應用于白酒的前處理，可以去除樣品中部分有機物[28]，有利于目標物的測定。白酒樣品經C18小柱預處理前后的離子色譜分析結果見圖1。由圖1可知，白酒樣品沒有經過C18小柱預處理時，在5～10 min之間出現很大的干擾峰，這可能是樣品中不易揮發的醛類和酸類；在BrO3-和Cl-出峰位置有一個很大的干擾峰，嚴重影響BrO3-和Cl-的測定。經C18小柱的處理后，5～10 min的干擾峰明顯減小，特別是BrO3-和Cl-出峰位置的干擾峰得到去除，BrO3-和Cl-出峰清晰，基線更加平穩，有利于樣品的測定。

圖1 白酒樣品經C18小柱預處理前后的離子色譜圖對比Fig.1 Comparison of ion chromatograms of Baijiu sample before and after C18 column pretreatment

2.2 標準曲線的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限及定量限

分別將本研究中涉及的10種陰離子配制成混合標準溶液，按照所建立的分析方法進行測定，離子色譜圖見圖2。由圖2可知，在本試驗條件下，測定的10種陰離子（BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、I-、PO43-、SCN-、ClO4-）在35 min內能夠實現良好分離。

圖2 10種陰離子標準溶液的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of 10 anionic standard solutions

以峰面積（y）為縱坐標，標準溶液質量濃度（x）為橫坐標制作標準曲線，得到標準曲線回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限見表1。

表1 白酒中10種陰離子的標準曲線回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限Table 1 Regression equation of standard curve, linear range, correlation coefficient, detection limit and quantitation limit of 10 anions in Baijiu

由表1可知，分離度為2.17～10.51，能達到測定要求。I-在0.5～10.0 mg/L范圍內、其他9種陰離子的線性范圍為0.1～10.0 mg/L，相關系數R均＞0.997。以3倍信噪比計算10種陰離子的檢出限，除I-檢出限較大外，其他陰離子檢出限均低于0.05 mg/L，以10倍信噪比計算10種陰離子的定量限，除I-外，其他陰離子定量限不超過0.1 mg/L，表明能滿足10種陰離子的檢測分析要求。

2.3 重復性試驗

取10種陰離子濃度為1 mg/L混合標準溶液重復測量6次，以出峰時間的相對標準偏差說明方法的定性重復性，以峰面積的相對標準偏差說明方法的定量重復性，結果見表2。由表2可知，定性和定量的重復性很好，其定性重復性試驗的RSD為0.11%～0.38%，其定量重復性試驗的RSD為0.5%～3.9%。結果表明該檢測方法重復性良好。

表2 定性和定量重復性試驗結果Table 2 Results of qualitative and quantitative repeatability tests

2.4 精密度和加標回收率試驗

采用52%vol白酒樣品進行加標試驗，移取10 mL白酒樣品加標后按照1.3.3處理后上機測定。本試驗分別考察2.5 μg、1.0 μg、2.5 mg/L低、中、高加標水平條件下回收率，精密度及加標回收率試驗結果見表3。

由表3可知，除樣品中BrO3-、ClO3-和I-未檢出，其他7種陰離子均有檢出；10種陰離子精密度試驗結果RSD均＜10%，說明方法的精密度好；除低加標量（2.5 μg）條件下BrO3-和I-加標回收率較差（分別36%和30%），其他8種陰離子（Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、PO43-、SCN-、ClO4-）的加標回收率為73%～128%；I-加標回收率較低，可能是因為I-比較活潑、易與氧氣反應，造成了部分I-損失；BrO3-隨著加標水平提高，其加標回收率明顯升高，高水平加標量可達到77%。由于BrO3-出峰處有干擾峰的影響，因此低含量BrO3-的準確定量，有待進一步研究，因此方法除低含量的BrO3-和I-準確性較差外，其他離子的低中高含量準確度都較好。結果表明，該方法精密度及準確度較好。

2.5 白酒樣品中10種陰離子分析結果

隨機選購不同酒廠的同一批次酒，酒精度分別為36%vol、38%vol、40%vol、45%vol、52%vol、60%vol的白酒樣品共23個，采用本試驗方法測定白酒樣品中上述10種陰離子，結果見表4。由表4可知，Cl-、NO3-、SO42-和PO43-對白酒口感和感官有直接影響，隨著這4種離子含量的增高，會抑制白酒呈香，會使酒更醇和，除磷酸根離子外，其他3種離子能增加白酒的醇甜感[11]。結果表明，Cl-、NO3-、SO42-和PO43-含量差異很大，如：Cl-含量最高來自兩批酒精度為45%vol的酒樣，為15 mg/L，而最低來自酒精度為52%vol的酒樣，為0.5 mg/L；NO3-最高值和最低值均來自酒精度為60%vol的酒樣，分別為7.7 mg/L和0.43 mg/L；SO42-和PO43-最高值可達33 mg/L和86 mg/L，而最低分別僅為0.3 mg/L和0.19 mg/L，這可能造成市售白酒口感差異很大的原因。BrO3-是一種致癌物質，是禁用物質，由于飲用水在使用臭氧消毒的過程中會產生BrO3-，因此我國的飲用水標準中對BrO3-也規定了限量值。本次檢測的23個白酒樣品中有10個檢出BrO3-，檢出率為43%，最高值為0.45 mg/L，遠超過了飲用水中BrO3-限量值0.01 mg/L，因此白酒中BrO3-的含量應引起重視。由于含氯消毒劑和含氯鹽的使用，造成ClO3-和ClO4-在水中或其他食品中被檢出，ClO3-和ClO4-危害很大，特別是ClO4-，會影響人體發育，造成機體會發生骨髓造血細胞再生障礙。ClO3-和ClO4-對白酒還未造成較嚴重的污染，雖然ClO3-檢出13批，占57%，但測定值為0.04～0.08 mg/L，而檢出ClO4-僅有2批，且測定值僅為0.08～0.09 mg/L。SCN-會造成神經系統、消化系統和皮膚受到損害，從2005年起，我國不允許SCN-作為保鮮劑應用于乳制品中。SCN-在乳制品中應用的研究報道較多，鮮見其在白酒中應用的相關報道。本試驗檢出11批SCN-，占比48%，最高值可達1.2 mg/L，由此白酒中SCN-亦應引起重視。

表4 白酒樣品中10種陰離子含量的檢測結果Table 4 Determination results of 10 anions contents in Baijiu samples

3 結論

采用離子色譜法測定10種陰離子（BrO3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、I-、PO43-、SCN-、ClO4-），該檢測方法分離度好（2.17～10.51），色譜峰型好，線性范圍寬（I-為0.5～10.0 mg/L、其他均為0.1～10.0mg/L），線性相關性好（相關系數R＞0.997）。重復性、精密度試驗結果相對標準偏差（RSD）分別均＜5%、＜10%，除BrO3-和I-在低加標量（2.5 μg）條件下加標回收率較差（分別36%和30%），其他8種陰離子（Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、SO42-、PO43-、SCN-、ClO4-）的加標回收率為73%～128%，說明該方法的重復性、精密度、準確度較好。采用本方法對市售23批白酒中樣品進行了測定，Cl-、NO3-、SO42-和PO43-各個離子之間的含量差異很大，如SO42-和PO43-最高值可達33.0 mg/L和86.0 mg/L，而最低分別僅為0.3 mg/L和0.19 mg/L；BrO3-、ClO3-、SCN-和ClO4-分別檢出10、13、11、2批，占比為43%、56%、48%、9%，其中ClO3-和ClO4-檢出值較低，分別為0.04～0.08 mg/L、0.08～0.09 mg/L，而BrO3-和SCN-檢出的最高值分別為0.49 mg/L、1.2 mg/L，這兩種離子-對白酒有一定的風險，應該引起注意。