錐栗雜交F1 代果實表型性狀變異分析及單株綜合選擇

方 周，江錫兵，龔榜初，賴俊聲，吳 劍，李 煜

(1. 中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400；2. 福建農林大學林學院，福建 福州 350002；3. 慶元縣自然資源和規劃局，浙江 慶元 323800)

錐栗（Castanea henryi(Skan) Rehder & E.H. Wilson） 屬殼斗科（ Fagaceae） 栗屬（Castanea）植物，是我國特有的木本糧食樹種和特色經濟林樹種。錐栗果實含有豐富的淀粉、糖、蛋白質、維生素以及人體必需的多種氨基酸和礦質元素，口感細膩香甜，風味獨特，深受廣大南方群眾的喜愛[1]。且其樹干通直，材質優良，紋理微密，是優秀的果材兼用樹種。錐栗原產于我國中部，自然分布于秦嶺、淮河以南的14 個省份，尤以閩北和浙南種質資源最為豐富。通過對野生群體的人工選育，在浙江慶元、福建建甌等地選出了多個大果、高產的優良品種[2]，并進行了大規模的人工栽培，成為帶動山區農民增收致富的重要途徑，具有良好的經濟效益。目前全國錐栗栽培面積約8 萬hm2，而年產量僅為8 萬噸[3]。大果、豐產的高品質錐栗品種稀少，已經逐步成為制約錐栗產業發展壯大的重要因素。

錐栗新品種選育目前主要為傳統的選擇育種。自上世紀90 年代起，育種工作者對野生錐栗資源進行了長期的人工選育，繼續選擇潛力已經不大；同時隨著城市化進程推進，有限的錐栗野生居群遭到不斷的破壞，其面積逐漸縮小，從中進一步選育出錐栗優良品種的難度越來越大，雜交育種逐漸成為錐栗新品種選育的新方向。雜交育種可以使不同遺傳基礎的親本基因在子代進行重組，產生不同的遺傳多樣性，通過篩選有可能尋找出兼具或者超過雙親優良性狀的新個體，從而為新品種選育提供材料[4]。近年來，雜交育種在油茶（CamelliaoleiferaAbel.）[5]、棗（Ziziphus jujubaMill.）[6]、獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）[7]等經濟樹種上運用廣泛，成為創育新品種的有效途徑。我國自上世紀 60 年代起， 通過對板栗（Castanea mollissimaBlume.）、丹東栗（Castanea crenataSieb. et Zucc.）、日本栗（Castanea crenataSieb. et Zucc.）等栗屬植物的雜交，成功選育出一批具有高產、早熟、適應性強等優良特性的栗新品種[8-10]，然而國內錐栗雜交育種相關研究尚在起步階段，關于錐栗雜交子代的經濟性狀相關研究鮮有報道。

本研究以錐栗雜交F1代為材料，通過變異分析、方差分析、主成分分析以及灰色關聯度分析對其果實表型性狀進行研究，并綜合選擇優良雜交子代單株，為后續進一步開展錐栗優良新品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地位于浙江省麗水市慶元縣關門岙林區，屬亞熱帶季風性氣候。以中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所選育的‘YLZ 1 號’等13 個錐栗優良新品種或無性系為雜交親本，2011 年通過人工控制授粉獲得錐栗雜交果實，2012 年播種育苗，2013 年春季建立雜交子代測定林，采用完全隨機區組設計，株行距4 m × 4 m。于2021 年8 月對錐栗雜交F1代結果情況進行調查統計，共選取143 株生長發育良好、結果性能較強的雜交子代單株。雜交組合概況以及單株數量見表1。

表1 錐栗雜交組合概況Table 1 Cross combination of chestnut

1.2 試驗方法與數據處理

2021 年9 月至11 月，根據調查結果于每株子代上采集30 ～ 50 個健康飽滿無病害的成熟栗苞帶回實驗室，使用游標卡尺、百分位天平測定栗苞總質量（X1）、栗苞橫徑（X2）、栗苞縱徑（X3）、堅果總質量（X4）、單果質量（X5）、堅果橫徑（X6）、堅果縱徑（X7）、果形指數（X8）與苞刺長度（X9）等9 個數量性狀，并計算其出籽率（X12），之后每個單株選取15 ～30 個健康堅果，剝去種皮，稱量栗仁總質量，計算其出仁率（X11），再將栗仁與種皮放置于烘箱內，105 ℃殺青15 min，65 ℃烘干72 h 后取出，稱量栗仁和種皮的總干質量，并計算堅果含水率（X10）。出籽率與出仁率的計算公式如下:

式中：Sr為出籽率，m1為測定的堅果總質量，M1為測定的栗苞總質量，Kr為出仁率，m2為剝取出的栗仁總質量，M2為剝取的堅果總質量。

參考LY/T 1851—2009《植物新品種特異性、一致性、穩定性測試指南 板栗》[11]和NY/T 2328—2013《農作物種質資源鑒定評價技術規范板栗》[12]，結合錐栗堅果實際表型，對栗苞形狀、苞刺密度、堅果形狀、堅果顏色、果面茸毛、果面光澤與底座大小等7 個錐栗果實外形特征性狀進行人工評定。外形特征性狀的等級評定按照表2 進行賦值，計算其出現頻率與Shannon 多樣性指數，其中栗苞內結果不止一個的取正常邊果或飽滿果進行測定。Shannon 多樣性指數多樣性指數計算公式為:

表2 性狀特征描述及代碼Table 2 Characteristic traits description and code

其中pi為性狀在群體中出現的頻率。

采用EXCEL 2007、R 語言軟件包與ORIGIN 2021b 等進行數據處理。包括方差分析、變異分析、主成分分析以及灰色關聯度分析。

2 結果與分析

2.1 雜交子代果實外形特征性狀遺傳多樣性

錐栗雜交子代7 個果實外形特征性狀的多樣性分析見表3，從中可見，F1代栗苞形狀與苞刺密度分別以球形、密為主，頻率分別達到了63.89%與56.94%；堅果形狀以球形為主，頻率為50.00%；顏色以紅褐色為主，頻率達到了65.97%。7 個外形特征性狀的多樣性指數除底座大小僅為0.168 2 以外，其余性狀均大于0.8，其中多樣性指數大于1 的是果面絨毛、果面光澤與堅果形狀，由此可見，錐栗雜交F1代7 個果實外形特征性狀除底座大小比較穩定外，其余6 個性狀表現出豐富的多樣性。

表3 雜交子代果實外形特征性狀的頻率分布及Shannon 多樣性指數Table 3 Frequency distribution and Shannon's Diversity Index of hybrids

2.2 雜交子代果實數量性狀變異分析

2.2.1 F1代果實表型的變異分析 錐栗雜交F1代果實數量性狀的變異分析結果見表4，12 個數量性狀除含水率與出仁率，其余性狀變異系數均大于10%，具有豐富的變異，其中變異系數較大的3 個性狀分別是栗苞總質量、堅果總質量與單果質量，變異系數分別達到了41.10%、42.25%、33.58%，而最低的為出仁率，僅為6.28%。雜交子代果實表型差異較大，可開展單株選擇。

表4 雜交子代果實12 個數量性狀的變異分析Table 4 Variation analysis of 12 quantitative characters in hybrid fruits

2.2.2 F1代果實表型的方差分析 對栗苞總質量等9 個數量性狀進行單因素方差分析，結果見表5。可見9 個性狀在143 個個體間均存在極顯著差異（P＜0.01）。所有性狀中F值最大的為果形指數，F值為118.99，最小的為單果質量，F值為59.28。以上結果表明各雜交子代果實數量性狀個體內差異小于個體間，個體間差異為變異的主要來源。

表5 雜交子代果實9 個數量性狀的單因素方差分析Table 5 One-way ANOVA of 12 quantitative characters in hybrid fruits

對栗苞總質量、堅果總質量、單果質量等3 個重要經濟性狀，在極顯著水平下（P＜0.01）進行LSD 多重比較并取前20 名，如表6。

表6 雜交子代果實3 個重要經濟性狀的LSD 排序結果Table 6 LSD sequencing results of three important economic traits in hybrid fruits

2.2.3 F1代果實表型的相關性分析 雜交F1代12 個數量性狀的相關性系數見表7。可見各性狀之間呈現出一定的相關性，共存在42 組極顯著相關（P＜0.01）與6 組顯著相關（P＜0.05）關系，其中，栗苞總質量、栗苞橫徑、栗苞縱徑、堅果總質量、單果質量、堅果橫徑、堅果縱徑與苞刺長度等性狀間均存在極顯著相關（P＜0.01），其中相關性最大為單果質量與堅果橫徑2 個性狀，相關系數為0.937；出仁率與堅果總質量、單果質量、堅果橫徑、堅果縱徑之間均存在極顯著正相關（P＜0.01），表明出仁率與堅果的表型關聯度較高；出仁率與出籽率之間存在極顯著正相關（P＜0.01），可見兩個性狀之間存在較為緊密的關系。生產實踐中可根據以上相關性，開展聯合選擇。

表7 雜交子代果實性狀的相關系數Table 7 Correlation coefficient of crossing fruit traits

2.3 錐栗雜交F1 代單株綜合選擇

2.3.1 雜交子代數量性狀的主成分分析 根據賴俊聲等[13]的方法，對栗苞總質量（X1）、栗苞橫徑（X2）、栗苞縱徑（X3）、堅果總質量（X4）、單果質量（X5）、堅果橫徑（X6）、堅果縱徑（X7）、果形指數（X8）、苞刺長度（X9）、堅果含水率（X10）、出仁率（X11）和出籽率（X12）等12 個數量性狀值進行Z-score 標準化，導入ORIGIN 2021b 軟件中進行主成分分析。如表8，得到各主成分的特征值、貢獻率與累計貢獻率。可見前4 個主成分的累積貢獻率已達到84.59%，表明前4 個主成分已經可以代表143 個單株12 個數量性狀的84.59%的信息，因而提取前4 個主成分進行分析。

表8 數量性狀主成分特征值以及累計貢獻率Table 8 Principal component eigenvalue and cumulative contribution rate of quantitative traits

提取前4 個主成分的因子載荷矩陣如表9，其中對第一主成分貢獻較大的性狀為栗苞總質量、栗苞橫徑、栗苞縱徑、堅果總質量、單果質量、堅果橫徑、堅果縱徑與苞刺長度，即表征雜交F1代果實的表型，它們反應了48.85%的原始信息；對第二主成分貢獻較大的為出仁率與出籽率兩個性狀，反應了15.59%的原始信息；對第三主成分貢獻較大的是果形指數，即表征堅果的外形特性；對第四主成分貢獻較大的是堅果含水率。

表9 前4 個主成分因子載荷矩陣Table 9 Load matrix of the first four principal component factors

通過前4 個主成分的特征值與相關性矩陣，建立主成分方程：

根據4 個主成分的貢獻率，得到綜合評價方程：

利用綜合評價方程對143 株雜交子代進行得分計算，將綜合得分前20 的單株進行排序，如表10。

表10 雜交子代主成分綜合評價得分排名Table 10 Ranking of principal component comprehensive evaluation scores of hybrids

2.3.2 雜交子代數量性狀的灰色關聯度分析 根據蘇欣欣等[14]的方法，將錐栗雜交F1代12 個數量性狀整體視作一個灰色系統，以全部子代12 個性狀中每一性狀的最大值組成參考品種，即栗苞總質量46.22 g、栗苞橫徑73.71 mm、栗苞縱徑68.41 mm、堅果總質量18.22 g、單果質量12.45 g、堅果橫徑29.13 mm、堅果縱徑31.31 mm、果形指數1.83、刺長16.49 mm、堅果含水率51.14%、出仁率84.41%和出籽率51.85%，子代的12 個性狀值構成比較序列。由于各性狀的量綱不一致，因此將各子代性狀值除以參考序列對應性狀值去除量綱。計算各性狀的灰色關聯度、權重以及各單株的灰色評價值。

如表11，可見在整個系統中，權重占比最大為含水率（X10），權重為11.37%；占比最小為堅果總質量（X4），其權重為5.82%，其次是栗苞總質量（X1）與單果質量（X5），權重分別為6.03%與6.62%。根據得到的灰色關聯系數，計算各單株的綜合評價得分，取得分前20 名的單株以及得分，如表12。

表11 雜交子代12 個數量性狀灰色關聯系數及權重Table 11 Grey correlation coefficient and weight of 12 quantitative characters in hybrids

表12 雜交子代單株灰色關聯度綜合評價得分Table 12 Comprehensive evaluation score of grey correlation degree for individual plant of hybrids

結合2.3.1 的主成分綜合評定結果，其中G-98 在2 種綜合排序方法中均為最佳單株。最終選出在2 種綜合評價方法均得分較高的10 株單株，分別是G-98、D1-4、C-68、C-55、E-30-2、U-14、E-32、G-111、T1-4、W-6，單株果實部分重要經濟性狀見表13。可見除C-68 外，其余單果質量均在9 ～ 13 g 之間，屬于大果單株。

表13 綜合選擇單株的重要經濟性狀Table 13 Important economic traits of single plant selected comprehensively

3 討論

栗屬植物均為2 倍體且均含有24 條染色體，可進行相互雜交[15]。雜交育種工作在栗屬植物上開展較早，20 世紀初國外學者開展了一系列以抗栗疫病特性為育種目標的種間雜交，并選育出了歐洲栗、美洲栗與中國板栗的雜交新品種[16-17]。國內學者自上世紀60 年代起，以高產，早熟，抗病蟲為主要目標開展了日本栗與中國板栗的種間雜交，時興春等[18]以江蘇省板栗主栽品種處暑紅作母本，日本栗品種‘伊吹’和遼寧省自然雜種‘紅石一號’的混合花粉作父本，得到了抗蟲、豐產、早實的板栗新品種‘中日一號；在板栗種內雜交育種研究中，明桂冬等[19]從‘紅栗’和‘泰安薄殼’的雜交后代中選育出板栗新品種‘紅1 號’；郭燕、李穎等[20-21]以板栗品種‘燕明’為母本，‘燕山早豐’為父本進行雜交，從雜交后代中選育出優質、豐產的板栗新品種‘冀栗1 號 ’與‘明豐2 號’。近年來錐栗雜交育種研究逐步開展，李艷民等[22]以湖南 4 個錐栗優系為親本進行雜交，并對雜交子代幼苗的生長特性進行研究，以生長優勢為育種目標，選擇出最佳授粉組合‘ZFPL-2’ × ‘LYXJ-6’；章平生等[23]以板栗、錐栗種內和種間9 個雜交組合235 個單株及其親本為試材，對其葉表型及光合生理性狀進行分析，結果表明各性狀存在豐富的遺傳多樣性，不同雜交組合內變異是總變異的主要來源，并綜合選出“魁栗 ×YLZ 15 號”和“魁栗 × YLZ 1 號”兩個優良雜交組合。錐栗雜交育種工作在非經濟性狀研究上已取得一定成果，為錐栗雜交子代果實性狀研究提供了有利基礎。

本研究中，錐栗雜交F1代果實7 個外形特征性狀除底座大小外，其余性狀多樣性指數均大于0.8，雜交子代在果實外觀表征上存在豐富的多樣性。12 個數量性狀中變異系數較大的為栗苞總質量、堅果總質量與單果質量，均超過30%，而除含水率與出仁率外，其余性狀變異系數均大于10%，差異明顯，存在較大的選擇潛力。結合單因素方差分析，結果表明錐栗雜交F1代單株在各數量性狀上差異均達到極顯著水平（P＜0.01），且個體間差異是變異的主要來源。相關性分析表明12 個數量性狀性狀之間共存在42 對極顯著相關關系（P＜0.01），性狀間關聯性較強，此結論與龔榜初[24]、李穎林[25]等的一致，其中栗苞總質量、堅果總質量與單果質量等3 個重要經濟性狀與其他性狀間分別存在8 對、9 對、9 對極顯著相關關系。后續育種工作中可根據單株經濟性狀之間的顯著差異以及關聯性，在錐栗雜交F1代中開展單株選擇與性狀間聯合選擇。

為選擇優良錐栗單株，在本研究中測定了12 個不同的數量性狀。由于數量性狀數目較多，單獨從某一數量性狀上進行比較非常片面，難以進行選擇。主成分分析可以將多個因子降維為幾個相對獨立的主成分因子，這些因子含有原始數據的大部分信息量，從而簡化數據結構，降低選擇難度[26]；而灰色關聯度分析將含有多個因素的數據整體視作一個封閉的系統，分析系統內不同因素之間的關聯程度大小，通過計算得出參試品種與與理想品種之間的差距，從整體上進行綜合評價[27]。兩種方法同時使用，將單一角度進行對比轉變為對全局綜合考慮，能夠降低優良品種篩選的難度，在林業生產實踐上已經得到廣泛的使用。崔博文等[28]對來自7 個不同種源的馬尾松進行磷脅迫試驗，使用主成分分析與灰色關聯度分析脅迫條件下15 個生理生化指標，最終將馬尾松的7 個種源根據耐低磷能力分為4 大類；楊璐等[29]利用主成分分析與灰色關聯度分析對13 個桑葚品種的果實化學指標進行分析，選出了總黃酮、總酸、總多糖等5 項能代表果實營養品質的代表性化學指標；江錫兵等[30]使用主成分分析與灰色關聯度分析對來自長江中下游的25 個板栗主栽品種與5 個北方板栗代表性主栽品種的果實與營養品質進行綜合評價，選出了6 個綜合評分均在前列的板栗主栽品種。在本研究中，分別使用灰色關聯度分析與主成分分析對143 株錐栗雜交子代單株進行排序，均選擇出20 株排名靠前的優良單株，并將排序結果進行比較。2 種排序結果之間的重合度達到了90%，具有良好的綜合選擇效果，此結論與江錫兵等[30]得出兩種綜合排序結果具有較強相關度的結論相似。且主成分分析、灰色關聯度分析與栗苞總質量、堅果總質量、單果質量等3 個重要經濟性狀值排序前20 名的單株重合度分別達到了65%、75%、75%與60%、60%、65%，3 者中與以單果質量排序結果的重合度較高。結合變異分析以及相關性分析，可知此3 個重要經濟性狀具有選擇潛力較大、與其余性狀關聯性較強的特點，說明在錐栗育種工作中根據以上3 個重要經濟性狀，尤其是以單果質量為主要育種目標選取大果單株具有較高的可行性。同時在綜合得分前20 名的單株中，組合L 的單株個數在2 種方法中均占到20%以上，其次是組合C、組合G、組合E，均占到了10%，但無法直接說明以上4 個組合是較好的雜交組合，還需對親本配合力、遺傳距離、雜種優勢等方面進行深入研究。此外，由于兩種排序方法的統計學原理并不相同，出現了V1-6、C-35、L-47 與J-31-1 等在2 種分析結果中并不重復的單株，生產實踐上可以綜合考慮單株的特有性狀與實際育種目標，對以上單株進行選擇。

4 結論

本研究以錐栗雜交F1代的143 株單株為材料，對其7 個果實外形特征性狀與12 個果實數量性狀進行測定與分析，并使用主成分分析法和灰色關聯度分析法對12 個數量性狀進行綜合分析，通過綜合評價模型評選出優良單株。試驗結果表明錐栗雜交F1代果實性狀變異較為豐富，性狀間存在一定關聯性，具有較好的選擇潛力；兩種綜合選優方法排序結果與以單果質量等3 個重要經濟性狀值排序結果重合度較高，相互驗證。研究結果為錐栗新種質創制和優良新品種選育奠定了基礎。