杜仲夢尼夜蛾CD36 家族同源基因克隆與組織分布研究

黃星瑞，楊 潔，鄒 潔，文 璽，胡傳豪，張佑祥，黃興龍＊

(1. 吉首大學 生物資源與環境科學學院，湖南 吉首， 416000；2. 吉首大學，杜仲綜合利用技術國家地方聯合工程實驗室，湖南 吉首， 416000)

昆蟲通過觸角、口器等器官上的嗅覺感受器精準感知外界的化學信號[1]。這些被感知信號的化學本質是由昆蟲同類、寄主植物、天敵生物、有機環境等生物和非生物釋放的揮發性化學分子，因此嗅覺在昆蟲同類交流[2]、尋找寄主[3-4]、繁殖后代[5]、棲息越冬[6]等多種行為中發揮了非常重要的作用。昆蟲嗅覺感受器是一類形狀多變的特化表皮結構，常見的有毛形感受器、指形感受器、腔錐形感受器等。這些感受器表面有供分子進入的細微孔道，基部有1 個或多個感覺神經元。感覺神經元表面和周圍分布的多種蛋白作為嗅覺感受的分子基礎，在昆蟲雌雄識別、寄主定位等活動中發揮了關鍵作用。

感覺神經元膜蛋白（ Sensory neuron membrane proteins, SNMPs）是一類在昆蟲嗅覺器官中大量表達的膜蛋白，在分子進化上與脊椎動物跨膜轉運蛋白白細胞分化抗原36（Transmembrane transporter protein cluster of differentiation 36,CD36）家族受體同源。脊椎動物CD36 家族受體包含2 個分別位于氮端和碳端的跨膜區域，以及1 個位于跨膜區域之間的細胞外結構域，在細胞脂肪酸轉運和代謝中發揮了重要作用[7]。SNMPs 分為SNMP1 和SNMP2 兩個亞族，與脊椎動物CD36 家族受體類似，也包含2 個跨膜區域和1 個細胞外結構域。在組織分布上，SNMPs 主要在觸角、口器等嗅覺器官中表達，在非嗅覺器官中表達量較低[8]。原位雜交實驗表明，編碼SNMP1 的mRNA 出現在昆蟲嗅覺神經元中[9]；進一步的免疫標記實驗發現，SNMP1蛋白定位于嗅覺神經元細胞膜，并且與感受雌蟲釋放性信息素的氣味受體高度關聯[10]。基因敲除實驗證實，SNMP1 基因是昆蟲性信息素感受所必需的[11]。Pregitzer 等[12]在昆蟲細胞系中共表達了煙芽夜蛾SNMP1 和性信息素受體HR13，發現共表達SNMP1 和HR13 的細胞在性信息素刺激下產生的嗅覺電位反應顯著高于單獨表達HR13 的細胞，推測SNMP1 能夠顯著提高性信息素受體對性信息素的敏感性。SNMP2 定位于嗅覺感受器支持細胞，在嗅覺神經元中不表達[9]。異源表達實驗發現，SNMP2 的存在與否并不影響氣味受體對氣味分子的識別。但是鑒于SNMP2 與嗅覺功能高度關聯的表達模式和細胞定位，推測該蛋白參與了氣味分子被識別后的轉移和清除過程[13]。

B 族清道夫受體（Class b Scavenger receptors,SRb）是一類在昆蟲和脊椎動物中都廣泛存在的兩次跨膜蛋白，與SNMPs 一樣也具有CD36 家族受體的空間結構特征，包含2 個位于細胞內的末端、2 個跨膜區域和1 個位于跨膜區域之間的細胞外結構域。在脊椎動物中，SRb 主要作為脂類和脂蛋白受體，參與了脂類、膽固醇、類胡蘿卜素等有機化合物的識別和轉運[14]。對小鼠鼻腔黏膜SRbs 的研究發現，這些SRbs 還參與了醛類氣味分子的嗅覺識別[15-16]。目前研究比較深入的昆蟲SRbs 主要來自果蠅、家蠶和蜜蜂；這些SRbs 在頭部、絲腺、體壁、脂肪體、精巢、卵巢、馬氏管等多種組織和器官中分布，表達時期涵蓋卵、幼蟲、蛹和成蟲，參與了包括物質轉運、細胞免疫、生長發育在內的多種生化進程[17-20]。

杜仲夢尼夜蛾（Orthosia songiChen et Zhang）隸屬于鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）行軍蟲亞科（Hadeninae）[21]。該蟲為單食性害蟲，只為害我國重要的藥用植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliver）[22]。交配后的杜仲夢尼夜蛾雌蛾通常選擇杜仲嫩葉進行產卵，孵化的幼蟲直接以杜仲葉片為食。該蟲食量大，擴散蔓延快，為害時期長，已經成為我國杜仲產業最具威脅的蟲害之一[23-25]。對其他夜蛾科昆蟲的研究發現，昆蟲行為與嗅覺功能關系密切，干擾昆蟲對異性和寄主的嗅覺識別已發展成為重要的害蟲無公害防治手段[26]。SNMPs、氣味受體等嗅覺蛋白在昆蟲配偶識別、寄主選擇等行為中發揮了重要作用，探究昆蟲嗅覺蛋白的功能和表達規律可以為開發針對昆蟲嗅覺的害蟲防治手段提供科學依據[27]。本研究在杜仲夢尼夜蛾中鑒定得到3 個CD36 家族受體同源基因（OsonSNMP1、OsonSNMP2 和OsonSRb1）；這些基因編碼的蛋白具有2 個位于碳/氮端的跨膜區域和介于跨膜區域之間的胞外結構域；胞外結構域具有6～8 個保守的半胱氨酸殘基，并包含一個主要由反向平行β-折疊構成的桶狀核心；定量PCR 結果表明OsonSNMPs 和OsonSRb1 主要在嗅覺功能相關的器官中表達。本研究為研究杜仲夢尼夜蛾CD36 家族同源基因的嗅覺功能提供了科學數據。

1 研究方法

1.1 試蟲準備

杜仲夢尼夜蛾幼蟲采自湖南省張家界市江婭林場，帶回實驗室后置于恒溫培養箱（溫度27 ± 1℃，相對濕度70% ± 5%，光周期16L∶8D），以新鮮的杜仲葉片飼養至成蟲。幼蟲化蛹后，在體視鏡下觀察腹部生殖節判斷雌雄。羽化1～3 d 的成蟲用于解剖獲取觸角、口器、胸、腹、足和翅，其中觸角、口器、足和翅分別來自20 頭雄蟲和20 頭雌蟲，胸和腹分別來自3 頭雄蟲和3 頭雌蟲；所有組織在液氮中保存直至RNA 提取。

1.2 RNA 提取與cDNA 合成

將杜仲夢尼夜蛾組織研磨成粉末，使用柱式動物組織總RNA 抽提純化試劑盒（生工，上海）進行RNA 提取，操作步驟按說明書執行；RNA 濃度和純度在核酸蛋白測定儀（Eppendorf，德國）測定。使用自帶基因組DNA 移除的cDNA 合成試劑盒（全式金，北京）進行cDNA 第一鏈合成，按照試劑盒說明書進行加樣，樣品在PCR 儀（博日科技，杭州）中42 ℃反應15 min，85 ℃加熱5 s 終止反應；合成的cDNA 在-20 ℃保存。

1.3 生物信息學分析

從我們前期獲得的杜仲夢尼夜蛾轉錄組數據中篩選注解為“Sensory neuron membrane protein”和“Class b Scavenger receptor”的基因。使用Primer Premier 軟件將基因翻譯成蛋白質序列。使用NCBI 網站的BlastP 服務（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行相似蛋白序列搜索。采用ProtParam tool 在線工具（https://web.expasy.org/protparam）對蛋白質分子量和理論等電點進行預測；蛋白跨膜區域采用DTU Health Tech 網站的跨膜區域預測服務（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）進行預測；疏水性預測采用expasy 在線工具（https://web.expasy.org/protscale/）。蛋白質胞外結構同源建模使用Swiss-model 線上服務（https://swissmodel.expasy.org/），預測的蛋白空間結構使用Visual Molecular Dynamics 軟件呈現和展示重要氨基酸殘基。預測的SNMP 結構與系統發育分析使用MEGA5.0 軟件，采用步長法構建鄰接樹，重復1 000 次[28]。

1.4 基因克隆與實時熒光定量PCR

使用Primer Premier 軟件設計特異性引物進行基因克隆(表1)；PCR 反應體系包含12.5 μL 2xTaq MasterMix（康為世紀，北京），上下游引物各1 μL，cDNA 模板1 μL，滅菌水9.5 μL。反應程序為95 ℃預變性5 min；然后35 個循環的95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生物公司測序（生工，上海）。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

根據測序結果在NCBI 網站中的Primer Blast 服務（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）中設計實時熒光定量PCR 引物(表1)。實時熒光定量PCR 在PikoReal 熒光定量PCR 儀（Thermal，美國）中進行，反應體系為10 mL，包含5 μL 2xTaq UltraSYBR Mixture（康為世紀，北京），上下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，滅菌水3 μL。反應程序為95 ℃預變性10 min；然后40 個循環的95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s。以OsonTUA 和OsonNAPDH 基因作為內參基因，雌蟲腹部為參考組織，采用2-△△CT法計算OsonSNMPs 和OsonSRb1 基因在不同組織中的相對表達水平；使用SPSS 17.0 軟件中的Oneway analysis of variance (One-way ANOVA)方法對OsonSNMPs 和OsonSRb1 在杜仲夢尼夜蛾不同組織中的表達水平進行差異顯著性分析。

2 研究結果

2.1 基因鑒定

我們從杜仲夢尼夜蛾中克隆得到3 個隸屬于CD36 家族的基因(表2)，包括2 個SNMPs 基因(OsonSNMP1 和OsonSNMP2)和1 個SRb 亞族基因(OsonSRb1)。OsonSNMP1 開放閱讀框長度為1 575 bp，推導蛋白包含524 個氨基酸，預測的蛋白分子量為59.08 kDa，理論等電點6.31。OsonSNMP2 開放閱讀框1 563 bp，預測其推導蛋白包含520 個氨基酸，分子量58.58 kDa，等電點6.62。OsonSRb1 開放閱讀框長度為1 548 bp，編碼的蛋白包含515 個氨基酸，分子量58.0 kDa，等電點5.93。

表2 OsonSNMPs 和OsonSRb1 序列特征Table 2 Characteristics of OsonSNMPs and OsonSRb1 sequence

2.2 序列一致性和系統發育分析

序列一致性分析發現，OsonSNMP1 與甘藍夜蛾（Mamestra brassicae）的MbraSNMP1 序列一致性較高，達到93.90%；OsonSNMP2 與甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的SexiSNMP2 序列一致性較高，達到89.62%。OsonSRb1s 與其他夜蛾科昆蟲的SRb 家族基因序列一致性較高（72.18%～94.22%）。OsonSNMP1、OsonSNMP2和 OsonSRb1 三者之間序列一致性較低；OsonSNMP1 與OsonSNMP2 的序列一致性為31.57%，與OsonSRb1 的為26.44%；OsonSNMP2與OsonSRb1 的序列一致性為27.33%。在昆蟲SNMPs 和SRb1 基因構成的系統發育樹中SNMP1、SNMP2 和SRb1 各自聚為一支(圖1)，其中 SNMP1 分支和 SNMP2 分支臨近。OsonSNMP1 和OsonSNMP2 分別位于SNMP1分支和 SNMP2 分支， 其中 OsonSNMP1 與MsepSNMP1 臨近，步長為92%。OsonSNMP2與5 個夜蛾科昆蟲的SNMP2 基因所在分支臨近，步長為51%。OsonSRb1 位于鱗翅目昆蟲的SRb1 基因分支，且位于分支的邊緣。

圖1 昆蟲CD36 家族受體同源蛋白的系統發育分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of CD36 homologs in insects

2.3 推導蛋白結構預測

OsonSNMP1、 OsonSNMP2 和 OsonSRb1推導蛋白為包含2 個跨膜區域的膜蛋白；氮末端和碳末端位于細胞內，2 個疏水的跨膜區域分別靠近氮端和碳端，跨膜區域之間是一個大的細胞外結構(圖2A)。OsonSNMP1、OsonSNMP2 和OsonSRb1氮末端細胞內結構分別包含8、6 和18 個氨基酸殘基；碳末端細胞內結構分別為43、26 和38 個氨基酸殘基；3 個蛋白氮端、碳端跨膜區域均包含23 個氨基酸殘基；胞外結構分別為427、442 和413 個氨基酸殘基(表2)。

圖2 OsonSNMPs 和OsonSRb1 蛋白結構和保守半胱氨酸殘基在胞外結構域的空間分布Fig. 2 Protein structure of OsonSRb1 and OsonSNMPs and distribution of conserved cysteine residues in extracellular domain

胞外結構域空間結構預測表明，OsonSRb1和OsonSNMP2 具有1 個由反向平行β-折疊構成的桶狀核心和多個位于該核心外圍的α-螺旋。OsonSRb1 的細胞外結構域上有6 個保守的半胱氨酸殘基（C1～C6）(圖2A)，空間結構模型顯示這些半胱氨酸殘基參與了3 個二硫鍵鍵的形成（C1～C3、C2-C6 和C4～C5）(圖2B)。OsonSNMP1和OsonSNMP2 的胞外結構域上存在8 個保守的半胱氨酸殘基（C1～C8）(圖2A)，其中C3～C8與OsonSRb1 的C1～C6 同源，可能參與了3 個二硫鍵鍵的形成（C3～C5、C4～C8 和C6～C7），另 外 OsonSNMP1 和 OsonSNMP2 的 C1 和C2 在空間上臨近，但當前模型中并未形成二硫鍵(圖2C, D)。疏水性分析發現，OsonSNMP1、OsonSNMP2 和OsonSRb1 包含多個疏水性區域(圖3A～C)，其中碳/氮端跨膜區域疏水值最高；在胞外結構域也存在1 個疏水性區域，該區域為一段富含疏水性氨基酸殘基的α-螺旋。OsonSRb1、OsonSNMP1 和OsonSNMP2 胞外結構富含疏水性氨基酸殘基的α-螺旋位于蛋白的端部(圖3D～F)；疏水性氨基酸殘基占比分別為55.5%、58.6%和 58.6%。 OsonSNMP1、 OsonSNMP2 和OsonSRb1 胞外結構的β-折疊核心區域形成了1 個中空的桶狀結構，該結構與其他二級結構一起形成了一個貫穿整個蛋白的通道，通道入口靠近蛋白頂端，出口朝向細胞膜(圖3D～I)。

圖3 OsonSNMPs 和OsonSRb1 疏水性分析和胞外結構域空間結構Fig. 3 Hydrophobicity analysis and extracellular domain stereo view of OsonSRb1 and OsonSNMPs

2.4 組織分布

通過熒光定量PCR 實驗結果表明，杜仲夢尼夜蛾OsonSNMPs 和OsonSR1 均在觸角中大量表達(圖4)。OsonSNMP1 在雌雄蟲的觸角、翅和雌蟲足中表達水平較高，且在雄蟲觸角和雌蟲翅中的表達水平顯著高于其他組織(圖4A)。OsonSNMP2在雌蟲觸角和足中表達水平較高；在雌蟲足中的表達水平低于雌蟲觸角，但顯著高于其他組織(圖4B)。OsonSR1 在雄蟲觸角和口器，以及雌蟲口器中的表達水平顯著高于其他組織(圖4C)。

圖4 OsonSNMPs 和OsonSRb1 在不同組織中的表達Fig. 4 Expression of OsonSNMPs and OsonSRb1 in different tissues

3 討論

CD36 家族受體是一類在脂肪細胞、肝細胞、血細胞、嗅覺上皮細胞等多種細胞中廣泛表達的受體蛋白[29]，在脊椎動物免疫、代謝、血管形成和行為中發揮了重要作用[30]。昆蟲SNMPs 和SRbs 與脊椎動物CD36 家族基因同源，在化學感受和脂類物質轉運過程中發揮了重要作用[8,14]。本研究在杜仲單食性害蟲杜仲夢尼夜蛾中克隆得到2 個SNMPs基因和1 個SRbs 基因。這些基因編碼的蛋白具有CD36 家族受體的典型特征，包含2 個分別位于氮端和碳端的跨膜區域和1 個包含保守半胱氨酸殘基的細胞外結構。蛋白結構預測發現，昆蟲OsonSRb1 和OsonSNMPs 均包含一個由β-折疊構成的桶狀結構，6 個保守半胱氨酸殘基參與形成了3 個二硫鍵。序列一致性分析發現，這3 個基因編碼的蛋白與各自亞族蛋白序列一致性較高，但相互之間序列一致性較低：OsonSNMP1 與OsonSNMP2 為31.57%，與OsonSRb1 為26.44%，OsonSNMP2 與OsonSRb1 為27.33%。OsonSNMP1 和OsonSNMP2 在雌雄蛾的觸角中大量表達；OsonSRb1 在雌雄蛾的觸角和口器大量表達；此外，這些基因在翅上也有一定表達。我們的研究結果表明OsonSNMP1、OsonSNMP2和OsonSRbs 屬于CD36 家族，這些基因可能在杜仲夢尼夜蛾感覺器官中發揮了重要功能。

昆蟲SRbs 蛋白結構域與脊椎動物CD36 家族受體類似，包含2 個靠近碳/氮末端的跨膜區域和1 個胞外結構域，以及位于細胞內的碳/氮末端。CD36 家族受體的胞外結構域在配體結合和轉移中起到了重要作用[7]。人類CD36 胞外結構域具有1 個主要由β-折疊構成的通道和1 個位于頂端α-螺旋區域的疏水性區域[31]。該通道包含1～2 個靠近蛋白頂端的入口和1 個朝向細胞膜的出口，脂溶性化合物到達疏水性區域后沿通道滑向細胞膜[32]。本研究預測了OsonSRb1 的蛋白結構，發現該蛋白符合CD36 家族受體的結構特征，位于胞外結構核心區域的β-折疊形成了一個中空的桶狀結構，與其他二級結構一起形成了一條貫穿蛋白的通道，此外OsonSRb1 端部具有1 個富含疏水性氨基酸殘基的α-螺旋，我們推測OsonSRb1 能夠捕獲細胞外的脂溶性化合物，并通過蛋白內的通道將這些化合物向下游傳遞。在脊椎動物中，血脂主要以脂蛋白的形式進行運輸，CD36 家族受體通過胞外結構頂端的丙氨酸殘基與脂蛋白結合，并借助核心區域的通道轉運疏水性的長鏈脂肪酸[32]。昆蟲CD36 家族受體也能夠結合長鏈脂肪酸等脂溶性物質，這些膜蛋白在昆蟲脂肪酸代謝、免疫、感覺等生理活動中發揮了重要作用。在家蠶中，BmorSRbs家族受體與脂蛋白相互作用，促進固醇類化合物的攝入和轉運[33]；BmorSCRB8 可以直接與病原關聯因子結合，提高機體對病原的清除效力[18]。果蠅SRbs 受體ninaD 參與了細胞對類胡蘿卜素的攝入，由于類胡蘿卜素是視覺發色團合成的重要原料，缺失ninaD 基因會導致果蠅失明[20,34]。Yang和Zhang[35]對果蠅嗅覺系統的蛋白互作分析發現，果蠅SRbs 與嗅覺功能高度關聯，這些蛋白可能在嗅覺系統中參與了脂類轉運和廢棄代謝物清理。

昆蟲SNMPs 結構符合CD36 家族受體的結構特征，也具有主要由β-折疊構成的通道和位于胞外結構頂端的疏水性區域。Gomez-Diaz 等[36]以哺乳動物CD36 家族受體為模板分析果蠅SNMP1 空間結構，發現果蠅SNMP1 的胞外結構也具有1 個足以容納性信息素的通道，氨基酸定點突變阻塞這個通道后會降低果蠅對性信息素的嗅覺電位反應，而異源表達小鼠CD36 家族受體能夠恢復果蠅SNMP1突變體對性信息素的嗅覺電位反應，表明昆蟲SNMPs 可能具有與脊椎動物CD36 家族受體類似的功能。本研究預測了OsonSNMPs 胞外區域的蛋白結構，位于蛋白核心區域的β-折疊與其他二級結構一起形成了一條貫穿蛋白的通道，此外在OsonSNMP1 和OsonSNMP2 胞外結構端部均有1 個富含疏水性氨基酸殘基的α-螺旋，我們推測OsonSNMPs 與脊椎動物CD36 家族受體和其他昆蟲SNMPs 類似，能夠捕獲細胞外的疏水性氣味化合物分子，并通過蛋白內的通道將這些化合物向氣味受體傳遞。CD36 家族受體結合的配體包括各種氧化脂蛋白、乙酰化脂蛋白和各種天然脂蛋白，在CD36 存在的條件下，長鏈脂肪酸從血清蛋白或磷酸雙分子層上分離可以發生在毫秒之內[37]。在果蠅中，SNMP1 能極大提高感覺神經元對性信息素的敏感性，這一現象可能是由于SNMP1 能夠從氣味結合蛋白上卸載了氣味分子，并通過胞外結構的通道將氣味分子輸送到氣味受體進行識別[11,36,38]。

在脊椎動物嗅覺上皮細胞中分布的CD36 家族受體參與了油酸、醛類的嗅覺感受[39-41]。昆蟲CD36 家族受體也在嗅覺功能中發揮了重要作用；這些嗅覺蛋白的組織分布主要包括觸角、下顎須、下唇須等感覺器官[42-44]。沙漠蝗SgreSNMP1 和SgreSNMP2 在觸角中大量表達，組織定位發現SgreSNMP1 在感覺神經元樹突和支持細胞絨毛上分布，SgreSNMP2 只在支持細胞絨毛分布，以上組織分布情況表明示SgreSNMP1 可能參與了氣味分子的接收和嗅覺淋巴液內氣味分子清除，而SgreSNMP2 的功能僅限于嗅覺淋巴液內氣味分子清除[45-46]。在果蠅中，SNMP1 被證實定位于觸角感受器基部的感覺神經元，并參與了氣味受體對性信息素的識別過程[11,41]。本研究發現，OsonSNMP1和OsonSNMP2 在杜仲夢尼夜蛾觸角中大量表達，OsonSRb1 在雌雄蛾的觸角和口器大量表達；與嗅覺器官高度關聯的表達模式和與脊椎動物類似的蛋白結構暗示這些基因在杜仲夢尼夜蛾嗅覺系統中發揮了功能。此外，OsonSNMP1 在運動相關的組織足和翅中也大量表達。但是這些蛋白的具體嗅覺功能還有待進一步細胞定位和蛋白功能實驗來驗證。

4 結論

綜 上 ， OsonSNMP1、 OsonSNMP2 和OsonSRb1 具有脊椎動物CD36 家族受體類似的空間結構，包含2 個跨膜區域和1 個細胞外結構域；胞外結構域具有1 個主要由反向平行β-折疊構成的桶狀核心和1 個富含疏水性氨基酸殘基的α-螺旋。OsonSNMP1 和OsonSNMP2 在杜仲夢尼夜蛾觸角中大量表達，OsonSRb1 在雌雄蛾的觸角和口器大量表達。與嗅覺器官高度關聯的表達模式和與脊椎動物類似的蛋白結構表明這些基因可能在杜仲夢尼夜蛾嗅覺系統中發揮了功能。