毛竹PheMYB2R-4 的克隆與功能分析

秦子璐，何 威，王雨芳，吳 敏

(安徽農業大學林學與園林學院，安徽 合肥 230036)

毛竹（Phyllostachys edulis(Carrière) J.Houz.）是一種具有重要經濟和生態意義的非木材林產品。在毛竹生長過程中，非生物脅迫條件嚴重制約了其產量和品質[1]。近年來，毛竹基因組測序工作的完成，為從分子水平探討毛竹抗逆調控方式提供了研究依據。目前在毛竹中，已分離和鑒定出很多參與毛竹非生物脅迫反應相關的功能基因。Wu 等研究發現，毛竹中的LBD 類轉錄因子PheLBD29 的表達量被PEG、NaCl、ABA 和MeJA顯著誘導。干旱脅迫條件下，過表達PheLBD29的轉基因植株通過降低相對電解質、丙二醛和過氧化物的積累來提高可溶性糖的含量，以及改變LEA、DREB2A、RD22、ERD15、Di19和RAB18等脅迫相關基因的表達量來提高轉基因植物的耐旱性[2]。同樣毛竹中的C2H2 類轉錄因子PheDi19-8 的表達量也被PEG、NaCl 和ABA 顯著誘導，成苗期干旱脅迫條件下，轉基因株系的存活率(60.34%) 顯著高于野生型對照植株(36.7%) ；且在轉基因植株中，生物量含量及可溶性糖含量的積累，LEA、RD29A、DREB2A和RD22基因的表達量得到了提高[3]。與過表達PheLBD29基因的擬南芥 (Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.) 不同的是，過表達PheDi19-8基因的植株對ABA 并不敏感。Gao 等研究發現在水稻 (Oryza sativaL.) 中過表達Phehdz1基因也可以顯著提高植株對干旱脅迫的耐受性[4]。利用農桿菌轉化法在擬南芥中過表達毛竹 WKRY 類轉錄因子 WKRY83 和WKRY86，分別增強了轉基因植物對鹽和干旱脅迫的耐受性[5-6]。Liu 等研究發現在擬南芥和水稻中過表達毛竹 TCP 類轉錄因子PheTCP10，促進了轉基因植物葉片細胞中氣孔的關閉，減少了水分的流失，提高了對干旱脅迫的耐受性[7]；Xu 等進一步地發現，PheTCP10 通過調控BTB/TAZ基因(BT2)的表達，進而提高轉基因植物對高鹽環境的適應性[8]。 在水稻中超表達ASR 類轉錄因子PheASR2，促進了水稻植株氣孔關閉，降低了葉片失水速率，增加了抗旱性[9]。此外，毛竹中的PheC3H74、PheCPK1、PhePLATZ1、PeSNAC-1、PheTCP9等基因也被證實在植物的非生物脅迫反應中發揮著重要作用[10-14]。

從前期的研究結果，我們可以看出轉錄因子在調節毛竹非生物脅迫反應中發揮著重要作用[5-14]。MYB 轉錄因子家族是植物中最大的轉錄因子家族[15]。MYB 轉錄因子在 N 端都有一段保守的MYB 結構域，是 DNA 的結合區（DNA-binding domain）。MYB 轉錄因子的 C 端有一個轉錄激活區（transcription activation domain），通過折疊成雙親性的螺旋結構從而激活轉錄[16-17]。根據MYB 轉錄因子 N 端 R 結構（R1、R2、R3）的個數 ， 可 以 將 MYB 轉 錄 因 子 大 致 分 為 R1/R2-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB 三個亞類，其中R2R3-MYB 是植物中數目最多的一類[18]，目前已在很多物種中鑒定出與植物逆境相關的R2R3-MYB 轉錄因子。R2R3-MYB 轉錄因子主要通過兩個方面來正向或者負向地調控植物對外界逆境環境的適應性。一是通過與順式作用元件特異結合實現對逆境的調控。如枸桔 (Poncirus trifoliata(L.)Raf.) 的 PtsrMYB 蛋白能夠與ADC基因的啟動子區域的 MYBCORE 元件相結合，調控ADC 基因表達改變轉基因植物體內多胺的含量，從而調控轉基因植株的抗旱性[19]。杜梨 (Pyrus betulifoliaBunge) Raf.) 中 PbrMYB21 蛋白能夠POD、SOD和P5CS基因的啟動子結合，激活此類非生物脅迫反應基因的表達，從而調控轉基因杜梨的抗旱性[20]。Cui 等利用EMSA 實驗證明，AtMYB20能夠與PP2Cs 基因的啟動子序列中的TAACTG元件結合，進而調節植物的耐鹽性[21]。

二是R2R3-MYB 轉錄因子通過參與到多種信號通路途徑調控植物的耐旱性。大豆 (Glycine max(L.) Merr.)GmMYB84通過調節轉基因大豆中的活性氧物質（ROS）來調控主根的長度，進而提高轉基因大豆的耐旱性[22]。擬南芥中過表達AtMYB15增強了轉基因植物對 ABA 的敏感性，且與ABA 合成、信號、響應相關基因的表達模式也得到了增強，表明AtMYB15可能通過 ABA 依賴的途徑調控了植物對干旱脅迫的響應[23]。毛竹作為重要的非木材林，在毛竹的基因組中，已鑒定出114 個R2R3-MYB 轉錄因子[13]。到目前為止，毛竹R2R3-MYB 相關轉錄因子在非生物脅迫中作用的研究不多，只報道了MYB2 參與了非生物脅迫，對毛竹低溫脅迫和鹽脅迫的響應起著重要的作用[24]。然而，目前對毛竹中其它R2R3-MYB 相關轉錄因子在非生物脅迫中的作用卻知之甚少。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用毛竹種子來自于中國浙江省天目山國家級自然保護區，種植于溫室培養，光周期（光/暗） 16 h/8 h，溫度25 °C，濕度 60%。

擬南芥種子由本實驗室保存，種植于光周期（光/暗）為 16 h/8 h，溫度為（光/暗） 22 °C，濕度為 60%的溫室中培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理 對三個月大小的毛竹種苗，分別澆灌20% PEG-6000 和 200 mmoL·L-1氯化鈉溶液，同時選取生長一致的種苗分別放置在不同溫度的(42 ℃和4 ℃)培養箱中，模擬高溫和低溫處理。分別在0、1、12、24、48 和 72 h 時，在相同部位，剪取長勢相似的葉片10 片，每次 3 個生物學重復，-80 ℃保存。

對轉基因擬南芥進行擴繁至 T3 代，將消毒后的 T3 代擬南芥OE-6、OE-8、OE-9 和野生型株系種子在點鋪在MS 平板上進行萌發，且MS 平板中添加不同濃度的甘露醇。同時，將消毒后的 T3代擬南芥OE-6、OE-8 和野生型株系種子在點鋪在MS 平板上進行萌發，萌發 10 d 后選取大小一致的轉基因株系和野生型幼苗移入營養土中生長。待幼苗生長3 周時，停止供水，進行缺水干旱處理，分析轉基因植株的抗旱表型。

1.2.2 序列的獲得及進化樹的構建 毛竹PheMYB2R-4(PH01000388G0380)的氨基酸序列從(http://www.bamboogdb.org/)網站上獲取，從 phytozome (https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)網站上，下載擬南芥、玉米 (Zea maysL.)、水稻和小麥 (Triticum aestivumL.) 的氨基酸序列，并在 DNAMAN 中進行氨基酸序列比對。

1.2.3 RNA 的提取及qRT-PCR 分析 利用RNAiso Plus 試劑盒 (Takara 貨號：9 108) 根據說明書提取 RNA，利用 PrimeScript? RT Master Mix 試劑盒 (Takara 貨號：RR036A) 根據說明書反轉錄 RNA。熒光定量實驗所用引物由 Primer Express 3.0 進行設計(表1) ，NCBI 網站驗證特異性后由通用生物系統 (安徽) 有限公司合成，每對引物擴增產物長度為為 80 ～ 200 bp。使用TransStart? Green qPCR Super Mix (貨號：AQ101-01) 按照說明書實驗，使用 2-△△CT計算表達量。TIP41基因作為毛竹內參基因，Atactin2基因作為擬南芥內參基因。熒光定量引物見表1。

表1 熒光定量引物Table 1 Primer for qRT-PCR

1.2.4 轉錄活性分析 設計PheMYB2R-4 的轉錄活性引物序列，F:5'-GgaattcATGGGAAGGGCTCCATGT-3')和 R:5'-CGggatccTTACATCATCGTTACCTTCCC-3'，通過PCR 擴增獲得兩端分別帶有EcoR I 和BamH I 酶切位點的PheMYB2R-4基因片段。以 pGBKT7 為基礎載體，構建含有目的片段的重組載體，分析PheMYB2R-4的轉錄激活活性。同時設置陰性對照：pGBKT7 空載體；陽性對照：pGBKT7-53 +pGADT7-T。使用熱擊法將構建好的載體質粒轉化到農桿菌GV3101 菌株中。參照唯地生物公司的說明書 (貨號: YC1002S)，進行酵母的轉化。分別取菌液 100 μL 涂布于單缺 (SD/Trp-)和三缺(SD/Trp-/His-/Ade-/X-α-gal) 固體培養基進行培養(30 °C)，觀察分析并拍照記錄。

1.2.5 亞細胞定位分析 設計 PheMYB2R-4 的亞細 胞 定 位 引 物 序 列 ， F： 5'-GCtctagaATGGGAAGGGCTCCATGT-3'和R：5'- CGggatccCATCATCGTTACCTTCCC- 3'，通過 PCR 擴增獲得兩端分別帶有XbaI 和BamH I酶切位點的PheMYB2R-4基因片段。 以pCAMBIA-1305 為基礎載體，構建含有目的片段的重組載體，分析PheMYB2R-4 的亞細胞定位。同時設pCAMBIA-1305 空載為對照組。分別吸取50 μL pCAMBIA-1305 重組質粒、 pCAMBIA-1305 空載的農桿菌液于搖菌管中同時加入5 mL YEP、5 μL 50 mg·mL-1Kan 和5 μL 25 mg·mL-1Rif 于恒溫搖床中 28 ℃、220 r·min-1培養36 ～48 h。 然后吸取2 mL 到無菌的10 mL 無菌管中，常溫，5 000 rpm，離心5 min；棄上清，用純水將菌斑重懸，再次離心； 加入2 mL 純水，用分光光度計測OD600值，計算，將到菌液濃度調到0.8 ～ 1.0；將菌液注射到生長健康3 周的本式煙草葉片中，做好標記。黑暗培養36 ～ 48 h 左右， 用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞中的GFP 信號。

1.2.6 轉基因擬南芥的獲得 設計PheMYB2R-4 的 過 表 達 載 體 引 物 序 列 ， F:5'-GGcgtaccATGGGAAGGGCTCCATGT-3'和R：5'-GCtctagaTTACATCATCGTTACCTTCCC-3'，通過 PCR 擴增獲得兩端分別帶有KpnI 和XbaI 酶切位點的PheMYB2R-4基因片段。 以pCAMBIA-1 301 為基礎載體，構建過表達載體。將構建好的重組菌液培養至OD600值達到 0.8 ～1.0 左右，同時配置轉化 Buffer 溶液。處理液使用前還需加入表面活性劑 (Solarbio:627N021)。用轉化 Buffer 溶液懸浮離心的菌體，制備侵染溶液，然后將整個花序浸泡在侵染液中 5 min，3 ～ 4 周后果莢成熟即可收取轉基因 T0 代種子。

1.2.7 篩選轉基因植株 將 T0 代種子進行消毒清洗發芽后，均勻涂布在含有潮霉素的 MS 培養基平板上。進一步對篩選的陽性植株進行 PCR 分子檢測，提取陽性擬南芥植株基因組，并作為 PCR 擴增模板，用目的基因PheMYB2R-4序列引物擴增片段，鑒定轉基因擬南芥是否轉化成功，陰性對照為野生型擬南芥，陽性對照為含有PheMYB2R-4的農桿菌質粒。

1.2.8 生理生化指標的測定 葉片相對含水量(RWC) 和相對電導率(REL)的測定方法按照Wu 等的文獻中的報道[3,5,9]。丙二醛 (MDA) 具體測定方法按照試劑盒 (Solarbio:BC0020) 說明書進行操作。

2 結果與分析

2.1 毛竹 PheMYB2R-4 轉錄因子的克隆及序列分析

以毛竹 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，結果獲得一條約918 bp 的特異性條帶，與預期目的基因大小為基本一致(圖1A)。測序結果表明，目的片段大小918 bp，與毛竹基因組數據庫PH01000388 G0380 編碼區一致，該基因編碼一個 305 aa 的蛋白，分子量為 33.95 kD，理論等電點 pI 為 8.4，根據Hou 等對毛竹中R2R3-MYB 轉錄因子的鑒定和分析，將該基因命名為PheMYB2R-4[13]。

圖1 PheMYB2R-4 基因克隆及進化樹分析Fig. 1 PheMYB2R-4 gene cloning and phylogenetic analysis

2.2 PheMYB2R-4 的逆境處理表達分析

干旱和高鹽處理后，熒光定量結果顯示PheMYB2R-4的轉錄水平在檢測的時間點的都表現出上調狀態 (圖2)。值得注意的是，PheMYB2R-4的表達在干旱處理72 h 時是對照組CK 的36 倍(圖2A)。在高鹽處理72 h 時是對照組CK 的11 倍(圖2B)。然而在高溫處理下，處理24 h 之后，PheMYB2R-4的表達才開始上升，72 h 時是對照組CK 的3 倍 (圖2C)。低溫處理下，與對照相比，PheMYB2R-4的表達在24 h 之后才有差異(圖2D)。

圖2 PheMYB2R-4 在干旱、鹽、高溫及低溫脅迫下的基因表達Fig. 2 Relative expression of PheMYB2R-4 in response to drought, salt, high temperature and low temperature treatments

2.3 PheMYB2R-4 的分子特征分析

將構建成功的重組質粒 (p1305-35SPheMYB2R-4-GFP) 分別導入農桿菌，同時將空載作為對照 (p1305-35S-GFP)，侵染煙草瞬時表達，觀察定位。結果如3A 所示：空白對照的 GFP信號充滿整個細胞中，而實驗組(p1305-35SPheMYB2R-4-GFP) 只在核內檢測到信號，并且也與 DAPI 核定位信號相重合，說明PheMYB2R-4 是核定位蛋白。

通過 PEG/ LiAc 法將PheMYB2R-4 基因與 pGBKT7 的重組質粒，陰性對照組的空載pGBKT7 和陽性對照組 pGBKT7-53 + pGADT7-T轉化至Y2H Gold 酵母中，在SD/-Trp 單缺板，缺陷培養基 SD/-Trp 和 SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal 三缺平板上進行避光培養。結果如圖3B 所示：實驗組和對照組的酵母在單缺板 SD/-Trp 都可以正常生長，說明PheMYB2R-4 基因對酵母無毒性，可以在酵母系統中進行實驗。然后再在含有 40 μg·mL-1的 SD/-Trp/-His/-Ade 固體培養基上進行避光培養3 ～ 5 d，發現實驗組和陽性對照組酵母生長狀況良好，并且變藍色，說明 PheMYB2R-4 在酵母菌株中具有自激活活性(圖3B)。

圖3 PheMYB2R-4 的分子特征分析Fig. 3 Molecular characteristic analysis of PheMYB2R-4

2.4 過量表達PheMYB2R-4 轉基因擬南芥的表型分析

對獲得的轉基因擬南芥，提取基因組，進行PCR 克隆驗證，并篩選出表達量較高的株系進行功能分析。對 T3 代轉基因擬南芥和野生型植株種子在不同濃度的甘露醇 (0、125、200 mmoL·L-1)溶液中進行萌發，分別于3 d 和7 d 后統計萌發率。結果表明，當平板中不含有甘露醇溶液時，轉基因植株和野生型擬南芥的萌發率無明顯差異，而在含有125 mmoL·L-1和200 mmoL·L-1的甘露醇平板中，3 d 時，轉基因擬南芥的萌發率分別為32% 和8% 左右，而野生型擬南芥的萌發率分別為 18% 和4% 左右(圖4B)。7 d 時，轉基因擬南芥的萌發率分別為為 68% 和40% 左右，而野生型擬南芥的萌發率分別為 56% 和22% 左右(圖4C)。

圖4 野生型和轉基因擬南芥在甘露醇下的萌發分析Fig. 4 Germination Analysis of wild type and transgenic Arabidopsis under Mannitol treatment

選取生長時期和狀態一致的株系移栽到營養土中生長 3 周左右，對轉基因和野生型擬南芥進行干旱缺水處理。結果如圖5A 所示，在干旱處理前，轉基因植株和野生型擬南芥生長無明顯差別，在缺水處理10 d 之后，發現野生型擬南芥較轉基因植株受到更加明顯的干旱脅迫，表現為葉片卷曲嚴重，生長受阻，葉片含水量 (RWC) 明顯較低 (圖5A、B)，且野生型植株的綠葉存活率顯著低于轉基因株系 (圖5C)，表明轉基因植株耐旱性較強。

圖5 野生型和轉基因擬南芥在干旱下的表型分析Fig. 5 Phenotypic Analysis of wild type and transgenic Arabidopsis under drought treatment

同時，對干旱處理前和處理后植株進行了抗逆相關生理生化指標的測定，重點對相對電導率(REL) 以及丙二醛 (MDA) 含量進行了分析，如圖5D 和5E 所示，轉基因和野生型植株兩個所測定的生理生化指標在處理前沒有顯著差異。在干旱處理后，轉基因株系和野生型植株的相對電導率(REL) 以及丙二醛 (MDA)含量都得到增加，野生型植株上升幅度顯著高于轉基因植株，進一步說明了轉基因植株的耐旱性優于野生型。

2.5 干旱相關基因的表達分析

通過對脅迫相關基因表達的檢測發現，正常處理下的RD22(responsive to dehydration 22)、RD29A(desiccation-responsive protein 29A)、DREB2A(dehydration-responsive element binding protein 2) 和LEA(dehydrin LEA) 在所有株系中的表達水平是相似的。相反，在缺水處理3 d 下，轉基因株系中的這些基因的表達水平被顯著誘導，表明了過表達PheMYB2R-4能夠調節脅迫響應相關基因的表達，進而提高植物的耐旱性 (圖6)。

圖6 干旱相關基因的在野生型和轉基因擬南芥中干旱處理前后的表達分析Fig. 6 Expression analysis of drought-related genes in wild type and transgenic Arabidopsis before and after drought treatment.

3 討論

MYB 轉錄因子家族，其中R2R3 亞類是目前研究較為廣泛的一類MYB 轉錄因子家族。R2R3 亞類的MYB 轉錄因子在植物的非生物脅迫反應中發揮著重要作用，目前已在農作物、林木、蔬菜、花卉等物種中已鑒定出相關的功能基因[3,5,8-9]。盡管2018 年Hou 等在毛竹的基因組數據中，鑒定出114 個R2R3 亞類的MYB 轉錄因子，但是毛竹中關于R2R3 亞類的MYB 轉錄因子參與植物干旱脅迫反應的研究卻鮮有報道。

本研究從毛竹中克隆1 個 MYB 基因，該基因全長為 918 bp (圖1)，編碼 305 個氨基酸，被命名為PheMYB2R-4，屬于 MYB-R2R3 基因家族[13]。進化樹結果顯示，PheMYB2R-4與水稻中的OsMYB55親緣關系較近(圖1)。Casaretto 等研究發現，將OsMYB55基因超表達到玉米中，與對照植株相比，在干旱和高溫條件下，轉基因植株的葉綠素含量明顯較高，說明過量表達OsMYB55基因提高了轉基因植株對干旱和高溫的耐性[25]。此外在本研究中，qRT-PCR 實驗表明，PheMYB2R-4的表達被 20% PEG6000 和200 mmoL·L-1NaCl顯著誘導(圖2)。由此猜測PheMYB2R-4可能參與植物參與植物的非生物脅迫反應。為了驗證這一猜測，本研究分別開展了三個方面的工作。

首先，將PheMYB2R-4基因異源表達到擬南芥中進行功能研究。結果顯示，過表達PheMYB2R-4轉基因植物展現出了對干旱的耐受性 (圖3 和圖4)。另外，PheMYB2R-4在擬南芥中過表達對擬南芥生長發育而未產生影響，此種情況在PheDi9-8、PheCDPK1、PheC3H74、PheWRKY86等的轉擬南芥實驗中亦有報道[3,6,10-11]。

其次，干旱會損害植物的生理過程，進而會引起植株一系列的生理生化指標的改變[21]。葉片失水率 (RWC)是評價植物抗逆性的重要指標[26]。研究結果表明，在干旱條件下，轉基因PheMYB2R-4株系相比野生型植株具有更高的 RWC (圖5B)。此外，作為評估細胞膜損傷的重要指標相對電導率(REL) 和反映膜脂過氧化程度的丙二醛 (MDA) 含量[27-28]。在我們研究中，過表達PheMYB2R-4株系的 REL 和 MDA 含量明顯低于野生型，這表明轉基因株系受到更輕微的膜損傷 (圖5D 和圖5E)。這表明PheMYB2R-4通過減輕膜損傷和減少水分流失來提高植物的抗旱性。

最后，前期大量研究表明，過量表達抗逆相關的轉錄因子通常是通過改變下游相關脅迫基因的表達，來提高植物對外界環境的適應性[29-31]。在本研究中，RD22、RD29A、DREB2A和LEA，4 個已被證明主要參與干旱脅迫的基因[32-35]，干旱脅迫后在OE-6 和OE-8 中的表達量顯著高于WT (圖6)。由此推測，干旱脅迫下，PheMYB2R-4極有可能是通過調控這些干旱脅迫信號通路中關鍵基因的表達, 最終影響毛竹對干旱脅迫的耐受性，而PheMYB2R-4基因直接調控的靶基因，是后續研究的重點。

以上研究結果表明PheMYB2R-4 在植物的干旱脅迫中發揮著重要的作用，研究結果將進一步創新和豐富MYB 轉錄因子的研究理論，并為毛竹抗逆新種質的創建提供新的基因資源。

4 結論

本研究從毛竹的基因組中篩選出 1 個 R2R3-MYB 轉錄因子PheMYB2R-4，通過對PheMYB2R-4基因進行分子特性分析和功能驗證，結果顯示PheMYB2R-4基因定位在細胞核中，且在酵母中具有轉錄活性。在逆境脅迫過程中對干旱脅迫具有正調控作用，在擬南芥中過表達PheMYB2R-4可以提高轉基因擬南芥對干旱脅迫的耐受性。在干旱脅迫下，PheMYB2R-4可以提高AtRD22、AtRD29A、AtDREB2A和AtLEA在轉基因擬南芥中的表達量。