鋁脅迫下馬尾松二代家系苗生長規律與篩選

李 鵬，譚健暉，楊章旗＊，羅群鳳，凌金燕，陳 虎，陳釗銘，賈 婕

(1. 廣西壯族自治區林業科學研究院 國家林草局馬尾松工程技術研究中心 廣西馬尾松工程技術研究中心 廣西優良用材林資源培育重點實驗室，廣西 南寧 530002；2. 廣西師范大學生命科學學院，廣西 桂林 541006)

亞熱帶酸性紅壤是我國南方主要的土壤形式，其形成過程是脫硅鋁化與生物富集兩個相互矛盾過程長期作用結果[1]。脫硅富鋁是紅壤所進行的一種地球化學過程，酸鋁環境是其土壤的主要存在形式，也是植物主要脅迫因素之一[2]。當土壤pH＜4.5 強酸性時，會導致土壤中重金屬及鋁離子大量釋放、活化，極易誘發重金屬及鋁毒害[3-4]，其中以游離態Al3+的毒性最大，抑制植物生長，降低植物產量[5]。尤其是我國南方地區，59.8%為紅壤偏酸性[6]，土壤的酸化使土壤中螯合態鋁淋出，解離為游離態鋁，對植物產生毒害作用[7-8]，鋁（Al）毒成為酸性土壤中植物生長的主要制約因素。因此，明晰酸性環境下鋁脅迫對植物生長規律的影響以及篩選耐鋁脅迫的優良家系尤為重要。

鋁對植物生長的影響主要包括：一方面適量鋁能夠促進植物的生長[9-11]；另一方面，鋁含量增加時，鋁會產生植物毒性。鋁抑制了植物根尖細胞的伸長和分裂，使根的直徑較小、根系表面積減小、根變得短粗而扭曲，根毛和須根稀少，根尖膨大[12-13]。張盛楠等[14]對馬尾松（Pinus massonianaLamb.）幼苗進行鋁脅迫試驗，表明低濃度的鋁對于馬尾松的生長具有一定的促進作用，而在高濃度下，鋁會抑制馬尾松幼苗的生長。也有學者對于秋葵（Abelmoschus esculentus）[15]、杉木（Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.）[16]等幼苗進行鋁脅迫試驗，結果均表明在適量的鋁濃度范圍內，植物會呈現一定適應性，但當鋁含量過高時，則出現鋁的毒害性。此外，鋁對植物幼苗根部的毒害較大，植物根從土壤吸收水分和養分的主要部位是根尖的根毛區，其次是伸長區[17]，當這兩個部位的鋁含量過高時，會抑制對其他營養元素的吸收，其吸收功能減弱，致使植物攝取營養元素和微量元素較少， 從而影響植物的生長。

馬尾松是我國濕潤亞熱帶地區分布最廣、資源最多的針葉樹種，主要分布于南方省區，具有速生、豐產、適生性強、用途廣等優良特性，一直是南方造林的先鋒樹種[18]。南方土壤普遍偏酸性，酸性土壤中的活性鋁，是影響馬尾松林的生長，導致馬尾松大面積衰退和減產的主要原因[1]。作為南方優勢用材樹種，馬尾松在漫長的進化歷程中，孕育了豐富的遺傳多樣性資源，使得不同種源、家系對酸鋁環境的反應式樣差異較大[19]。明晰馬尾松在酸性環境中對鋁濃度變化的生長響應規律，篩選馬尾松耐鋁脅迫優良家系，提高馬尾松的耐鋁能力，已成為亟待解決的熱點問題。目前，不同種源馬尾松對酸鋁環境的適應性篩選[20]，以及酸鋁環境下馬尾松根系的分泌特性、根系分泌物對酸鋁土壤微生態及馬尾松鋁毒的調控作用[21-23]等方面已有研究，而馬尾松已進入高世代育種階段，尤其是二代家系水平下馬尾松幼苗適應酸鋁環境的變化規律，以及耐酸鋁環境優良二代家系篩選方面仍相對缺乏。因此，為探明酸性環境下鋁脅迫對馬尾松二代家系生長、根系形態變異規律影響，篩選品系優良耐鋁脅迫家系，本文以馬尾松二代種子園55 個優良家系為研究對象，采用沙培方式，開展酸性環境下不同鋁濃度馬尾松生長、表型變異規律的研究，并運用主成分分析、聚類分析等綜合評估不同家系馬尾松耐鋁能力和等級的劃分，主要研究目標是1）明晰酸鋁環境下馬尾松幼苗生長變異規律，2）篩選出馬尾松幼苗的耐鋁毒家系和敏感性家系，為馬尾松耐鋁脅迫的遺傳改良和推廣、應用提供理論基礎。

1 研究區概況

試驗在廣西壯族自治區林業科學研究院苗圃防雨大棚（108°20'32″～108°21'10″ E，22°50'22″～22°50'40″ N）進行。屬亞熱帶季風氣候，陽光充足，雨量充沛，霜少無雪，氣候溫和，夏長冬短，年平均氣溫21.6 ℃，冬季最冷的1 月平均12.8 ℃，夏季最熱的7、8 月平均28.2 ℃，年均降水量1 304.2 mm，平均濕度為80%，雨季主要集中在5—9 月，旱季主要集中在10 月—次年4 月，海拔80 m。

2 材料與方法

2.1 試驗材料與處理

試驗材料為55 個馬尾松優良家系（編號201～255），種子于2019 年10 月采自廣西國有派陽山林場國家級良種基地馬尾松二代種子園。于2020 年12 月在廣西林科院松樹良種繁育中心育苗，選取不同家系飽滿種子，清洗干凈，經滅菌后于育種盤中發芽。采用沙培的培養方式，選取0.2～1.0 mm 純石英砂，砂子先用3%稀鹽酸浸漬1 周，再用水沖洗至水無明顯的氯離子反應為止，發芽后，2021 年1 月將其轉移至裝有石英砂的無紡纖維布容器（直徑8 cm，高12 cm），每杯1 株，每個家系150 株。2021 年3 月，各家系選擇生長基本一致苗木90 株進行脅迫試驗，脅迫前幼苗分別于1 月生和1.5 月生時采用1/4 霍格蘭氏完全營養液澆灌，每杯10 mL 以維持苗木正常生長；2 月生時采用1/4 格蘭仕完全營養液澆灌，直至營養液同砂粒接觸24 h 內pH（pH=4.00 ±0.05）基本無變化為止，緩苗2 周后開始脅迫試驗（家系苗高6.12 ± 0.11 cm、地徑0.42 ± 0.05 mm）。

2.2 試驗設計

設置家系與鋁濃度2 因素完全隨機區組試驗，每個家系分別設置6 個處理，鋁濃度分別為0、0.1、0.3、0.6、1.2 和2.4 mmol·L-1，每個處理重復3 次，每個重復30 株。用氯化鋁（AlCl3）分析純控制鋁含量，根據鋁的各設計水平分別供給；用NaOH 和HCl 調整土壤pH 值，pH 維持在4.00 ± 0.05。配制不同鋁濃度的1/4 格蘭仕完全營養液，每天澆1 次10 mL，中間酌情補充水分。培養過程中每隔20 d 澆灌1 次0.05%的百里酚溶液抑制微生物活動。處理60 d 后收獲，測定各生長和根系形態指標。

2.3 測定項目及方法

脅迫處理60 d 后，用游標卡尺和鋼直尺測量每株馬尾松幼苗的地徑（精確到0.01 mm）和苗高（精確到0.01 cm）；然用自來水不斷沖洗沙杯，小心取出整株幼苗，沖洗干凈。利用霍爾德根系圖像掃描分析系統（WinRHIZO）測定總根長、表面積和體積；然后將幼苗分成根和地上部分，在105 ℃殺青5 min 再65 ℃烘干至質量恒定，測量各組分（根系和地上部分）的干物質質量。并計算高徑比（高徑比=苗高/地徑）和根冠比（根冠比=根系干質量/地上部干質量）。

2.4 數據分析與處理

2.4.1 耐鋁系數的確定 參考崔博文等[24]的方法，引入耐鋁系數公式（1），表征鋁脅迫下植物生長受限制的大小。

式中：RAlC為耐鋁系數；MVal為鋁脅迫下測定值；MVn為正常鋁脅迫下測定值。

2.4.2 耐鋁能力綜合評價和等級劃分 （1）數據標準化 運用隸屬度函數公式（2）對數據進行標準化（歸一化）處理。

式中：Ni為第i個指標的歸一化數值，RAlCi為第i個指標耐鋁系數，RAlCmax為和RAlCmin為參試家系第i個指標的最大和最小值。

（2）主成分分析與權重的確定 主成分分析是通過對指標降維方式篩選指標冗余變量及線性關系，將零散的變量進行整合處理，運用線性回歸方程進行主成分個數的確定，并計算主成分中解釋方差貢獻率，提取特征值＞1 主成分類型，進而確定主成分荷載矩陣。

權重的確定方法為：將每個指標對應的主成分荷載矩陣乘以其對應成分的方差貢獻率，再除以其綜合方差貢獻率，即為該指標的權重。

式中：Wi為第i個指標的權重， Δi為第i個指標荷載占比，Rij為主成分荷載矩陣，VCRj為第j個主成分的方差貢獻率，TVCR為特征值＞1 的主成分累積方差貢獻率。

（3）綜合評價值 采用加權隸屬度值公式，計算綜合評價值（CEV）。

式中：CEVj為第j個家系綜合評價值，Wi和Ni分別為第i個指標權重和隸屬度值。

（4）聚類分析 利用SPSS 軟件進行系統聚類分析，以綜合評價值（CEV）為指標，采用Euclidean-Complete 法計算歐式距離，將55 個家系聚類為不同耐鋁類型。

2.4.3 數據的處理 采用Excel 2016 和SPSS 20.0 軟件進行數據的運算和圖表的繪制。對不同家系和鋁濃度各指標進行雙因素方差分析（Twoway ANOVA）。采用Duncan 多重比較法檢驗比較不同鋁濃度各指標差異顯著性，顯著性水平為p＜0.05。

3 結果與分析

3.1 鋁脅迫對馬尾松幼苗地徑和苗高的影響

雙因素方差分析（圖1）顯示，不同家系和鋁濃度及其之間的交互作用對馬尾松幼苗地徑、苗高和高徑比均具有極顯著性影響（p＜0.001）。馬尾松幼苗地徑、苗高和高徑比家系變異系數為8.67%～20.63%，變異系數大小為苗高（平均18.91%）＞高徑比（平均14.65%）＞地徑（平均10.04%）。隨鋁濃度增加地徑和苗高均呈現先增加后減小的趨勢，在0.6 mmol·L-1時苗高和地徑生長量最大，分別為1.14 mm 和9.25 cm，均顯著高于0、1.2和2.4 mmol·L-1鋁濃度處理；2.4 mmol·L-1鋁濃度處理下苗高和地徑生長量最小，分別為0.85 mm和7.22 cm，且顯著低于其它處理。不同家系幼苗高徑比范圍為45.66～126.02，平均為83.36，0.6 mmol·L-1鋁濃度處理下最小為80.69，顯著低于0、1.2 和2.4 mmol·L-1鋁濃度處理。

圖1 不同鋁濃度馬尾松幼苗地徑、苗高變化及變異系數Fig. 1 Variation of ground diameter, seedling height and coefficient of variation with different aluminum concentrations of P. massoniana seedlings

3.2 鋁脅迫對馬尾松幼苗生物量的影響

雙因素方差分析（圖2）顯示，不同家系和鋁濃度及其之間的交互作用對馬尾松幼苗生物量和根冠比均具有顯著性影響（p＜0.05）。馬尾松幼苗根系生物量和根冠比家系變異較大，變化范圍為19.15%～37.29%，屬中度變異，各指標變異系數大小為根冠比（平均28.66%）＞根系生物量（平均26.75%）＞地上部分（平均6.03%）＞整株生物量（平均5.64%），表明根系是酸鋁環境下馬尾松幼苗敏感性器官。隨鋁濃度增加根系、地上部分和整株生物量均呈現先增加后減小的趨勢，在0.6 mmol·L-1時最大，平均值分別為0.091 8 g、0.702 4 g 和0.794 3 g，均顯著高于0、0.1 和2.4 mmol·L-1鋁濃度處理，而與0.3 mmol·L-1鋁濃度處理下無顯著差異；2.4 mmol·L-1鋁濃度處理下生物量最小，且顯著低于其它處理。不同鋁濃度幼苗根冠比呈現先增加后減小再增加過程，在0.6 mmol·L-1時最大為0.131 6，顯著高于0、0.1 和2.4 mmol·L-1鋁濃度處理。

圖2 不同鋁濃度馬尾松幼苗生物量變化及變異系數Fig. 2 Changes of biomass and coefficient of variation with different aluminum concentrations of P.massoniana seedlings

3.3 鋁脅迫對馬尾松幼苗根系形態的影響

雙因素方差分析（圖3）顯示，不同家系和鋁濃度對馬尾松幼苗總根長、根表面積和體積均具有顯著性影響（p＜0.05），家系和鋁濃度的交互作用對總根長和根表面積具有顯著性影響，對根體積無顯著影響。馬尾松幼苗根系形態指標變異系數比較均勻，變化范圍為21.84%～44.97%，各指標變異系數大小為根體積（40.13%）＞根表面積（29.98%）＞總根長（26.28%），均屬中度變異。隨鋁濃度增加總根長、根表面積和體積均呈現先增加后減小的趨勢，在0.6 mmol·L-1時最大，平均值分別為272.82 cm、110.19 cm2和4.92 cm3，均顯著高于0、0.1、1.2 和2.4 mmol·L-1鋁濃度處理，而與0.3 mmol·L-1鋁濃度處理下無顯著差異。不同鋁濃度幼苗根冠比呈現先增加后減小再增加過程，在0.6 mmol·L-1時最大為0.131 6，顯著高于0、0.1 和2.4 mmol·L-1鋁濃度處理。

圖3 不同鋁濃度馬尾松幼苗根系形態變化及變異系數Fig. 3 Changes of root morphological and coefficient of variation with different aluminum concentrations of P.massoniana seedlings

3.4 不同家系馬尾松耐鋁系數、隸屬度值

根據上述試驗結果，采用2.4 mmol·L-1鋁濃度處理的測定值與0.6 mmol·L-1處理下測定值的比值乘以100%作為耐鋁系數，并依據隸屬度函數計算得到55 個馬尾松二代優良家系隸屬度值（圖4）。在鋁脅迫環境下，不同家系馬尾松的耐鋁系數差別較大，其耐鋁系數因家系不同而表現較大差別，表明各指標在馬尾松耐鋁特性中所發揮的作用不盡相同，不同測定指標因家系差異所表現出的耐受性并不一致，因此，僅使用一個單一指標評價各家系的耐鋁特性是不夠的。

圖4 不同家系馬尾松耐鋁系數和隸屬度值Fig. 4 Aluminum tolerance coefficient and membership value of different families of P.massoniana

3.5 不同家系馬尾松耐鋁特性主成分分析

對10 個生長特性指標進行主成分分析，KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）統計量＝0.471，巴特利特（Bartlett）球形度檢驗F=575.048，自由度（df）=45，p＜0.001，表明適合進行主成分分析。選擇特征值＞1 的主成分有4 個，累積方差貢獻率為87.57%，這4 個主成分解釋了大部分信息（表1）。第1 主成分（PC1）方差貢獻率為30.48%，高因子荷載包括總根長、根表面積、根體積；第2 主成分（PC2，方差貢獻率為23.07%）由根生物量、地上部分生物量、根冠比組成；第3 主成分（PC3，方差貢獻率為21.87%）由苗高、地徑組成；第4 主成分（PC4，方差貢獻率為21.87%）由整株生物量組成。

表1 鋁脅迫下成分載荷矩陣與指標權重Table 1 Component loading matrix and index weight under aluminum stress

3.6 不同家系馬尾松耐鋁特性綜合評價及聚類分析

利用上述10 個指標，計算求得55 個二代馬尾松優良家系耐鋁特性綜合評價值（CEV）及排序（圖5A），其中CEV平均為36.64%，變化幅度為22.1%～63.19%，變異系數為22.51%，屬中等耐鋁變異水平。結合聚類分析（圖5B），當歐式距離為10 時將55 個二代家系按耐鋁能力的強弱被劃分為4 類，其中排名前三的家系為251、252、241，CEV平均為63.19%、60.33%、55.74%，屬強度耐鋁家系（I），占總家系的5.45%；248、248、249、201、239、253、238、202、204、234、216、211 共11 個家系，CEV變化幅度為44.1%～51.15%，屬中度耐鋁家系（II），占總家系的20%；250、246、208、243 共4 個家系（IV），CEV變化幅度為22.1%～25.85%，屬鋁敏感型家系，占總家系的7.27%；其它37 個家系CEV變化幅度為27.98%～42.51%，屬一般耐鋁家系（III），占總家系的67.28%。

圖5 不同家系馬尾松耐鋁特性綜合評價值和聚類分析譜系圖Fig. 5 Comprehensive evaluation value and cluster analysis pedigree diagram of aluminum resistance characteristics of different families of P. massoniana

4 討論

4.1 鋁脅迫下馬尾松二代家系幼苗生長規律

鋁脅迫作為亞熱帶酸性紅壤地區植物生長主要的脅迫因素之一[1]，適宜濃度鋁能夠促進植物生長，而鋁含量增加時，會產生植物毒性，抑制植物對其他營養元素的吸收，致使植物攝取營養元素和微量元素較少，從而影響植物的生長[25]。本研究中，在酸性環境下（pH=4.0）隨鋁濃度增加馬尾松幼苗地徑、苗高、生物量和根系形態指標均呈現先升后降趨勢，馬尾松適宜鋁濃度為0.3～0.6 mmol·L-1，尤其是0.6 mmol·L-1時二代馬尾松家系幼苗適應酸鋁環境的生長效應最佳。這與汪遠秀[26]、張盛楠[14]等研究結果相似，即耐鋁范圍內能夠促進馬尾松幼苗根系生長及生物量的積累。而不同研究中適宜馬尾松幼苗生長酸鋁環境并不一致，汪遠秀等[26]研究中pH=5.0 ± 0.5 條件下馬尾松適應Al3+的濃度范圍為0～0.4 mmol·L-1；紀雨薇[20]研究結果表明pH=4.0 ± 0.5 條件下馬尾松在低濃度0.2 mmol·L-1一定程度上促進馬尾松根系和莖的生長；趙志剛等[27]研究表明，當pH 低于4.5，Al3+濃度達到0.37 mmol·L-1時，即可對馬尾松芽苗的生長產生明顯的抑制作用；而本研究中所采用的酸環境為pH=4.0 ± 0.05 偏強酸性，其適宜鋁濃度為0.3～0.6 mmol·L-1，其原因可能是一方面酸性環境的改變導致馬尾松生長適應鋁濃度的差異[28-29]，另一方面，南方土壤主要偏酸性，通過林木長期環境適應性進化[30]，加之試驗材料為馬尾松二優良家系，在酸鋁環境下具有更優越耐鋁特性。

在耐鋁范圍內，適量Al3+的添加能夠增加細胞外滲透壓，維持植物根系內外的滲透壓以及促進植物對礦質等養分元素的吸收[31]，這也解釋了低鋁濃度下0～0.1 mmol·L-1處理下馬尾松幼苗生長、生物量和根系形態并未顯著增加的原因，而大量Al3+增加則會抑制植物對Mg2+和Ca2+的吸收。此外，根系生物量、總根長、根表面積和體積指標變異系數 分 別 為 ： 26.75%、 26.28%、 29.98%、40.13%，均達到中等變異水平，表明根系可能是馬尾松幼苗適應酸鋁環境敏感性器官，這與趙志剛等[27]研究結果一致，即根系對環境脅迫的反應最敏感，具有重要的生理功能，如吸收傳輸水分、合成運輸養分、固持植物體等功能[32]。

4.2 馬尾松二代家系幼苗耐鋁和敏感型家系篩選

植物生長（地徑、苗高）、生物量反應了植物的生長狀況，同時苗高、生物量等指標都具有較高的遺傳力，而根系作為環境脅迫變化的敏感型器官，可直接采用容易測定的生長和根系形態指標作為評估植物抗逆性的重要指標，進行耐性評價[33]。本研究中，馬尾松生長、生物量、根系形態指標的耐鋁系數因家系不同而表現較大差別，各指標在馬尾松耐鋁特性中所發揮的作用不盡相同，不同測定指標因家系差異所表現出的耐受性并不一致，這與崔博文等[24]研究結果相一致。因此，選擇馬尾松生長、生物量、根系形態等指標為評價指標構建酸鋁適應性評價體系。與適宜鋁濃度相比，在鋁脅迫條件下，植物相對生長量可以反映耐鋁毒能力，植物較高的相對生長量，說明鋁脅迫對它們的生長抑制程度較小，對鋁脅迫忍耐程度較高，具有較高的耐鋁毒能力[34]。通過耐鋁系數計算，并結合主成分分析和隸屬度函數加權計算得到綜合評價值，最終通過聚類分析將55 個二代馬尾松家系劃分為4 類，I 類：強度耐鋁型家系3 個：251、252、241（ 占 5.45%，CEV變幅 55.74%～63.19%）；II 類：中度耐鋁型家系11 個（占20%，CEV變幅44.1%～51.15%）；III 類：一般耐鋁型家系37 個（占67.28%，CEV變幅27.98%～42.51%）；IV 類：鋁敏感型家系4 個（占7.27%，CEV變幅27.98%～42.51%）。與紀雨薇[20]利用不同種源馬尾松幼苗進行耐鋁性家系篩選結果相比，參試家系間在耐鋁程度上具有差異，與本文結果相似。最終獲得3 個強度耐鋁型家系，11 個中度耐鋁型家系，其CEV值均在44%以上，這些耐鋁型家系可作為今后酸化嚴重和鋁含量較高的區域種植的首選家系，同時結合篩選的4 個鋁敏感型家系，對馬尾松高世代耐鋁材料選育和機制研究提供了理想材料。此外，本研究僅以馬尾松幼苗的生長表型指標作為評價依據，而未涉及植物生理生化等特性的研究，下一步將在表型指標篩選的基礎上進行生理生化特性、耐鋁脅迫抗性機制的結合分析，并與植物代謝組和轉錄組學等進行結合，從分子、生理方面揭示馬尾松優良家系的抗性機制及其分子調控過程，以期為馬尾松的分子育種和遺傳改良提供基礎，同時本研究擬為進一步開展馬尾松耐鋁環境優良家系選擇育種提供材料。

5 結論

（1）在酸性環境下（pH=4.0）隨鋁濃度增加馬尾松幼苗地徑、苗高、生物量和根系形態指標均呈現先升后降趨勢，均在0.6 mmol·L-1鋁濃度下最大，顯著高于0、2.4 mmol·L-1處理，而與0.3 mmol·L-1處理無顯著差異，表明沙培條件下馬尾松適應鋁濃度范圍為0.3～0.6 mmol·L-1。

（2）根系生物量、總根長、根表面積和體積指標變異系數分別為：26.75%、26.28%、29.98%、40.13%，均達到中等變異水平，表明根系可作為反映馬尾松幼苗適應酸鋁環境敏感性器官。

（3）55 個參試家系篩選出3 個強度耐鋁型家系，11 個中度耐鋁型家系，37 個一般耐鋁型家系，4 個鋁敏感型家系，所篩選材料對馬尾松耐鋁特性的高世代育種、遺傳改良和利用具有重要作用。