北美柵銹菌和松楊柵銹菌可視化檢測體系建立

藍 燕，農花萍，彭子嘉，陸 穎，李坤蓬，徐 勇，余仲東

(西北農林科技大學 林學院，陜西 楊凌 712100)

楊樹是楊柳科（Salicaceae Mirb.）楊屬（PopulusL.）多年生落葉喬木，因其速生成林、防風固沙、抗逆性強、木材質佳等優勢，成為我國用材林、防護林主要造林樹種之一[1]。我國楊樹栽培規模不斷擴大，但受限于栽培技術和楊樹病蟲害的日益頻發。楊樹葉銹病是一種嚴重的葉部病害，導致楊樹的生長量和材積嚴重降低，造成楊樹人工林巨大經濟損失[2]。楊樹葉銹病的病原菌多為柵銹菌屬（MelampsoraCastagne）銹菌。北美柵銹菌（Melampsora medusaeThümen.）原寄主為北美洲東部的美洲黑楊（Populus deltoidesW.Bartram ex Marshall），后逐漸傳播至世界各地，是印度、歐洲、日本等國家和地區的檢疫性有害生物[3]，也是我國最近發現的外來入侵種，危害極大，并有持續傳播的趨勢[4]。該種與我國本土流行種松楊柵銹菌（Melampsora larici-populinaKleb.）在形態、寄主譜范圍等方面高度相似，給楊樹葉銹病的檢驗檢疫帶來了實際困難，因此亟待建立一種快速準確的楊樹葉銹病檢測技術。

目前林木真菌病原檢測方法主要包括傳統檢測法和分子生物學法。傳統檢測法多為形態觀察，較為直觀但對一線檢疫人員的要求較高。如形態結構相似的同屬不同種真菌，往往需要掃描電子顯微鏡（SEM）才能實現有效辨別；同種病原菌在不同時期或不同生長條件下也會表現出不同的形態特征等。因此，對新病原菌或疑難種病原菌進行物種水平的辨別常常有困難。分子生物學法中廣泛使用的常規PCR 及以常規PCR 為基礎建立的多重PCR、實時熒光PCR 等技術特異性強，檢出率高，但依賴昂貴的儀器，耗時較長，且需要專業的技術人員進行操作[5-7]。因此，以上兩種方法很難滿足目前生產實踐中快速準確檢測的需求。

環介導等溫擴增技術（ loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi 等人在2000 年建立的一種恒溫核酸擴增技術，在恒定溫度下，利用4～6 條引物及Bst DNA 聚合酶對模板進行擴增，經30～60 min 可將微量模板擴增109倍[8-9]。LAMP 結果檢測方法多樣化，除了瓊脂糖凝膠電泳外，目前常用的方法還有濁度法、顯色法、實時熒光法等，這些方法可以實現閉管檢測，從而降低污染概率[10-11]。LAMP 具特異性好、靈敏度高、反應速度快和操作簡易便捷等特點，應用前景廣闊[12-14]，在林業病害檢測方面已有許多報道[15-16]。另外，LAMP 還廣泛應用于醫學[17-18]、農業[19-20]、食品[21-22]等行業。

本研究以北美柵銹菌和松楊柵銹菌為研究對象，根據LAMP 的反應原理，針對兩種不同銹菌的靶標序列分別設計了多組引物。經實驗初步篩選引物后，再以北美柵銹菌（M. medusae）、松楊柵銹菌（M. larici-populina）、圖拉斯叉鉤絲殼菌（Sawadaia tulasnei(Fuck.) Homma）、芍藥白粉菌（Erysiphe paeoniaeZheng＆Cheng）、梨膠銹菌（Gymnosporangium asiaticumMiyabe ex Yamada）、羊肚菌（Morchella esculenta(L.)Pers.）、 金 針 菇 （Flammulina velutipes(Curt.:Fri.) Sing）的基因組DNA 為模板進行特異性檢測，后續進行體系優化、反應條件優化、靈敏度檢測等研究，并結合羥基萘酚藍（HNB）建立LAMP-HNB 可視化檢測體系，以期為松楊柵銹菌和北美柵銹菌的快速、準確的鑒別及鑒定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試北美柵銹菌（M. medusae）、松楊柵銹菌（M. larici-populina）、羊肚菌（M. esculenta）、金針菇（F. velutipes），菌株由西北農林科技大學森林病理學實驗室保存并提供，其余參考菌株包括圖拉斯叉鉤絲殼菌（S. tulasnei）、芍藥白粉菌（E. paeoniae）、梨膠銹菌（G. asiaticum）均采自西北農林科技大學南校區內感病植株。等溫擴增試劑盒、引物均購于生工生物（上海）股份有限公司；Bst DNA 聚合酶購于NEB（北京）公司；羥基萘酚藍購于上海麥克林生化科技有限公司；dNTPs 購于寶日醫（大連）公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 CTAB 法提取真菌基因組DNA 將CTAB緩沖液置于65 ℃水浴鍋中充分裂解。向盛有樣品的離心管中加入500 μL CTAB 緩沖液，添加適量石英砂充分研磨，再加入2 μL 巰基乙醇，置于恒溫孵育器中65 ℃保溫1 h，每10 min 顛倒均勻一次。保溫結束后加入500 μL DNA 提取液（氯仿∶異戊醇=24∶1），室溫離心11 000 rpm，10 min，2 次。取上清液，加入2 倍體積無水乙醇，上下顛倒均勻，-20 ℃保存2～3 h 后取出，室溫離心11 000 rpm，10 min。棄上清液，加入75%乙醇750 μL，再室溫離心12 000 rpm，10 min，2 次，棄上清液，于超凈工作臺吹干后加入50 μL TE 緩沖液，于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 LAMP 引物設計與篩選 在NCBI 上獲取M. medusae和M. larici-populina的28SrDNA 基因序列。根據兩種菌的28srDNA 序列，利用在線LAMP 引物設計工具（PrimerExplorer V5）分別設計多組引物，以dimer 值、引物兩端自由能為依據初步選出若干組引物（每組引物包括兩條內引物：FIP、BIP，兩條外引物：F3、B3），送至生工生物（上海）股份有限公司合成。

根據研究目的，需確保引物在M. medusae與M. larici-populina之間不發生交叉反應，因此需要對引物進一步篩選。每組引物分別以M.medusae、M. larici-populina基因組DNA 為模板進行LAMP 擴增反應。參考廠家等溫擴增試劑盒說明書建立反應體系。25 μL 體系包括12.5 μL LAMP MasterMix、2 μL FIP、2 μL BIP、0.5 μL F3、0.5 μL B3、2 μL 模板DNA、0.5 μL Bst DNA 聚合酶，最后ddH2O 補至25 μL。在冰上將各組分置于PCR 管中并渦旋混勻，反應條件為65 ℃水浴60 min 后80 ℃水浴10 min。反應結束后取7 μL 產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過觀察LAMP 梯狀條帶，選出僅擴增M.medusae或M. larici-populina基因組DNA 的引物進行后續特異性檢測。

1.2.3 引物特異性檢測 在北美柵銹菌引物特異性檢測中，同時以提取的松楊柵銹菌、芍藥白粉菌、圖拉斯叉鉤絲殼菌、梨膠銹菌、羊肚菌、金針菇基因組DNA 為模板進行LAMP 擴增反應；同樣地，松楊柵銹菌引物特異性檢測中，同時以提取的北美柵銹菌及上述菌種基因組DNA 為模板進行LAMP 擴增反應；兩組試驗均以ddH2O 為空白對照。反應體系和條件同1.2.2。反應結束后取7 μL產物在1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳。通過觀察LAMP 梯狀條帶判斷LAMP 方法的特異性。

1.2.4 反應體系建立 參考NEB 公司的Bst DNA聚合酶使用說明書建立初始反應體系（表1）。

表1 初始反應體系Table 1 Initial reaction system

在冰上將各組分置于PCR 管中并渦旋混勻，反應條件為65 ℃水浴60 min 后80 ℃水浴10 min。

在初始反應體系和條件的基礎上，按表2 設置的梯度依次對Mg2＋、內外引物比例、dNTPs 進行單因素優化，同時以ddH2O 為空白對照，反應結束后取7 μL 產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據LAMP 梯狀條帶的有無以及清晰度確定最佳濃度及比例。

表2 組分梯度Table 2 component gradient

在優化后的體系中加入2 μL 羥基萘酚藍（ 2 mmol·L-1）指示LAMP 反應的結果。同時以ddH2O 為空白對照，通過目視溶液顏色，判斷是否發生反應（陽性為藍色，陰性為紫色），反應結束后取7 μL 產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察羥基萘酚藍的指示效果。

1.2.5 反應條件優化 在組分優化后的體系中加入羥基萘酚藍為顯色劑，并依次進行溫度和時間的優化。初始反應溫度為65 ℃，初始反應時間為60min。優化反應溫度時，反應時間為初始反應時間，溫度梯度設置如表3 所示；優化反應時間時，以上一步得出的優化溫度作為反應溫度，時間梯度設置如表3 所示。以ddH2O 為空白對照，篩選出顏色分化時對應的最低反應溫度和最短反應時間，從而進一步優化反應條件。

表3 條件梯度Table 3 Conditional gradient

1.2.6 靈敏度檢測M. medusae和M. laricipopulina基因組DNA 經濃度測定后進行10 倍濃度的梯度稀釋，在優化后的體系和反應條件中進行反應。同時以ddH2O 為空白對照，觀察反應后的溶液顏色以判斷最低檢測濃度。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

通過在線引物設計軟件共設計了12 組引物，經過初步篩選，得到M. medusae引物BM① 、BM② 、BM③ 、BM④以及M. larici-populina引物SY⑤ 、SY⑥ 、SY⑦ 。進一步的引物篩選結果如圖1 所示。圖1-A 顯示M. medusae的4 組引物中，BM①所屬的電泳道中僅以M. larici-populina基因組DNA 為模板進行LAMP反應時出現梯狀條帶，表明BM①無法擴增目標菌；BM②和BM③所屬的電泳道均出現了梯狀條帶，表明這兩組引物既能以M. medusae基因組DNA 為模板進行擴增，又能以M. larici-populina基因組DNA 為模板進行擴增，因此不具有特異性；BM④所屬的兩個電泳道中，僅以M. medusae基因組DNA 為模板進行LAMP 反應時出現了梯狀條帶。因此，4 組引物中只有BM④能夠特異性擴增M. medusae。圖1-B 顯示M. larici-populina的3 組引物中，SY⑤所屬的電泳道中僅以M. medusae基因組DNA 為模板進行LAMP 反應時出現梯狀條帶，表明SY⑤不能擴增目標菌；SY⑥所屬的兩個電泳道中，僅以M.larici-populina基因組DNA 為模板進行LAMP反應時出現了梯狀條帶；SY⑦所屬的兩個電泳道中均無梯狀條帶，表明SY⑦發生無效擴增；因此，3 組引物中只有SY⑥能夠特異性擴增M.larici-populina。綜上，僅BM④和SY⑥能夠有效區分M. medusae和M. larici-populina，因此可用于建立LAMP 檢測體系。二者序列如表4 所示。

圖1 供試引物篩選Fig. 1 Tested primer’s selection

表4 特異性引物序列Table 4 Specific primer sequences

2.2 引物特異性檢測

圖2-A 顯示，BM④只有以M. medusae基因組DNA 為模板進行LAMP 擴增時出現了典型的梯狀條帶，M. larici-populina、E. paeoniae、S.tulasnei等菌株以及空白對照均未出現梯狀條帶；圖2-B 顯示，SY⑥只有以M. larici-populina基因組DNA 為模板進行LAMP 擴增時出現了典型的梯狀條帶，M. medusae、E. paeoniae、S. tulasnei等菌株以及空白對照均未出現梯狀條帶。綜上，BM④和SY⑥具備特異性擴增目標菌的能力。

圖2 引物特異性檢測Fig. 2 Primer-specific detections

2.3 反應體系建立

圖3-A 第3 泳道、圖3-B 第5 泳道、圖3-C第2 泳道梯狀條帶最為清晰明亮，因此確定25 μLM. medusae體系最佳Mg2＋濃度為6 mmol·L-1，最佳內外引物比例為8：1，最佳dNTPs 濃度為1.2 mmol·L-1；圖3-D 第2 泳道、圖3-E 第4 泳道、圖3-F 第1 泳道中梯狀條帶最為清晰明亮，因此確定25 μLM. larici-populina體系最佳Mg2＋濃度為4 mmol·L-1，最佳內外引物比例為6∶1，最佳dNTPs 濃度為1 mmol·L-1。

圖3 反應體系優化Fig. 3 Reaction system optimization

圖4-A 左PCR 管中溶液呈藍色為陽性，對應圖4-B 左泳道出現典型的梯狀條帶；圖4-A 右PCR 管中溶液呈紫色為陰性，對應圖4-B 右泳道無任何條帶，顯色結果與電泳結果相互印證，不同結果顏色區分明顯。

圖4 可視化體系建立Fig. 4 Establishment of visualization system

2.4 反應條件優化

圖5-A 中1～4 號PCR 管中溶液呈明顯藍色為陽性結果，表明M. medusae體系在61 ℃、63 ℃、65 ℃、67 ℃的溫度條件下均能發生擴增反應且最低溫度為61 ℃；圖5-C 中1～4 號PCR 管中溶液呈明顯藍色為陽性結果，表明溫度為61 ℃時，M. medusae體系在30 min、40 min、50 min、60 min 的時間條件下均能充分擴增且最短時間為30 min。

圖5 反應條件優化Fig. 5 The optimization of reaction conditions

圖5-B 中1～3 號PCR 管中溶液呈明顯藍色為陽性結果，4 號PCR 管中溶液呈紫色為陰性結果，表明溫度為67 ℃時不利于M. larici-populina體系進行擴增，因此能夠保證M. larici-populina體系發生擴增的反應溫度為61 ℃、63 ℃、65 ℃，最低溫度為61 ℃；圖5-D 中1 號PCR 管中溶液呈紫色為陰性結果，2～4 號PCR 管中溶液呈明顯藍色，為陽性結果，表明在溫度為61 ℃，反應時間為30 min 時，M. larici-populina體系由于時間過短無法充分擴增而導致HNB 顯色不佳，因此能夠保證M. larici-populina體系充分反應的時間為40 min、50 min、60 min，最短時間為40 min。

最終得到體系和反應條件如表5 所示。

表5 最終體系及反應條件Table 5 Terminal optimization of reaction system and reaction conditions

2.5 靈敏度檢測

圖6-A 所示1～7 管呈現藍色為陽性，其余呈紫色為陰性，即將出現顏色分化時對應的最低濃度梯度為34 fg·μL-1。圖6-B 所示1～7 管呈現藍色為陽性，其余呈紫色為陰性，即將出現顏色分化時對應的最低濃度梯度為60 fg·μL-1。因此M. medusae反應體系靈敏度可達34 fg·μL-1，M. larici-populina反應體系靈敏度可達60 fg·μL-1。

圖6 LAMP 靈敏度檢測Fig. 6 Sensitivity detection of LAMP

3 討論

一直以來，松楊柵銹菌和北美柵銹菌引起的楊樹葉銹病困擾著楊樹產業發展，建立快速的楊樹葉銹病分子檢測方法在口岸檢疫、產地檢疫及銹病流行監測等方面具有重要意義。2019 年，陸紅艷以松楊柵銹菌HMJAU85 核糖體RNA 基因為靶序列設計了LAMP 特異性引物，在試劑盒的基礎上建立了基于鈣黃綠素-Mn2＋顯色的松楊柵銹菌可視化檢測體系，在65 ℃下反應50 min 即可觀察結果，為青楊銹病的檢測提供了重要的技術支持[23]。但在柵銹菌屬的鑒別上，特別是北美柵銹菌的鑒別上，國內外均缺乏相關研究。本研究建立了能夠相互區別的北美柵銹菌和松楊柵銹菌的LAMP 檢測體系并且可以實現對這兩種銹菌的鑒定。與陸紅艷的研究相比，本研究中LAMP 檢測的靈敏度略低，為60 fg·μL-1，但在顯色劑的選擇、反應條件、檢測成本3 個方面均有所改進。首先，鈣黃綠素作為LAMP 常用顯色劑之一，與MnCl2搭配使用，二者之間的配比要極為精細才有明顯效果，因此需要深入研究離子配比；有研究表明，Mn2＋會降低LAMP 反應效率，使Bst DNA 聚合酶的錯配率達0.8%[10,24]，本研究使用的顯色劑為羥基萘酚藍，具有顏色區分度好、配置方便，無需優化離子配比等優勢，且對LAMP 反應過程無影響；在配置體系時最后加入Mg2＋并混勻，可得到更好的顯色效果。其次，本研究將松楊柵銹菌的檢測溫度降低至61 ℃，檢測時間縮短至40 min，在反應溫度和時間上得以進一步優化，也可以降低發生非特異性擴增的概率。最后，以試劑盒為基礎建立的反應體系將導致檢測經濟成本提高，本研究通過自配試劑并探索最佳檢測體系及反應條件，在降低檢測成本的同時也保證了引物和各組分間的高效配合。

具有特異性的有效引物是建立檢測體系的關鍵。LAMP 引物設計難度較高，引物序列長，一般需要通過實驗檢驗其特異性。大多數LAMP 體系建立過程中，往往先建立好最優體系，再進行特異性檢測。若最終檢測結果表明引物無特異性，則需要重新設計引物，這會導致人力、物力及時間的浪費。因此本研究將引物特異性檢測放至建立體系之前，先用通用試劑盒建立的穩定體系對引物進行篩選及特異性檢測，若引物不具備特異性，則可以直接排除，從而提高了引物篩選效率。

LAMP 因其特異性強、靈敏度高、操作簡易而備受關注；同時，LAMP 技術也存在一定的局限性。LAMP 擴增的產物量大，如有操作不慎，極易造成氣溶膠污染，導致假陽性結果。有研究表明，建立UDG-dUTP 反應系統可有效解決氣溶膠污染問題，可嘗試在本研究建立的體系基礎上加入UDG 酶以及dUTP，以增強反應特異性[25]。為了將LAMP 檢測技術應用于現場快速檢測，本研究可以結合銹菌夏孢子快速提取DNA 技術[26]，建立更高效的楊樹葉銹病LAMP 檢測技術，為病害的檢疫和防控爭取更多的主動性。

4 結論

本研究通過環介導等溫擴增技術（LAMP）建立了特異性強、靈敏度高的可視化檢測體系，實現了北美柵銹菌和松楊柵銹菌快速、準確的鑒定及區分。本研究設計的兩組引物可特異性識別相應的靶基因序列。在體系中加入160 μM 羥基萘酚藍后可以直觀地對供試的病原菌進行鑒別，極大地克服了傳統電泳檢測的弊端，并且檢測體系靈敏度分別達到了34 fg·μL-1和60 fg·μL-1。基于本研究建立的可視化體系，在61 ℃恒溫條件下，分別反應30 min與40 min 后即可觀察結果，可達到快速檢測的目的。