楊樹灰斑病菌（Coryneum populinum Bres.）對5 種殺菌劑的敏感性

唐秀麗，楊建敏，孟志龍，石 瑛,2＊

(1. 太原師范學院生物科學與技術學院，山西 晉中 030619；2. 山西工程科技職業(yè)大學，山西 晉中 030619)

由楊棒盤孢菌（CoryneumpopulinumBres.）侵染引起的楊樹灰斑病在我國東北、華北、西北和華東地區(qū)發(fā)生普遍，尤其以幼苗和幼樹受害最重，可造成楊樹產(chǎn)量損失約16%，易感病品種損失甚至高達60%[1]。該病菌主要侵染葉片，也可侵染嫩梢和枝干。在發(fā)病初期，葉片上出現(xiàn)水漬狀斑點，逐漸擴大成褐色不規(guī)則形，后病斑中心呈灰白色，邊緣呈灰褐色，上生黑綠色霉狀物。嚴重發(fā)病時可使葉片提前脫落，苗木頂梢和嫩枝梢死亡變黑，給林業(yè)經(jīng)濟帶來巨大損失[2]。

目前，化學藥劑仍然是防治楊樹灰斑病的最主要手段，具有效果顯著、成本低廉等優(yōu)點，是使用最為廣泛的防治措施。研究發(fā)現(xiàn)，賽力散、速克靈、代森錳鋅、多菌靈和甲基托布津等多種化學藥劑對楊樹灰斑病具有一定的防治效果[3-7]。但由于化學農(nóng)藥過量和不合理的使用，病菌的抗藥性問題日益嚴重，對林業(yè)健康可持續(xù)的發(fā)展以及環(huán)境安全造成了嚴重的影響[8-9]。隨著經(jīng)濟發(fā)展方式的轉變，社會環(huán)保意識的不斷加強，低毒、高效、安全、環(huán)保的農(nóng)藥已成為我國農(nóng)林業(yè)發(fā)展的必然趨勢[10]。本文在開展楊樹灰斑病菌C.populinum菌絲生長和分生孢子萌發(fā)與溫度關系研究的基礎上，對5 種供試殺菌劑對病菌的毒力進行了試驗分析，以便為篩選出有效殺菌劑及后續(xù)開展毒理機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株： 楊棒盤孢菌（Coryneum populinum），由太原師范學院生物科學與技術學院提供。

供試藥劑：98%多菌靈（上海麥克林生化科技有限公司），97%戊唑醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），甲基托布津分析標準品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），98%咪鮮胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），98%惡醚唑（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。將上述5 種原藥配制成濃度為1 × 104μg·mL-1的母液。多菌靈、戊唑醇、惡醚唑用二甲基亞砜溶解，甲基托布津和咪鮮胺用丙酮溶解，再用無菌水將上述母液稀釋成試驗所需的系列濃度。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基和孢子懸浮液制備 PDA 培養(yǎng)基[11]：用于菌株的分離、純化、一般培養(yǎng)與保存。將1 mL 殺菌劑與9 mL 溶化后溫度降至50 ℃左右的PDA 培養(yǎng)基混勻，制備不同濃度的含藥劑PDA 培養(yǎng)基。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基[12]：用于菌株產(chǎn)生分生孢子。去皮馬鈴薯200 g，蛋白胨0.5 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃高溫滅菌20 min。

孢子懸浮液：接種C.populinum菌株到產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d（20 ℃；12 h 光照/12 h 黑暗），用解剖刀輕輕刮取菌落表面分生孢子至20 mL 離心管中，用無菌水沖洗，振蕩，混勻后調(diào)制孢子懸浮液濃度1 × 105個·mL-1。

1.2.2 顯微形態(tài)觀察 將C.populinum接種于PDA 培養(yǎng)基和產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，20 ℃（12 h 光照/12 h 黑暗）培養(yǎng)，每隔1 d 觀察記錄病原菌菌落的形狀、顏色，于第10 d 在光學顯微鏡下（Olympus BX53）觀察菌絲、分生孢子的形態(tài)及大小并拍照。

1.2.3 溫度對病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響在超凈工作臺中，用直徑0.6 cm 的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種1 個C.populinum菌餅于PDA 平板中央，然后置于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25 d（12 h 光照/12 h 黑暗），各處理重復3 次，采用十字交叉法測量菌落生長直徑，計算平均值。

用移液器吸取200 μL 孢子懸浮液于凹玻片的凹槽中，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，12 h 后觀察分生孢子萌發(fā)情況，芽管長度大于等于孢子長度一半時視為萌發(fā)，在顯微鏡下計數(shù)，共計100 個孢子，每個處理重復3 次，計算孢子萌發(fā)率[13]。孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/檢查孢子總數(shù) × 100%。

1.2.4 殺菌劑對病菌的抑菌活性測定 采用菌絲生長速率法[14]測定殺菌劑對病菌的抑菌活性。在含藥劑培養(yǎng)基平板中央接種1 個菌餅，置于20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d（12 h 光照/12 h 黑暗），采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲體生長抑制率。每處理重復3 次，以無菌水中加入相同體積的二甲基亞砜或丙酮處理作為空白對照[15]。菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.6 cm） × 100%。

采用孢子萌發(fā)法[16]測定殺菌劑對分生孢子的抑菌活性。用移液器吸取200 μL 孢子懸浮液均勻涂布于含藥劑PDA 平板上，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，12 h 后觀察孢子萌發(fā)情況。每處理重復3 次，以在平板上加等量無菌水作空白對照。孢子萌發(fā)計數(shù)同1.2.3。孢子萌發(fā)抑制率=（對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率 ×100%。以殺菌劑濃度對數(shù)值為橫坐標（x），菌絲生長或孢子萌發(fā)抑制率所對應的機率值為縱坐標（y），得到毒力回歸方程（y=ax + b），計算有效抑制中濃度（EC50 值）。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進行單因素方差分析，并采用Tukey’s 法進行差異顯著性分析。

2 結果分析

2.1 溫度對病菌菌絲體生長和分生孢子萌發(fā)的影響

在5～35 ℃條件下病菌均可生長。在不同溫度條件下，病菌菌落直徑差異明顯，其中最適宜菌絲生長溫度為20 ℃，第25 d 時菌落直徑可達4.25 cm，與其它溫度下菌落直徑差異顯著（P＜0.05）。低于或高于20 ℃，菌落直徑逐漸減小。在不同溫度條件下，分生孢子萌發(fā)率差異顯著（P＜0.05）。12 h 時，20 ℃下的分生孢子萌發(fā)率最大，為79.00%；在5 ℃、10 ℃及15 ℃時，病菌分生孢子的萌發(fā)率分別為30.33%、60.67%及66.00%；當溫度高于30 ℃時，分生孢子萌發(fā)率明顯降低，30 ℃時為23.67%，35 ℃時僅為18.33%（圖1）。

圖1 不同溫度條件下Coryneum populinum 菌落直徑和分生孢子萌發(fā)率Fig. 1 Colony diameter and conidial germination rate of Coryneum populinum under different temperature conditions

在20 ℃時，病菌在PDA 培養(yǎng)基上菌絲生長緩慢，56 d 時菌落直徑5.90 cm；菌絲體發(fā)達，表面呈絨毛狀，灰黑色，未見產(chǎn)生分生孢子盤（圖2A）。在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，5 d 左右可觀察到分生孢子；分生孢子梭形，淺褐色，多數(shù)2～3 個隔，少數(shù)4～6 個隔，頂端尖，末端鈍，中間細胞較大，孢子稍彎曲；分生孢子萌發(fā)時，多從頂端或末端（基部）生出芽管（圖2B）。30 ℃時，病菌分生孢子萌發(fā)率下降，部分分生孢子的細胞異常膨大，芽管從中間細胞萌發(fā)，芽管基部或頂端膨大（圖2C）。

圖2 Coryneum populinum 菌落、分生孢子及分生孢子萌發(fā)Fig. 2 Colony, conidia and conidial germination of Coryneum populinum

2.2 殺菌劑對病菌的抑菌活性

2.2.1 殺菌劑對病菌菌絲體生長的抑制作用 試驗結果表明，5 種供試藥劑對C.populinum均有一定的抑制作用。根據(jù)不同藥劑與病菌生長的毒力回歸方程（相關系數(shù)r＞0.95），表明試驗結果可信度較高。不同藥劑對病菌菌絲體生長的抑制效果存在顯著差異（P＜0.05），同一種藥劑在不同濃度時對菌絲體生長的抑制效果也存在差異。比較發(fā)現(xiàn)，惡醚唑?qū)Σ【亩玖ψ顝姡珽C50 值為0.004 8 μg·mL-1； 戊唑醇次之， EC50 值為0.024 μg·mL-1；多菌靈和咪鮮胺的EC50 值分別為0.047、0.25 μg·mL-1；甲基托布津的毒力相對較弱，EC50 值為0.49 μg·mL-1（表1）。

2.2.2 殺菌劑對病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用試驗結果表明，5 種供試藥劑對病菌分生孢子萌發(fā)具有不同程度的抑制作用，同一種藥劑對分生孢子萌發(fā)的抑制率隨藥劑濃度的增加而增大。根據(jù)不同藥劑對分生孢子萌發(fā)抑制率的毒力回歸方程（相關系數(shù)r＞0.96），表明試驗結果可信度較高。惡醚唑?qū)Σ【稚咦用劝l(fā)的抑制作用最強，EC50值最小，為85.07 μg·mL-1；咪鮮胺、甲基托布津及多菌靈的EC50 值分別為101.23、123.28 和254.80 μg·mL-1；戊唑醇對分生孢子萌發(fā)的抑制作用最差，EC50 值為327.78 μg·mL-1（表2）。

表2 5 種殺菌劑對Coryneum populinum 分生孢子萌發(fā)的抑制效果Table 2 lnhibitory effect of five fungicides on conidial germination of Coryneum populinum

2.2.3 惡醚唑?qū)Σ【z體生長和分生孢子萌發(fā)影響的顯微形態(tài)觀察 與對照相比，添加惡醚唑使C.populinum菌落生長緩慢，菌絲體生長明顯受到抑制。隨著惡醚唑濃度升高，C.populinum菌落生長直徑逐漸減小，藥劑對菌絲體生長的抑制率逐漸增大。如惡醚唑0.000 5 μg·mL-1，菌落直徑為1.42 cm，抑制率27.9%；0.01 μg·mL-1時，菌落直徑為1.08 cm，抑制率57.3%；0.1 μg·mL-1時，菌落直徑為0.88 cm，抑制率73.9%（圖3）。

圖3 不同濃度惡醚唑?qū)oryneum populinum 菌落生長的影響（10 d）Fig. 3 Effects of different concentrations of Difenoconazole on colony growth of Coryneum populinum (10 d)

對照中C.populinum菌絲生長粗細均勻，表面光滑，分支正常，產(chǎn)孢正常，芽管從分生孢子頂端或者末端（基部）正常萌發(fā)。經(jīng)惡醚唑作用后，C.populinum菌絲表面變得粗糙、分支處膨大，大多數(shù)分生孢子萌發(fā)異常，產(chǎn)生的芽管較短，尖端膨大（圖4）。

圖4 惡醚唑（0.000 5 μg·mL-1）作用條件下Coryneum populinum 菌絲體生長及分生孢子萌發(fā)的顯微形態(tài)觀察Fig. 4 Microscopic observation of mycelial growth and conidial germination of Coryneum populinum after treatment with 0.000 5 μg·mL-1 Difenoconazole

3 討論

相比大多數(shù)植物病原菌的最適生長溫度為25℃左右[17-19]，楊樹灰斑病菌的最適生長溫度偏低。高溫條件下，C.populinum菌絲體生長極其緩慢，多數(shù)分生孢子不萌發(fā)或者萌發(fā)異常，與其他植物病原真菌生長特性相似[20-21]。不同殺菌劑對C.populinum菌絲體生長的抑制效果存在明顯差異，惡醚唑、戊唑醇及多菌靈這3 種藥劑的抑制作用較強，尤其惡醚唑的抑菌活性最高，EC50 值為0.004 8 μg·mL-1，而甲基托布津EC50 為0.49 μg·mL-1，二者抑菌活性相差近100 倍。由此可見，不同殺菌劑對楊樹灰斑病菌菌絲體生長的抑制作用具有一定的選擇性。惡醚唑、咪鮮胺及甲基托布津?qū). populinum分生孢子萌發(fā)的毒力較強，尤其惡醚唑的抑制作用最強，EC50 值為85.07 μg·mL-1。綜上，惡醚唑?qū).populinum菌絲體生長和分生孢子萌發(fā)均具有很強的抑制效果，在病菌侵染前期或發(fā)病初期使用可以有效控制病害的發(fā)生和蔓延。但應注意的是，在病害管理過程中，殺菌劑的使用需兼顧防治效益和抗性治理[10]，如低濃度的惡醚唑（0.000 5 μg·mL-1）和多菌靈（0.04 μg·mL-1）對C.populinum的抑制效果不理想，可以進一步考慮藥劑復配，延緩抗藥性的產(chǎn)生[22-23]。

室內(nèi)毒力測定試驗可以快速和有效分析殺菌劑對病原菌的抑菌效果，是篩選高效殺菌劑的重要依據(jù)[24]。本研究所選用的5 種藥劑均為廣譜性殺菌劑，其中多菌靈和甲基托布津?qū)俦讲⑦溥蝾悮⒕鷦?，是果蔬等多種作物病害防治中應用最廣泛的殺菌劑，這兩種殺菌劑的作用機制是通過干擾菌體內(nèi)DNA 的合成，從而影響細胞分裂，阻礙致病菌增殖[25-26]。戊唑醇、咪鮮胺及惡醚唑?qū)儆阽薮济摷谆种苿╊悮⒕鷦?，具有高效性和廣譜性等特點，對大部分子囊菌和擔子菌具有抑制作用，廣泛應用于多種作物病害防治[27-28]。甾醇脫甲基抑制劑類殺菌劑對C.populinum的抑制效果較好，雖然戊唑醇對病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用偏低，但對菌絲生長的抑制作用較強，其原因還未明確[29]。趙華等[30]研究發(fā)現(xiàn)戊唑醇對Marssonina mali孢子萌發(fā)的抑制作用強于惡醚唑，這與本研究結果不同，說明殺菌劑對病菌的抑制效果具有選擇性。本試驗測定了5 種殺菌劑原藥對C.populinum的室內(nèi)毒力，與成品制劑相比，更能明確病菌對殺菌劑本身的敏感性，排除了制劑加工中的填料和助劑對測定結果產(chǎn)生的影響[31]。

惡醚唑作用C.populinum后導致其菌絲表面粗糙、分支處膨大，引起分生孢子兩端細胞腫脹，但不萌發(fā)芽管，或者芽管從分生孢子中間細胞異常萌發(fā)，推斷該藥劑能夠有效阻止C.populinum侵入寄主組織中和在組織中擴展。該研究結果與惡醚唑?qū)scochyta caulina分生孢子萌發(fā)的抑制作用相似[32]。有關惡醚唑?qū).populinum的抑制作用機制還有待進一步研究。本研究僅在室內(nèi)測定了5 種殺菌劑對C.populinum菌絲體生長和分生孢子萌發(fā)的毒性，但對在田間的試驗效果還有待于進一步分析。

4 結論

楊樹灰斑病菌C.populinum在5～35 ℃范圍內(nèi)均可生長，最適生長溫度為20 ℃，低于或高于最適溫度，菌落生長緩慢。30 ℃條件下，多數(shù)分生孢子不萌發(fā)或者萌發(fā)異常。惡醚唑?qū)Σ【z生長及分生孢子萌發(fā)的抑制作用最強。0.000 5 μg·mL-1惡醚唑作用后，C.populinum菌絲表面粗糙、分支處膨大，分生孢子形態(tài)異常，出現(xiàn)芽管分支、膨大或不伸長等畸形特征。