香樟葉斑病病原菌的鑒定、菌絲生長速率及防治藥劑篩選研究

馬萬里，劉 露，湯子萱，劉 卓，鐘繼芝，尹福強,2＊，劉 銘,2＊

(1. 重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 萬州， 404120；2. 三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 萬州，404120；3. 重慶三峽職業(yè)學院農林科技學院，重慶 萬州， 404155)

香樟[Cinnamomum camphora(L.) Presl]又名烏樟、芳樟、樟木等，是樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum）常綠高大喬木，主要種植于長江以南地區(qū)，是我國南方重要經(jīng)濟和園林樹種[1-2]。香樟中富含的芳樟醇是世界上應用最廣、用量最大的香料[3]，所含的精油是植物源殺蚜蟲劑之一[4]，石油醚提取物能夠有效抑制草莓灰霉菌（Botrytis cinerea）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum），茄鏈格孢病菌（Alternaria solani）等真菌[5-6]。

香樟的病害主要有囊孢殼菌（Physalosporaspp.）和莖點霉（Phomaspp.）引起的潰瘍病[7]、Capnodiumspp.引起的煤污病、擬盤多毛孢（Pestalotiopsisspp.）引起的枯枝病、炭疽菌（Colletotrichumspp.）引起的炭疽病等。對于炭疽病，葛建明等人[8]通過形態(tài)學鑒定，將上海市芳香樟炭疽病確定為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides），但未進行分子鑒定。徐明珠等人[9]鑒定出荊州市香樟炭疽病病原菌為果生炭疽菌（C. fructicola）和暹羅炭疽菌（C. siamense）。炭疽菌中存在著許多復合種，且復合種種類孢子形態(tài)和培養(yǎng)特性差異不大、一種炭疽菌不同培養(yǎng)條件下孢子形態(tài)也有差異，如C. alienum和C. gloeosporioides，僅通過孢子形態(tài)和單基因序列難以鑒定其種類[10-11]，近年研究結果表明，聯(lián)合mating-type protein(MAT1-2)序列進行多基因聯(lián)合分析能夠更有效區(qū)分膠孢炭疽復合種[12-14]，如Liu 等人[15]應用ApMat聯(lián)合分析將山茶炭疽病的膠孢炭疽復合種（C.gloeosporioides）區(qū)分開；傅敏等人[16]利用分生孢子、剛毛、附著胞形態(tài)大小聯(lián)合多基因序列分析，將梨樹炭疽病病原（Colletotrichumspp.）種類區(qū)分開。本研究首次結合炭疽菌孢子、剛毛、附著胞等形態(tài)和ApMat聯(lián)合的多基因序列分析鑒定引起萬州香樟葉斑病的病原菌種類，并選用5 種化學農藥和5 種生物農藥進行室內毒力測定，旨在篩選出低毒低殘留的殺菌劑，為深入研究香樟葉斑病的發(fā)病規(guī)律和科學防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2021 年9 月從重慶市萬州區(qū)百安壩街道采集具有典型發(fā)病癥狀的葉片樣本，并帶回實驗室觀察并記錄發(fā)病情況，進一步對樣本進行分離純化。

試驗試劑：DNA 提取試劑盒（天根生化，DP305）、PCR Master Mix(2X)（ 天根生化，K1071）、ddH2O（天根生化，R0581），擴增上下游引物序列如表1 所示。根據(jù)《植病研究方法》[17]和《植物病理學實驗技術》[18]制備試驗所需培養(yǎng)基。供試殺菌劑名稱、生產廠家及所用濃度如表2 所示。

表1 PCR 擴增所用引物及引物序列Table 1 Primers for molecular identification

表2 化學和生物殺菌劑及相關濃度梯度Table 2 Chemical fungicides, biological fungicides and relevant concentrations

1.2 病原菌的分離與純化

從有典型癥狀的香樟葉片上切下3 mm × 5 mm的葉片樣品若干，依次用75%的乙醇浸漬30 s、5%次氯酸鈉3 min、無菌水沖洗3 次，在無菌濾紙上去除水分，最后將葉片樣本接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上。將分離后的菌株在25 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)3～5 d，觀察分離結果，純化后保存菌株待鑒定。

1.3 病原菌的致病性測定

采用兩種方法對代表菌株ZT-1 進行致病性測定，若葉片有發(fā)病特征，隨即將發(fā)病病菌再次進行分離純化，經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定后若符合第一次分離鑒定結果，則完成其致病性檢驗。

1.3.1 離體葉片接種 用無菌解剖針沿葉脈兩側對稱刺入，將直徑約為5 mm 的菌餅和無菌瓊脂塊分別接種到葉脈兩側，用保鮮膜對接種部位纏繞處理，重復3 次，接種后的植株在自然狀態(tài)下，保持相對濕度在80%～90%，觀察并記錄其發(fā)病情況。

1.3.2 活體植株接種 取健康的香樟植株，經(jīng)無菌處理后， 將含有55%甘油的1.0 × 107CFU·mL-1孢子懸浮液用無菌筆刷均勻涂抹于香樟葉片背面[17,22]，每片接種100 μL 病原菌孢子懸浮液，重復3 次，套袋保濕后置于室溫培養(yǎng)，以接種55%甘油的健康植株作為對照，每天觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)鑒定 將純化后的菌株在PDA 培養(yǎng)基上以25 ℃培養(yǎng)，期間觀察記錄菌落和菌絲的著生狀況及形態(tài)特征。在顯微鏡下隨機選取100 個孢子測量長度、寬度；配置75%的無菌PDA 培養(yǎng)基，并將孢子接種于滴加PDA 的凹玻片上[17]，保濕培養(yǎng)，觀察孢子萌發(fā)及附著胞發(fā)展狀況，并拍照。

1.4.2 分子系統(tǒng)學技術鑒定 菌株經(jīng)培養(yǎng)后收集菌絲體，利用植物基因組DNA 提取試劑盒對代表菌株ZT-1 和ZT-5 的DNA 進行提取。使用引物ITS/ITS4、 T1/B-tub2、 GDF/GDR、 ApF2/ApF6 對ZT-1 和ZT-5 的核糖體轉錄間隔區(qū)序列（rDNAITS）、β-微管蛋白（beta-tubulin）、甘油醛3-磷酸 脫 氫 酶 （ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、配偶蛋白交配型（Apn2-Mat1-2 intergenic spacer and partial mating-type protein）基因進行擴增。PCR 擴增反應體系均為40 μL，其中2 ×Taq Master Mix20 μL、10 μmol·L-1上下游引物各1.6 μL、DNA 模板3.2 μL，ddH2O 補足至40 μL，PCR 反應程序如表3。擴增后經(jīng)1%的瓊脂凝膠電泳檢測，將剩下30 μL 反應物送往上海生工生物工程（成都）股份有限公司進行測序，將測序所得結果通過NCBI 進行Blast 比對，在PhyloSuite 軟件中按照ITS-tub2-GAPDH-ApMat順序串聯(lián)，通過MEGA11.0 軟件的最大似然法（Maximum likelihood）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復值設置1 000 次，建樹所用序列登錄號如表4。

表3 基因PCR 擴增反應程序Table 3 Parameter for genes PCR reaction procedure

表4 建樹所用登陸號Table 4 GenBank accession numbers used in the phylogenetic tree

1.5 菌絲生長速率測定

以不同培養(yǎng)基、溫度、光照、pH、碳源、氮源為變量，將直徑為5 mm 的菌餅接種于供試培養(yǎng)基平板（9 cm）的中央，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，研究不同培養(yǎng)條件對代表菌株ZT-1 菌絲生長速率的影響。

分別設置10、15、20、25、28、30、37 ℃共7 個溫度梯度；供試培養(yǎng)基分別為燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（OMA）、玉米淀粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、查氏培養(yǎng)基（Czapek）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；用1 mol·L-1的NaCl 和1 mol · L-1的NaOH 調節(jié)pH 值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 共5 個梯度；光照條件設置全光照、全黑暗、光暗交替（12 h 光照/12 h 黑暗）3 個處理；將查氏培養(yǎng)基中的蔗糖用等量替換的方法換成可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麥芽糖，制成不同碳源培養(yǎng)基，以不含碳源培養(yǎng)基作為對照；將查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉用等量替換的方法換成尿素、甘氨酸、氨水、硫酸銨，制成不同氮源培養(yǎng)基，以不含氮源培養(yǎng)基作為對照。

試驗中除不同溫度對菌絲生長的影響外，其余培養(yǎng)條件均為25 ℃、光暗交替（12 h 光照/12 h 黑暗）；除不同培養(yǎng)基和碳氮源對菌絲生長的影響外，其余供試培養(yǎng)基均為PDA 培養(yǎng)基。試驗中接種所用菌塊直徑均為5 mm，每個處理重復3 次。從第5 d 開始觀察培養(yǎng)基中菌落的生長情況，采用“十字交叉法”測量菌落平均直徑，直到對照長滿9 cm 培養(yǎng)皿結束，按照菌絲生長速率=（處理菌落直徑-5/2 × 培養(yǎng)天數(shù)） × 100% 計算其菌絲生長速率，利用Excel 2014 和spass 27.0 分析、處理數(shù)據(jù)。

1.6 供試殺菌劑的室內毒力測定

采用菌絲生長速率法測定不同殺菌劑對香樟炭疽病病原菌的抑制效果。先用無菌水將各藥劑配制成母液，再用無菌水按表3 所示濃度配制成5 個濃度梯度，將直徑為5 mm 菌餅移入含藥培養(yǎng)基平板（9 cm）中央，以含有無菌水的PDA 培養(yǎng)基做對照組，每個濃度梯度和對照組均設3 次重復。25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)3 d 后，用“十字交叉法”[18]測量每個菌落的直徑，按照菌落生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑/對照菌落直徑-5） × 100% 計算抑菌率。

利用Excel 2014 和SPSS 27.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理。以各殺菌劑濃度的對數(shù)為橫坐標（x），抑菌率的幾率值為縱坐標（y），求出各殺菌劑對香樟炭疽菌株的毒力回歸方程、有效抑制中濃度（EC50值）和相關系數(shù)（r2）。EC50越小，表明該殺菌劑對香樟炭疽病菌的抑制作用越強，用藥越安全，反之越弱。相關系數(shù)r2表示抑菌率與藥劑濃度之間呈正相關性的密切程度。

2 結果與分析

2.1 病原物的分離結果

本研究共分離出18 個培養(yǎng)性狀相同的菌落，初步鑒定為炭疽屬（Colletotrichumspp.）真菌，經(jīng)致病性測定，發(fā)現(xiàn)ZT-1 致病力最強，以優(yōu)勢菌株ZT-1 進行菌絲生長速率測定和室內毒力測定的研究，用代表菌株ZT-1 和ZT-5 進行多基因聯(lián)合分析。

該病原菌最先危害香樟老葉，后期逐漸向新葉擴展，其發(fā)病率為20%～35%，病情指數(shù)在20～25，發(fā)病初期葉片上呈現(xiàn)黃褐色的斑點，斑點大小通常1～2 mm，發(fā)病嚴重時小斑點擴大進而融合成不規(guī)則紫褐色或灰褐色壞死斑點(圖1A，1B)。

圖1 香樟葉斑病病葉癥狀和病原菌培養(yǎng)特性及致病性測定Fig. 1 Symptoms of C. camphora leaf spot disease, and pathogen culture characteristics and pathogenicity test

2.2 致病性測定

2.2.1 離體葉片接種 健康葉片接種菌餅5 d 后開始發(fā)病，發(fā)病部位呈灰褐色，病斑大小5～6 mm，而接種PDA 瓊脂塊的一側僅表現(xiàn)刺傷（圖1J）。

2.2.2 活體植株接種 健康的植株涂抹上菌懸液3 d后，在葉片表面出現(xiàn)多個紫褐色的病斑（圖1K），7 d 后葉片形成黑褐色病斑，而對照植株未曾發(fā)?。▓D1L）。

根據(jù)柯赫氏法則，對發(fā)病部位組織病原物進行再分離、純化和鑒定，分離物形態(tài)特征與原接種菌株一致，在無菌PDA 培養(yǎng)基塊的葉片中沒有分離到相關致病菌，因此，確定ZT-1 菌株為重慶萬州地區(qū)香樟葉斑病的致病菌。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定 菌株ZT-1 和ZT-5 的培養(yǎng)性狀基本相同，在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 菌落中央呈現(xiàn)灰褐色（圖1E），邊緣灰白色，7 d 后菌落中央形成橘紅色的孢子堆（圖1F），在體式顯微鏡下觀察孢子堆為乳突狀（圖1G），大小在0.2～0.8 mm，將孢子堆用無菌接種針刮下，在顯微鏡下觀察到有分生孢子盤（圖1H）和剛毛（圖1I），孢子盤大小為0.24～0.56 mm，剛毛直立、無隔膜，大小為(128.3～167.6) μm × (2.8～3.6) μm，分生孢子呈長橢圓形、兩端鈍圓、透明無色、為獨立的單胞（圖1C），測量其孢子大小為(9.7～18.6) μm ×(4.2～6.0) μm，附著胞水滴狀（圖1D），大小為(3.8～6.5) μm × (4.0～5.2) μm，初步鑒定為炭疽菌屬真菌，但具體種類還需進一步確定。

2.3.2 分子系統(tǒng)學技術鑒定 用最大似然法構建的進化樹如圖2 所示，建樹所用登錄號如表4，多基因分析結果表明菌株ZT-1 和ZT-5 與Colletotrichum gloeosporioides聚在一支，支持率為100%，將測序結果提交至NCBI/GenBank 獲得登錄號。結合形態(tài)學鑒定結果，將引起萬州區(qū)香樟葉斑病病原菌鑒定為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

圖2 基于 rDNA-lTS 序列和 tub2、G3PDH、ApMat 構建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree combined with rDNA lTS sequence, tub2, G3PDH, and ApMat genes

2.4 菌絲生長速率測定

2.4.1 溫度對菌絲生長的影響C. gloeosporioides在20 ℃以下生長緩慢，25～30 ℃條件下菌絲生長較快， 28 ℃培養(yǎng)5 d 后菌落直徑達78.33 mm，37 ℃時菌絲的生長明顯受到了抑制，菌落直徑僅有25.67 mm，表明15 ℃以下及37 ℃以上均能抑制菌絲的生長(圖3A)。

圖3 不同培養(yǎng)條件對病原菌菌絲生長的影響Fig. 3 Effects of different culture conditions on mycelium growth of C. gloeosporioides

2.4.2 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響C. gloeosporioides在PDA 培養(yǎng)基上生長最快，25 ℃培養(yǎng)5 d 后菌落直徑達80.55 mm，其次為Czapek、OMA 培養(yǎng)基、CMA 培養(yǎng)基，最慢的是PSA 培養(yǎng)基，菌落直徑僅有51.83 mm (圖3B)。

2.4.3 pH 對菌絲生長的影響C. gloeosporioides在pH=6.0 時菌落直徑最大，達到68.33 mm，當pH 由6.0 逐漸上升到9.0 時，菌落生長受到抑制，pH=9.0 時菌落直徑僅有56.00 mm，由此表明弱酸性條件有利于菌絲的生長，而弱堿性條件抑制菌絲的生長(圖3C)。

2.4.4 光照條件對菌絲生長的影響C. gloeosporioides在不同光照處理下存在顯著差異，黑暗條件下菌絲長得最快，菌落直徑為61.33 mm，其次是光暗交替，而全光照菌絲生長最慢(圖3D)。

2.4.5 碳源對菌絲生長的影響C. gloeosporioides在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中生長最好，菌落直徑可達70.67 mm，其次是麥芽糖、查氏碳、可溶性淀粉，最差的是乳糖，菌落直徑僅有49.67 mm(圖3E)。

2.4.6 氮源對菌絲生長的影響C. gloeosporioides在不同氮源中存在顯著差異，以甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基生長得最好，菌落直徑可達81.83 mm，其次是查氏氮、硫酸銨、尿素，最差的為氨水，菌落直徑僅有8.03 mm (圖3F)。

2.5 供試藥劑對病原菌的毒力測定

2.5.1 化學殺菌劑的毒力測定 5 種化學殺菌劑的EC50值由大到小依次為46%氫氧化銅WG＞50%甲基硫菌靈WP＞80%代森錳鋅WP＞40%百菌清SC＞15%三唑酮WP。其中80%代森錳鋅WP、40%百菌清SC、15%三唑酮WP 的EC50均小于10 μg·mL-1，說明香樟炭疽病對這3 種殺菌劑的敏感性極高，是化學防治香樟炭疽病的良好農藥，其中15%三唑酮WP 的防治效果最好，如表5。

表5 殺菌劑的毒力測定Table 5 Toxicity tests of fungicides

2.5.2 生物殺菌劑的毒力測定 5 種生物殺菌劑的EC50值由大到小依次為6%春雷霉素WP＞10%多抗霉素WP＞3%中生菌素WP＞0.3%四霉素AS＞1%蛇床子素EW。其中1%蛇床子素EW、3%中生菌素WP、0.3%四霉素AS 的EC50均小于10 μg·mL-1，說明香樟炭疽病菌對這3 種生物殺菌劑極為敏感；1%蛇床子素EW 是生物防治香樟炭疽病的良好生物農藥，如表5。

3 討論

本研究中香樟葉斑病癥狀與荊州、上海和福建省三明市發(fā)現(xiàn)的基本相同，引起荊州香樟葉斑病病原菌為果生炭疽（C. fructicola）和暹羅刺盤孢（C. siamense）[9]，引起上海和福建三明市香樟炭疽病的病原菌為C. gloeosporioides[8,34]，但上海香樟炭疽病與福建三明市僅進行了形態(tài)鑒定，并未進行分子鑒定，本研究經(jīng)形態(tài)學結合多基因序列分析進一步證實了膠胞炭疽菌（C. gloeosporioides）可以引起香樟炭疽病；本研究分離出的病原菌最適培養(yǎng)基和pH 與上海和福建省三明市炭疽病病原菌基本相同，但在黑暗條件、氮源為甘氨酸、28 ℃有利于膠胞炭疽菌（C. gloeosporioides）菌絲生長，這可能與地域差異及重慶市高山環(huán)境有關。

炭疽菌是一種高等真菌，寄主范圍廣泛，具有種類多、變異快等特點[35]，特別是其復合種鑒定一直是病原菌分類的難題，僅通過形態(tài)特征和單基因分析難以準確鑒定，膠孢炭疽復合群是炭疽菌中最為特殊的一類，可分為26 個復合種，且復合種種內孢子形態(tài)差異較小，必須結合其剛毛、附著胞、載孢體、孢子盤等形態(tài)，并聯(lián)合ApMat的多基因序列對其復合種進行鑒定，結果更為準確。本研究是首次結合這些形態(tài)特征和基于ApMat的多基因進行鑒定。生產上其防治主要以化學防治為主，但長期使用化學農藥，極易產生抗藥性，影響防治效果；與化學農藥相比，生物農藥具有低毒、低殘留、選擇性強、不易產生抗藥性等優(yōu)點[36]，本研究用了5 種化學殺菌劑和5 種生物殺菌劑對C.gloeosporioides的室內毒力進行測定，發(fā)現(xiàn)15%三唑酮WP 和1%蛇床子素EW 的抑菌效果最好，其EC50值均小于10 μg·mL-1，三唑酮是防治炭疽病時常用的化學殺菌劑，抑制菌絲生長效果優(yōu)于抑制孢子形成，具有廣譜性、低毒性、低殘留、多作用位點等特性；蛇床子素是一種植物源農藥，通過抑制真菌細胞壁生長來抑制菌絲生長，具有環(huán)保、不污染環(huán)境、不傷害天敵、不易誘發(fā)抗藥性等優(yōu)點[37]。由于植物病害發(fā)生不僅與病原、寄主相關，還與環(huán)境條件有關，田間防治環(huán)境復雜，室內藥劑篩選結果可能與田間防治效果存在差異，因此后續(xù)研究可進行田間防效試驗，進一步探究殺菌劑對病原菌孢子的影響。

4 結論

本研究通過形態(tài)學和多基因序列分析表明膠孢炭疽（C. gloeosporioides）是引起香樟葉斑病的病原菌，并通過致病性驗證了致病菌。通過菌絲生長速率法確定28 ℃、PDA 培養(yǎng)基、碳源為葡萄糖、氮源為甘氨酸、弱酸和黑暗的條件下有利于膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）菌絲生長，15%三唑酮可濕性粉劑可作為防治香樟炭疽病的殺菌劑。