曲克蘆丁對帕金森病大鼠多巴胺能神經元損傷及MAPK/NF-κB信號通路的影響

羅常月,屠淑敏,焦 鵬,申 霖,趙春艷,范層層

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種老年人常見的中樞神經系統退行性疾病,發病隱匿,病情呈進展性加重,主要病理表現為靜息性顫抖、動作僵硬遲緩、行走入睡困難等,嚴重威脅人類健康[1]。PD發病機制復雜,有研究表明,神經損傷及腦黑質區多巴胺能神經元的病變壞死與凋亡是PD的主要病理表現[2]。氧化應激反應是導致多巴胺能神經元壞死的病理機制之一[3]。機體受損后體內氧自由基大量釋放,引起超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)表達下調,丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量上升,刺激細胞釋放促炎因子,導致炎癥反應發生,引起神經元凋亡[4-5]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路是機體重要的氧化應激與炎癥反應調節通路[6]。有研究表明,c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路參與調控細胞凋亡、纖維化反應[7]。目前臨床治療PD的藥物如多巴絲肼片等左旋多巴制劑可一定程度控制癥狀,易造成腸胃不適及血壓降低等不良反應[8]。曲克蘆丁是一種半合成的黃酮類化合物,具有黃酮類化合物抗炎、抗氧化及抗凋亡的作用,由于具有抵抗血小板聚集的作用,臨床上常用于心腦血管系統疾病的治療[9-10]。本研究通過建立PD大鼠模型,探討曲克蘆丁對PD大鼠多巴胺能神經元損傷的保護作用及MAPK/NF-κB信號通路在此過程中的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠,6周齡,體質量200～220 g,購自杭州艾森醫藥研究有限公司,動物生產許可證號為SYXK(浙)2019-0019。飼養條件:溫度22～25 ℃,濕度40%～45%,12 h晝夜交替,自由攝食飲水,適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 實驗藥物與試劑

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶鹽酸鹽(MPTP,YT1465)購自北京伊塔生物技術有限公司;多巴絲肼片(C14202006866)購自上海羅氏制藥有限公司;曲克蘆丁(SC11989)購自北京凱詩源生物科技有限公司;SOD(A001-3-2)、GSH-Px(A005-1-2)、MDA(A003-1-2)試劑盒及白細胞介素(IL)-6(H007-1-1)、IL-1β(H002)酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(G1120)、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)染色試劑盒(T2190)、RIPA高效蛋白裂解液(R0010)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(PC0020)、3,3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(DA1015)均購自北京索萊寶生物技術有限公司;細胞外信號調節激酶(ERK,9102S)、磷酸化-ERK(p-ERK,9101S)、JNK(9252S)、磷酸化-JNK(p-JNK,4668S)、p38MAPK(9212S)、磷酸化p38MAPK (p-p38MAPK,9215S)、磷酸化-NF-κB(p-NF-κB,3031S)、NF-κB(8242S)、β-actin(#4970)一抗、羊抗兔二抗(HRP,7074S)均購自美國CST公司。

1.3 實驗儀器

Contour Elite三維光學顯微鏡購自美國布魯克公司;TGel藍光凝膠成像系統(OSE-470P)購自北京天根生化科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型建立與分組

將60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、曲克蘆丁低劑量組、曲克蘆丁中劑量組、曲克蘆丁高劑量組,每組10只。除空白組外,其余5組參照文獻[11]建立PD大鼠模型:大鼠每日稱重1次,按照大鼠體質量于每日同時間腹腔注射MPTP溶液10 μL/g(35.1 mg MPTP溶于10 mL 0.9%氯化鈉溶液中),空白組給予等體積0.9%氯化鈉溶液,每日1次,連續注射5 d。建模成功后,陽性對照組給予多巴絲肼片250 mg/kg[12],曲克蘆丁低劑量組、曲克蘆丁中劑量組、曲克蘆丁高劑量組分別給予曲克蘆丁12.5、25.0、50.0 mg/kg[13],給藥方式為灌胃給藥,每日1次,連續灌胃14 d。

1.4.2 行為學測定

給藥結束24 h后,對各組大鼠進行爬桿實驗[14]測定行為學能力:設置一個直徑約8 mm、高55 cm的直桿,將大鼠以頭向上的形式置于直桿頂端,記錄大鼠從頭向上到完全轉為頭向下所需時間(即轉頭時間)及轉頭后爬下直桿所需時間(即爬下直桿時間),限時30 s,30 s內未爬下直桿記為30 s。

1.4.3 氧化應激指標與炎性因子檢測

行為學測定結束后麻醉大鼠,眼靜脈取血,以2 000 r/min離心15 min,分離血清,嚴格按照試劑盒說明書操作,檢測大鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA、IL-6、IL-1β含量。

1.4.4 HE染色觀察大鼠腦黑質多巴胺能神經元病理學損傷情況

取血后各組隨機選擇5只大鼠,處死后開顱取出完整腦組織,分離腦黑質并固定,常規乙醇脫水、石蠟包埋、切片,采用HE染色試劑盒進行染色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察大鼠腦黑質多巴胺能神經元損傷情況,并拍照記錄。

1.4.5 TUNEL染色觀察大鼠腦黑質多巴胺能神經元凋亡情況

取制備好的腦黑質切片,加入蛋白酶K工作液,37 ℃孵育1 h,再滴加2%山羊血清封閉30 min,加入TUNEL工作液,37 ℃孵育1 h,DAB染色,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次,使用蘇木精染核,封片后置于顯微鏡下觀察并拍照記錄。其中細胞核呈棕色為陽性細胞,計算神經元凋亡率,神經元凋亡率=視野內陽性細胞數/視野內細胞總數×100%。

1.4.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測大鼠腦黑質中NF-κB/MAPK信號通路相關蛋白的表達

取各組剩余大鼠,處死后分離腦黑質,加入RIPA高效蛋白裂解液提取總蛋白,按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書嚴格操作,對各組總蛋白進行定量。各組取50 μg蛋白上樣進行十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜,加入5%脫脂奶粉進行封閉,TBST洗膜后加入稀釋的p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38MAPK、p38MAPK、p-NF-κB、NF-κB、β-actin(內參)一抗孵育液,4 ℃孵育過夜,再次使用TBST洗膜,加入HRP標記的羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h,TBST清洗,采用電化學發光(ECL)液進行顯色處理,凝膠成像系統掃描圖像后分析蛋白條帶灰度值,并進行相對定量分析。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學改變

與空白組比較,模型組大鼠轉頭時間及爬下直桿時間均延長(P<0.05);與模型組比較,陽性對照組與曲克蘆丁各劑量組大鼠轉頭時間與爬下直桿時間均縮短(P<0.05),且曲克蘆丁各劑量組間具有劑量效應(P<0.05)。曲克蘆丁高劑量組與陽性對照組轉頭時間及爬下直桿時間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠行為學改變(±s) 單位:s

2.2 各組大鼠血清氧化應激指標及炎性因子含量比較

與空白組比較,模型組大鼠血清SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05),MDA與IL-6、IL-1β含量升高(P<0.05);與模型組比較,陽性對照組血清SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05),MDA與IL-6、IL-1β含量降低(P<0.05),曲克蘆丁各劑量組隨著其劑量升高,血清SOD、GSH-Px活性逐漸升高(P<0.05),MDA與IL-6、IL-1β含量逐漸降低(P<0.05)。曲克蘆丁高劑量組與陽性對照組血清氧化應激指標及炎性因子含量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清氧化應激指標及炎性因子含量比較(±s)

2.3 各組大鼠腦黑質多巴胺能神經元病理學損傷改變

HE染色結果顯示,空白組大鼠腦黑質組織結構清晰,神經元排列緊密整齊,細胞間質清晰,未見損傷;模型組大鼠腦黑質組織結構被破壞,神經元排列紊亂,間質水腫,出現空泡,視野中可見大量炎性細胞浸潤。陽性對照組神經損傷較輕;曲克蘆丁各劑量組隨著劑量升高,神經元損傷逐漸減輕,細胞排列逐漸規律。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦黑質多巴胺能神經元損傷情況(HE染色,×200)

2.4 各組大鼠腦黑質多巴胺能神經元凋亡情況

TUNEL染色結果顯示,空白組神經元凋亡率為(10.05±1.61)%,與空白組比較,模型組大鼠神經元凋亡率[(65.19±5.87)%]升高(P<0.05);陽性對照組神經元凋亡率為(17.62±1.12)%,曲克蘆丁低劑量組神經元凋亡率為(47.33±4.16)%、曲克蘆丁中劑量組神經元凋亡率為(28.85±2.73)%、曲克蘆丁高劑量組神經元凋亡率為(19.61±1.43)%。與模型組比較,陽性對照組與曲克蘆丁各劑量組神經元凋亡率均降低(P<0.05),且曲克蘆丁各劑量組具有劑量效應(P<0.05);曲克蘆丁高劑量組與陽性對照組神經元凋亡率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2。

圖2 各組大鼠神經元凋亡情況(TUNEL染色,×100)

2.5 各組大鼠腦黑質NF-κB/MAPK信號通路相關蛋白表達比較

與空白組比較,模型組大鼠腦黑質組織p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值均升高(P<0.05);與模型組比較,陽性對照組與曲克蘆丁各劑量組大鼠腦黑質組織p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值均降低(P<0.05),且曲克蘆丁各劑量組具有劑量效應(P<0.05)。曲克蘆丁高劑量組與陽性對照組腦黑質NF-κB/MAPK信號通路相關蛋白表達比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表3、圖3。

圖3 各組大鼠腦黑質中MAPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達條帶圖(A為空白組;B為模型組;C為陽性對照組;D為曲克蘆丁低劑量組;E為曲克蘆丁中劑量組;F為曲克蘆丁高劑量組)

表3 各組大鼠腦黑質中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值比較(±s)

3 討 論

隨著我國老齡化程度日益加劇,PD發病率逐年升高,給家庭和社會帶來了沉重的負擔。PD發病機制復雜,與環境、遺傳及免疫應激等多種因素有關[15]。相關研究表明,多巴胺能神經元損傷是PD的主要原因[16]。多項研究顯示,氧化應激、神經元凋亡及炎癥反應均引起多巴胺能神經元損傷,進而影響神經功能[17-18]。本研究結果表明,PD模型建立后大鼠爬桿實驗結果顯示行為學功能受阻,且腦黑質多巴胺能神經元受損,凋亡率升高,血清SOD、GSH-Px活性降低,MDA與IL-6、IL-1β含量升高,提示PD大鼠模型建立成功,此時大鼠體內發生氧化應激與炎癥反應,誘導神經元凋亡,損傷神經元,從而導致神經功能受損,大鼠行為學能力下降。

NF-κB是機體內重要的炎癥轉錄因子,可調控免疫細胞的激活,炎性細胞的生成腫瘤細胞增殖分化,細胞凋亡等多種生理病理過程[19]。有研究表明,p-NF-κB激活炎性因子表達,產生大量促炎因子,反之,又誘導NF-κB信號通路激活,從而造成神經元凋亡增多,神經功能受阻[20]。抑制NF-κB信號通路相關蛋白的表達可減輕神經炎癥反應,緩解PD大鼠行為學功能障礙[21]。多項研究顯示,激活MAPK通路后,誘導p38MAPK與ERK磷酸化,介導炎性因子大量分泌,加劇炎癥反應[22-23]。有研究表明,抑制MAPK/NF-κB通路的激活可減輕炎癥反應,發揮神經保護作用[24]。本研究結果表明,PD大鼠腦黑質中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值均升高,提示MAPK/NF-κB信號通路被激活,誘導炎性反應加劇,引起神經功能障礙。有研究顯示,曲克蘆丁可減輕氧化反應,清除氧自由基,保護神經細胞完整,從而發揮對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦損傷的保護作用[13]。本研究結果也顯示,曲克蘆丁干預后的PD大鼠血清SOD、GSH-Px活性升高,MDA與IL-6、IL-1β含量降低,腦黑質多巴胺能神經元損傷減輕,神經元凋亡率下降,大鼠行為學能力提高,提示曲克蘆丁可減輕氧化應激、炎癥反應及多巴胺能神經元損傷,從而保護PD大鼠神經功能。曲克蘆丁對氧化應激與炎癥反應等的作用具有劑量效應,其中曲克蘆丁高劑量組與多巴絲肼片作用基本一致。本研究結果顯示,曲克蘆丁可下調ERK、JNK、p38MAPK、NF-κB磷酸化蛋白表達,提示曲克蘆丁對PD大鼠腦黑質中MAPK/NF-κB信號通路的激活具有抑制作用。

綜上所述,曲克蘆丁可有效減輕PD大鼠氧化應激,抑制炎癥反應,減輕多巴胺能神經元損傷,減少多巴胺能神經元凋亡,保護神經功能,可能與其抑制MAPK/NF-κB信號通路有關。但由于PD發生機制復雜,其具體機制仍需進一步研究。