基于臨床、病理、DWI 定量參數構建列線圖預測宮頸癌程序性死亡受體配體1陽性表達：不同ROI選擇的比較

劉開惠，楊蔚，田海萍，張治寧，李云霞，何劍莉

0 前言

宮頸癌是發展中國家最常見的女性惡性腫瘤之一[1]。盡管大多數患者同步放化療后預后良好，但仍有患者出現復發或轉移[2-3]。以程序性死亡受體1（programmed death 1, PD-1）及 其 配 體（PD-1 ligand, PD-L1）為靶點的免疫療法在宮頸癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤治療中備受關注[4-6]，其療效與PD-L1表達狀態相關[7]。目前，PD-L1表達狀態主要經免疫組化明確，其為有創性檢查，且采用的是腫瘤的局部組織，不能反映腫瘤的整體特征。MR 擴散加權成像（diffusion weighted imaging, DWI）的表觀擴散系數（apparent diffusion coefficient, ADC）在宮頸癌分期、分級及與免疫標志物相關性的研究中均表現出良好的應用價值[8-10]。但不同感興趣區（region of interest, ROI）的選擇可能影響組織中ADC 值。目前，研究多集中于臨床或病理特征與宮頸癌PD-L1陽性表達的相關，尚缺乏影像特征與之相關的研究報道[11-12]。因此，本研究旨在探究DWI不同ROI選擇提取的ADC值與宮頸癌PD-L1表達的相關性，并將其聯合臨床、病理相關參數建立列線圖預測宮頸癌PD-L1陽性表達的價值，為患者免疫治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究遵守《赫爾辛基宣言》，經寧夏醫科大學總醫院科研倫理委員會批準，批準文號：2018-062，對于回顧性的研究，免除受試者知情同意；對于前瞻性的研究，所有受試者均簽署知情同意書。收集2018年1月至2022年12月在我院就診的高度懷疑為宮頸癌的初診患者資料。其中，回顧性分析的2018年1月至2020年7月就診的患者病例為訓練組，前瞻性招募2020年8月至2022年12月就診的患者為驗證組。兩組的納入標準：（1）經病理證實為宮頸癌的首診患者；（2）在GE Signa Excite HD 3.0 T MR 儀上行盆腔MRI檢查，且盆腔MRI與之后的病理檢查之間的時間間隔不超過2周。兩組的排除標準：（1）MR圖像不清晰、病理資料不完整；（2）既往有治療干預史。

1.2 儀器設備

所有受檢者均在GE Signa Excite HD 3.0 T MR 儀上行盆腔MRI 掃描。所有患者檢查前禁食至少6 h，保持膀胱半充盈。掃描序列及參數：軸位T1WI，重復時間（repetition time, TR）500 ms，回波時間（echo time, TE）8.5 ms，視野（field of view, FOV）240 mm×320 mm，層厚5 mm；軸位T2WI，TR 4200 ms，TE 95 ms，FOV 240 mm×360 mm，層厚5 mm；軸位DWI掃描采用單次激發平面回波成像序列，TR 4600 ms，TE 66 ms，FOV 320 mm×192 mm，層厚5 mm，b 值取0 和1000 s/mm2；增強掃描，TR 160 ms，TE 1.4 ms，FOV 240 mm×240 mm，層厚5 mm；經肘靜脈用高壓注射器以2.0 mL/s 的流率注射對比劑釓噴酸葡胺注射液（Gd-DTPA，馬根維顯，拜耳醫藥保健股份有限公司），劑量0.2 mmol/kg，最后以15 mL 生理鹽水用相同流率沖洗管腔。

1.3 圖像分析

將原始數據導入GE ADW 4.4 工作站，由2 名分別有22 年和3 年婦科腫瘤影像診斷經驗的主任醫師和住院醫師在雙盲條件下進行閱片，測量病灶大小及不同ROI 的ADC 值，針對穿刺活檢患者需評估病灶浸潤深度、是否有宮旁浸潤及淋巴結轉移情況。若兩者的測量、評估結果一致性良好，則以住院醫師的測量結果進行后續分析。參考T2WI 及增強掃描圖像，在DWI圖像上選擇包含腫瘤實體成分的所有連續層面，沿腫瘤邊緣手動勾畫ROI，并從對應的ADC偽彩圖上獲得各個層面的ADC 值，將所有層面的ADC 值平均，即為腫瘤平均ADC（mean ADC, ADCmean）（圖1A）；在DWI 圖像上選擇包含腫瘤實體成分的最大層面，沿腫瘤邊緣手動勾畫ROI，獲得該層面ADC值，即為腫瘤單層面ADC（single section ADC, ADCss）（圖1B）；在包含腫瘤實體成分的每一個層面上手動放置若干個圓形或類圓形30～50 mm2的ROI，每個腫瘤約放置15～30個ROI，選取一個ROI對應的最小ADC值，即為腫瘤最小ADC（minimum ADC, ADCmin）[13]（圖1C）。在選取ROI 時，盡量避開出血、壞死及囊變區域。針對穿刺活檢患者，以T2WI、DWI 及增強掃描圖像為參考評估病灶浸潤深度、宮旁浸潤，以淋巴結短徑＞1 cm 作陽性[14]。

圖1 感興趣區（ROI）勾畫示意圖及免疫組化染色圖。1A：在包含腫瘤實體成分的所有連續層面繪制ROI，并計算這些層面的表觀擴散系數（ADC）值的平均值得到腫瘤平均ADC（ADCmean）；1B：在腫瘤實體成分最大的層面繪制ROI，記錄得到的ADC 值為腫瘤單層面ADC（ADCss）；1C：測量ADCmin的ROI 放置方法；1D：免疫組化染色下的PD-L1強陽性表達（×400倍），腫瘤細胞核染色為棕色。Fig.1 Sketch map of region of interest (ROI) and immunohistochemical staining map.1A: Draw ROI along all consecutive slices containing tumor solid components on the apparent diffusion coefficient (ADC) pseudo-color map and calculate the average ADC values of all selected slices to determine mean ADC(ADCmean); 1B: Define ROI along the slice with the maximum extent of tumor solid components, and record the obtained ADC value as single section ADC (ADCss);1C: Illustration of the ROI placement method for measuring minimum ADC (ADCmin); 1D: Strongly positive PD-L1 expression (×400) depicted by immunohistochemical staining, tumor cell nuclei are stained brown.

1.4 免疫組織化學染色

采用免疫組化法檢測宮頸癌組織中PD-L1 表達水平，對于穿刺活檢的患者，通過多點取材以保證免疫組化檢測有充足的標本。以PD-L1 鼠抗人單克隆抗體標識PD-L1。以陽性細胞比率與染色強度乘積為評分標準[15]，最終得分≥2 分視為陽性，否則為陰性（圖1D）。S-100 染色陽性提示病灶嗜神經侵犯，CD34 和（或）D2-40 染色陽性提示存在淋巴脈管侵犯（lymphovascular invasion, LVI)。

1.5 統計學分析

采用SPSS 26.0（IBM Corp., Armonk, NY, USA）、R 4.2.2（R Development Core Team, Vienna, Austria）軟件進行統計分析。用組內相關系數（intraclass correlation coefficient, ICC）評估兩名醫師對病灶大小、ADCmean、ADCss、ADCmin測量結果的一致性；用Cohen's Kappa 系數（κ）評估兩名醫師對病灶浸潤深度、宮旁浸潤、淋巴結轉移評估結果的一致性，ICC、κ＞0.8 被認為一致性極好。對于符合正態分布的定量資料以均數±標準差（xˉ±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；分類資料用頻數（百分數）表示，組間比較采用χ2檢驗。在訓練組中，首先進行單因素logistic 回歸分析，將差異有統計學意義的參數納入多因素logistic 逐步回歸分析，行共線性診斷及相關性分析；若參數的方差膨脹系數（variance inflation factor, VIF）＞10，則予以排除；若變量間具有較強的相關性，則進一步比較診斷效能，選擇最優變量，最終確定宮頸癌PD-L1陽性表達的獨立相關因素，分別建立臨床病理模型及聯合模型，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線評估不同模型及各獨立相關因素的診斷效能，并采用DeLong 檢驗評估診斷效能的差異。隨后繪制模型列線圖及校準曲線，采用Hosmer-Lemeshow檢驗評估列線圖預測情況與實際情況的一致性；決策曲線評價模型的臨床獲益度；PD-L1 表達與不同ADC 值及PD-1 表達間的相關性采用Spearman 相關系數分析；不同ADC 值間的相關性采用Pearson 相關系數分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

本研究排除了79 例因盆腔MRI 圖像質量差無法應用及67 例既往有放化療干預史患者，最終納入1015例宮頸癌患者，年齡27～91（53±11）歲；其中訓練組683 例，366 例患者為手術病理，317 例為穿刺活檢病理，PD-L1 陽性表達375 例（54.9%）；驗證組332 例，207 例 手 術 病 理，125 例 穿 刺 活 檢 病 理，PD-L1陽性表達190例（57.2%）。

2.1 訓練與驗證組間基線資料比較

觀察者間測量ADCmean[ICC=0.983 (95%CI:0.980-0.985)]、ADCss[ICC=0.987 (95%CI: 0.984-0.988)]、ADCmin[ICC=0.991 (95%CI: 0.990-0.992)]、病灶大小[ICC=0.991 (95%CI: 0.989-0.993)]、病灶浸潤深度[κ=0.844 (95%CI: 0.802-0.885)]、宮旁浸潤[κ=0.846 (95%CI: 0.807-0.885)]、淋 巴 結 轉 移[κ=0.876 (95%CI: 0.838-0.913)]的一致性均極好。

兩組間PD-L1陽性表達比例、年齡、絕經狀態、病灶大小、吸煙史、分娩次數、HPV感染、FIGO分期、組織學類型、病理分級、病灶浸潤深度、宮旁浸潤、LVI、嗜神經侵犯、淋巴結轉移、Ki-67指數、ADCmean、ADCss、ADCmin差異均無統計學意義（P均＞0.05），詳細見表1。

表1 訓練組與驗證組基線資料比較Tab.1 Comparison of data between the training cohort and the validation cohort

2.2 訓練組中PD-L1陽性表達組與陰性表達組臨床、病理及影像參數比較

兩組間絕經狀態、吸煙史、分娩次數、HPV 感染、嗜神經侵犯、Ki-67指數差異均無統計學意義（P均＞0.05)；年齡、病灶大小、FIGO 分期、組織學類型、病理分級、病灶浸潤深度、宮旁浸潤、LVI、淋巴結轉移、ADCmean、ADCss、ADCmin差 異 均 有 統 計 學 意 義（P均＜0.05），詳細見表2。

表2 訓練組中PD-L1陽性表達組與陰性表達組臨床、病理及影像參數比較Tab.2 Comparison of clinical, pathological, and imaging parameters between the PD-L1 positive and negative expression groups in the training cohort

二元logistic 回歸分析顯示FIGO 分期、病理分級、宮旁浸潤、淋巴結轉移、ADCmean、ADCss、ADCmin為PD-L1 表達的獨立相關因素（表3）。其中，ADCmean、ADCss、ADCmin預測宮頸癌組織PD-L1表達的ROC曲線下面積（area under the curve, AUC）分別為0.830（95%CI: 0.800-0.857）、0.853（95%CI: 0.824-0.879）、0.882（95%CI: 0.855-0.905）。DeLong 檢驗顯示，三種ADC 值的診斷效能差異存在統計學意義，ADCmin診斷效能最高（Z=2.455-4.852,P＜0.05），因此，將ADCmin納入后續建模分析。

表3 單、多因素logistic回歸分析宮頸癌組織中PD-L1陽性表達的相關因素Tab.3 Univariable and multivariable logistic regression analyses for correlation factors of PD-L1 positive expression in cervical cancer

2.3 聯合模型的建立及診斷效能

基于上述獨立相關因素，分別構建包含FIGO 分期、病理分級、宮旁浸潤、淋巴結轉移的臨床病理模型及包含FIGO分期、病理分級、宮旁浸潤、淋巴結轉移及ADCmin的聯合模型。通過ROC曲線分析，聯合模型的診斷效能最高，AUC 為0.906（95%CI: 0.882-0.927），高于臨床病理模型及各獨立預后因素（Z=3.645-14.210，P均＜0.05），詳見表4及圖2。

表4 ROC曲線分析各獨立相關因素及模型預測PD-L1陽性表達的診斷效能Tab.4 Diagnostic performance of ROC curve analysis on independent related factors and models for predicting PD-L1 positive expression

圖2 受試者工作特征曲線。ADCss：單層面ADC；ADCmean：平均ADC；ADCmin：最小ADC；ADC：表觀擴散系數。Fig.2 The receiver operating characteristic curves.ADCss: single section ADC; ADCmean: mean ADC; ADCmin: minimum ADC; ADC: apparent diffusion coefficient.

2.4 列線圖的構建及驗證

通過R軟件構建聯合模型的列線圖及校準曲線。Hosmer-Lemeshow 檢驗中，P＞0.05 提示列線圖在訓練組及驗證組中均擬合度良好，即實際情況與預測結果一致性良好（圖3）。列線圖在驗證組中也表現出良好的診斷效能，AUC 為0.903（95%CI: 0.866-0.933）（圖4）。決策曲線分析顯示，在所有閾值概率下，列線圖在訓練組與驗證組中的人群臨床凈收益均較高（圖5）。列線圖預測PD-L1 陽性表達的案例如圖6所示。

圖3 訓練組基于聯合模型構建的列線圖（3A）及校準曲線（3B）。圖4 驗證組中聯合模型的受試者工作特征曲線（4A）及校準曲線（4B）。圖5 訓練組（5A）與驗證組（5B）中臨床病理模型與聯合模型的決策曲線。FIGO：國際婦產科學聯盟；ADCmin：腫瘤最小ADC；ADC：表觀擴散系數；PD-L1：程序性死亡受體配體1。Fig.3 A nomogram based on the combined model of the training cohort (3A)and calibration curve (3B).Fig.4 The receiver operating characteristic curve(4A) and calibration curve (4B) of the combination model in the validation cohort.Fig.5 The decision curves of the combined model in the training (5A)and validation cohort (5B).FIGO: International Federation of Gynecology and Obstetrics; ADCmin: minimum ADC; ADC: apparent diffusion coefficient; PD-L1:programmed death-ligand 1.

圖6 女，51 歲，宮頸低分化鱗癌（PD-L1陽性表達）患者。6A：T2WI示腫塊為不規則的等高信號（箭）；6B：DWI（b 值為1000 s/mm2）示腫塊為明顯高信號（箭）；6C：列線圖示FIGO 分期Ⅲ期（4.9 分），病理分級為低分化（10 分），宮旁浸潤陽性（21.25分），淋巴結轉移陰性（0 分），ADCmin值為0.86×10-3 mm2/s（60 分），共96.15 分，對應PD-L1 陽性表達風險約為94%，預測情況與實際一致。DWI：擴散加權成像；FIGO：國際婦產科學聯盟；ADCmin：腫瘤最小ADC；ADC：表觀擴散系數；PD-L1為程序性死亡受體配體1。Fig.6 Female, 51-year-old, patient with poorly differentiated squamous cell carcinoma of the cervix (PD-L1 positive expression).6A: T2WI reveals an irregular mass in the cervix with iso- and hyper-intensity (arrow); 6B: Diffusion-weighted imaging (DWI; b=1000 s/mm2) exhibits a notably hyper-intense region (arrow); 6C:The nomogram displays that in this case, FIGO staging Ⅲ (score 4.9), poor pathological grade (score 10), positive parametrial invasion (score 21.25), negative lymph node status (score 0), ADCmin=0.86×10-3 mm2/s (score 60), resulting in a total score of 96.15 after summing all corresponding points.This corresponds to a risk of PD-L1 positive expression of about 94%, aligning well with the predicted outcome.DWI: diffusion weighted imaging; FIGO: International Federation of Gynecology and Obstetrics; ADCmin: minimum ADC; ADC: apparent diffusion coefficient; PD-L1: programmed death-ligand 1.

2.5 相關性分析

宮頸癌組織中PD-L1 表達與ADCmean、ADCss、ADCmin均呈負相關[r=-0.566 (95%CI: -0.608-0.498),-0.593 (95%CI: -0.654-0.548),-0.642 (95%CI:-0.707-0.612),P＜0.01]；PD-L1 與PD-1 表達呈正相關[r=0.21 (95%CI: 0.11-0.47),P＜0.05]。ADCmean、ADCss、ADCmin三者間存在相關性[ADCmeanvs.ADCss:r=0.893 (95%CI: 0.871-0.912); ADCssvs.ADCmin:r=0.902 (95%CI: 0.877-0.922); ADCmeanvs.ADCmin:r=0.858 (95%CI: 0.833-0.879)]。

3 討論

本研究采用三種不同ROI 勾畫方法測量ADC 值，并探討基于ADC值、臨床及病理特征構建的列線圖在預測宮頸癌PD-L1 陽性表達中的潛在價值。結果表明，ADCmin的診斷效能最佳，且將其聯合臨床、病理特征構建的列線圖能夠無創、準確、直觀地預測PD-L1表達狀態，進而為臨床免疫療法決策提供理論依據。

3.1 DWI定量參數預測宮頸癌患者PD-L1陽性表達狀態的重要性

腫瘤組織中PD-L1 表達狀態與免疫治療密切相關[16-17]，明確PD-L1 表達狀態有利于指導臨床治療方案的選擇。目前，PD-L1 表達狀態主要是通過穿刺活檢或手術病理對組織進行免疫組織化學染色明確，為有創性檢查；并且，由于腫瘤的異質性，用于免疫組化的局部組織不能反映整個腫瘤的特征。因此，探究治療前無創性預測宮頸癌患者PD-L1 表達狀態有重要意義。DWI 對病灶敏感，能夠反映組織中水分子布朗運動的微觀變化，已被廣泛用于表征腫瘤的內在特征。近年來，人工智能的迅速發展，應用ADC的紋理分析及影像組學[18-22]等預測腫瘤組織中PD-L1 陽性表達也表現出良好的診斷效能，但這些需要復雜的后處理工具，在臨床實踐中應用受限。因此，本研究選擇DWI常規參數聯合臨床、病理特征，簡單易行，更適用于臨床實踐及應用推廣。

3.2 三種ROI選擇方法提取ADC值的診斷效能比較

在我們的研究中，不同ROI 選擇會影響ADC 值，與相關研究一致[23]。ADCmean、ADCss、ADCmin均與PD-L1陽性表達相關，與RASMUSSEN 等[24]及MEYER 等[25]在頭頸部惡性腫瘤中的研究結果相似。從DWI中提取的ADC值可以定量分析病灶內水分子的擴散受限，進而反映其細胞密度變化[26-27]。PD-L1陽性表達的病灶內腫瘤細胞增殖更明顯、更密集，其水分子擴散更受限，因此ADC 值也更低。本研究對三種ADC 值的診斷效能進行比較顯示ADCmin的診斷效能最高，AUC 為0.882，以0.995×10-3mm2/s為臨界值，鑒別PD-L1陽性表達的敏感度和特異度為84.00%和87.01%。腫瘤組織中水分子擴散受限最明顯的區域與腫瘤細胞增殖最活躍、分布最為密集的區域相對應，ADCmin可更好地反映腫瘤的內在特征，這與YANG 等[13]和BICKEL等[28]在宮頸癌和乳腺癌中的研究一致。另外，與ADCmean及ADCss相比，ADCmin的觀察者間一致性最高，可重復性強，穩定性好，更利于臨床應用。

3.3 基于ADCmin、臨床及病理特征的列線圖預測宮頸癌PD-L1陽性表達的效能

本研究表明FIGO分期、病理分級、宮旁浸潤、淋巴結轉移、ADCmin與PD-L1陽性表達獨立相關，與OMENAI等[29]及韓麗萍等[30]的研究一致。聯合上述獨立相關因素構建列線圖，其診斷效能高（AUC=0.906），且優于臨床病理模型及各單一獨立相關因素。該列線圖在驗證組中也表現出良好的辨別及校準能力。決策曲線分析顯示在訓練組與驗證組中聯合模型的總體凈收益均高于臨床-病理模型。該列線圖可能成為篩選免疫療法獲益潛在患者的有力工具。

3.4 宮頸癌PD-L1與PD-1表達的相關性分析

我們的研究結果發現宮頸癌PD-L1 與PD-1 表達呈正相關，與韓麗萍等[30]的研究結果一致。腫瘤細胞表面的PD-L1誘導人體組織T細胞表面的PD-1表達并與之結合導致T細胞凋亡及功能衰竭，從而開啟免疫逃逸機制[31-32]。PD-1 高表達是T 細胞功能耗竭的標志[12]。

3.5 本研究的局限性

第一，訓練組為回顧性收集且所有病例均來自單一機構，可能存在數據偏倚；第二，免疫組化所取材的腫瘤層面可能與腫瘤整體情況存在差異；第三，本研究僅使用單中心數據建立模型，需多中心研究進一步驗證。

4 結論

綜上，FIGO 分期、病理分級、宮旁浸潤、淋巴結轉移、ADCmin與PD-L1 表達獨立相關。基于上述參數構建的列線圖有助于預測宮頸癌組織PD-L1陽性表達，為臨床免疫治療決策提供依據。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻聲明：楊蔚設計本研究的方案，對稿件重要內容進行了修改，對論文整體進行全面審閱與把關，獲得了國家自然科學基金項目資助；劉開惠起草和撰寫稿件，獲取、分析或解釋本研究的數據；田海萍、張治寧、李云霞、何劍莉獲取、分析或解釋本研究的數據，對病例收集及稿件相關內容給予指導，對稿件重要內容進行了修改；全體作者都同意發表最后的修改稿，同意對本研究的所有方面負責，確保本研究的準確性和誠信。