基于VEGF/MAPKs通路探討益腎養肝明目方對RPE細胞凋亡作用的影響

龔雁，李萌，廖燕紅，高健，章曉林，王桑桑

氧化應激指體內氧化代謝不平衡，使炎癥反應發生并產生大量的氧化中間產物，包括一氧化氮、活性氧（reactive oxygen species，ROS）以及過氧化氫（H2O2）等[1]。ROS可通過細胞凋亡途徑致使細胞死亡，參與促炎和促血管生成的過程[2]，而眼是ROS攻擊的主要目標之一。當人暴露于一些特殊環境下，如光照、紫外線、電離輻射、化學污染物和致病微生物等，均能將細胞的原本平衡的氧化還原狀態轉變為激活狀態，從而引起干眼、白內障、青光眼、糖尿病視網膜病變甚至眼部惡性腫瘤疾病[3-8]。一些研究[9-12]表明，中藥能夠有效地降低視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞的氧化應激，降低炎癥因子，改善視網膜病理損傷。益腎養肝明目方（YishenYangganMingmuFormula，YYM）是在駐景丸的基礎上，根據筆者臨床應用經驗加減而成，但其藥效和作用機制有待進一步闡明。本研究旨在通過體外細胞實驗探究YYM增強RPE細胞抵抗氧化應激的能力，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

人視網膜色素上皮（adult retinal pigment epithelium，ARPE）-19（浙江如耀生物有限公司，Rybio-ARPE-19），血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、外源性調節蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）、B細胞淋巴瘤蛋白-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關蛋白X（Bcl-2-associated X protein，Bax）、細胞色素c（Cytochrome c，Cyc）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（杭州華安生物科技有限公司，ER30607、ET1601-29、ET1603-22、ER0907、ER0602、ET1610-60、R1207-1），p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、應激活化蛋白激酶/Jun N-末端激酶（stress-activated protein kinase/Jun N-terminal kinase，SAPK/JNK）抗體（美國Cell signaling公司，9212、67096），ROS化學熒光法檢測試劑盒（南京建成科技有限公司，E004-1-1），細胞凋亡流式檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，CA1020），康柏西普眼用注射液（成都康弘藥業集團股份有限公司，S20130012）。流式細胞儀（美國Life Technology公司，AttuneNxT），多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司，SpectraMax M），化學發光成像系統（美國UVP公司，ChemiDoc-It Imaging System）。

YYM藥物組成：菟絲子、車前子、太子參、黃芪各15 g，枸杞子、桑葚、女貞子各10 g，熟地黃20 g，蒲黃炭3 g。制備方法：煎藥前加適量純凈水，浸泡30～60 min，大火熬開，然后小火煎制20 min，將藥液過濾倒出。加水煎第2遍15 min，完成后將2次藥液合并，13,000 r/min離心2 min去除沉淀，隨后通過旋轉蒸發濃縮藥液，用超純水調整藥液濃度為1 g/mL，最后使用0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存備用。

1.2 細胞培養

ARPE-19細胞培養在含有10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（0.1 mg/mL）的培養基中，置于含5%二氧化碳的37 ℃恒溫細胞培養箱中，每周傳代2次。

1.3 藥物濃度篩選

將處于對數增殖期的ARPE-19消化后，按每孔8,000個細胞移至96孔板中培養，次日分別篩選H2O2造模濃度、陽性藥康柏西普濃度和YYM濃度。（1）H2O2：加入終濃度為100、200、400、800、1,600 μmol/L的H2O2，孵育1 h后，檢測細胞光密度（optical density，OD）值，計算存活率；（2）康柏西普：加入終濃度為0.08、0.40、2.00、10.00、50.00 μg/mL的康柏西普，培養48 h后，四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）檢測細胞OD值，計算抑制率；（3）YYM：加入終濃度為8、40、200、1,000、5,000 μg/mL的YYM藥液，培養48 h后，MTT法檢測細胞OD值，計算抑制率。

1.4 細胞分組與處理

使用上述篩選得到的最佳濃度處理ARPE-19細胞，將細胞分為6組，（1）空白組（blank group，BG）：正常培養ARPE-19細胞；（2）模型組（model group，MG）：ARPE-19+H2O2；（3）益腎養肝明目方組（YYM group，YYM）：ARPE-19+H2O2+YYM；（4）康柏西普組（conbercept group，CB）：ARPE-19+H2O2+CB；（5）益腎養肝明目方+康柏西普組（YYM+conbercept group，YYM+CB）：ARPE-19+H2O2+YYM+CB；（6）益腎養肝明目方對照組（YYM control group，YYMCG）：ARPE-19+YYM。

1.5 細胞形態觀察

將細胞培養液均勻滴在載玻片上，使用相差顯微鏡將細胞定位在視野中心。調整放大倍數至100倍后，顯微鏡下觀察不同組ARPE-19細胞的形態和生長狀態，并拍照記錄。

1.6 細胞凋亡檢測

收集各組處理后的細胞，依次離心、吸取上清、洗滌。按照試劑盒說明書步驟，加入Annexin VFITC結合液重懸細胞混勻，室溫避光孵育10 min。離心棄上清后，再次加入Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入染色液混勻，避光放置。使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，每組檢測3次，取平均值。

1.7 化學熒光法檢測ROS表達

將按照試劑盒說明書，去除細胞培養液，將探針加入培養皿中（終濃度為10 μM），并以只加培養液的細胞作為陰性對照，37 °C孵育25 min，吸去培養液反復吹打細胞，收集細胞懸液并用洗滌2次，800 r/min下離心5 min，吸取上清后重新懸浮細胞，設定激發波長為488 nm，發射波長525 nm，檢測各組中的ROS表達。

1.8 Western Blot檢測VEGF/MAPKs通路相關蛋白表達

提取各組細胞總蛋白質，測定蛋白濃度。依次經凝膠、電泳、轉膜、封閉后，分別加入兔抗VEGF（稀釋比例1∶500）、ERK1/2（稀釋比例1∶500）、p-ERK1/2（稀釋比例1∶500）、Bcl-2（稀釋比例1∶500）、Bax（稀釋比例1∶500）、Cytochrome c（稀釋比例1∶500）、MAPKs p38（稀釋比例1∶500）、MAPKs p-p38（稀釋比例1∶500）、SAPK/JNK（稀釋比例1∶500）、p-SAPK/JNK（稀釋比例1∶500）一抗及內參蛋白β-actin（稀釋比例1∶1,000），4 ℃孵育過夜。次日洗膜后，山羊抗兔二抗（稀釋比例1∶2,500）室溫孵育2 h，顯影。用Image J軟件對圖像進行分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白表達量/同一樣本內參蛋白表達量。

1.9 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，符合正態分布和方差齊性的計量資料，以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析（ANOVA）進行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗。當P＜0.05時，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物濃度篩選

2.1.1 H2O20、100、200、400、800、1,600 μM濃度H2O2條件下的ARPE-19細胞存活率依次為（99.33±0.91）%、（95.17±3.56）%、（89.43±4.80）%、（34.51±3.78）%、（9.17±1.74）%、（10.58±2.57）%。6組間細胞存活率比較，差異有統計學意義（F=550.939，P=0.000）。兩兩比較，與0 μM比較，400 μM條件下的細胞存活率較低（t=25.008，P=0.000），差異有統計學意義，故選擇400 μM作為H2O2的誘導濃度。

2.1.2 康柏西普 0、0.08、0.40、2.00、10.00、50.00 μg/mL濃度康柏西普處理后的ARPE-19細胞存活率依次為（100.10±2.05）%、（97.18±0.93）%、（95.07±0.78）%、（120.60±1.61）%、（120.63±3.32）%、（122.02±5.61）%。6組間細胞存活率比較，差異有統計學意義（F=60.414，P=0.000）。兩兩比較，與0 μg/mL組相比，2.00 μg/mL條件下的細胞存活率較高（t=8.632，P=0.000），差異有統計學意義，故選擇2 μg/mL作為陽性藥康柏西普的干預濃度。

2.1.3 YYM 0、8、40、200、1,000、5,000 μg/mL濃度YYM處理后的ARPE-19細胞存活率依次為（99.70±1.67）%、（104.41±4.63）%、（121.30±3.61）%、（116.27±5.59）%、（115.90±6.02）%、（114.91±5.72）%。6組間細胞存活率比較，差異有統計學意義（F=8.828，P=0.001）。兩兩比較，與0 μg/mL組相比，40 μg/mL條件下的細胞存活率較高（t=5.527，P=0.000），差異有統計學意義。當濃度繼續增大時，細胞存活率出現下降，故選擇40 μg/mL作為YYM的干預濃度。

2.2 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞形態的影響

BG組AREP-19細胞形態呈現正常的梭形，當加入H2O2之后，MG組細胞發生損傷，由原始形態變成圓形，部分細胞從培養皿中脫落，細胞之間的連接下降，提示存在細胞凋亡等現象。而經過YYM和康柏西普預處理的細胞損傷程度較MG組減少，凋亡細胞數量明顯下降，表明這2種藥物都能有效緩解H2O2造成的細胞損傷。此外，YYM對正常AREP-19細胞無明顯損傷，且YYM和康柏西普聯用的效果比兩者分別單獨使用更能緩解細胞皺縮的現象（圖1）。

圖1 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞形態的影響（相差顯微鏡，×100）

2.3 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞凋亡的影響

6組間細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=45.101，P=0.000）。兩兩比較，與BG組比較，MG組細胞凋亡率較高（t=12.408，P=0.000）；與MG組比較，YYM、CB、YYM+CB組細胞凋亡率均較低（tYYM=6.023，tCB=5.967，tYYM+CB=9.804，均P=0.000）；與YYM+CB組比較，YYM組和CB組凋亡率較高（tYYM=3.781，P=0.003；tCB=3.836，P=0.002），差異有統計學意義（圖2、表1）。

表1 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞凋亡和ROS表達的影響（±s，n=3）

表1 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞凋亡和ROS表達的影響（±s，n=3）

注：* 與BG組比較，P<0.05；# 與MG組比較，P<0.05；BG 空白組；MG 模型組；YYM 益腎養肝明目方組；CB 康柏西普組；YYM+CB益腎養肝明目方+康柏西普組；YYM-CG 益腎養肝明目方對照組；ROS 活性氧

ROS相對表達量（%）100.33±7.51 180.99±4.83*132.66±5.28#131.80±7.93#110.24±3.40#103.43±10.04#57.485 0.000組別BG MG YYM CB YYM+CB YYM-CG F值P值細胞凋亡率（%）6.27±0.98 21.99±2.88*14.36±1.20#14.43±1.09#9.57±1.35#6.42±0.86#45.101 0.000

圖2 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞凋亡的影響

2.4 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞ROS表達的影響

6組間ROS表達比較，差異有統計學意義（F=57.485，P=0.000）。兩兩比較，與BG組比較，MG組ROS表達升高（t=14.388，P=0.000）；與MG組比較，YYM、CB、YYM+CB組ROS表達降低（tYYM=8.621，tCB=8.774，tYYM+CB=12.620，均P=0.000）；與YYM+CB組比較，YYM、CB組ROS表達升高（tYYM=3.999，P=0.002；tCB=3.846，P=0.002），差異有統計學意義（表1）。

2.5 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞VEGF/MAPKs通路的影響

6組間VEGF、p-p38、p-SAPK/JNK、p-ERK1/2、Bax、Bcl-2、Cyc蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（FVEGF=115.896，Fp-p38=170.325，Fp-SAPK/JNK=108.524，Fp-ERK1/2=110.808，FBax=144.260，FBcl-2=127.571，FCyc=263.139，均P=0.000）。

兩兩比較，（1）VEGF：與BG組比較，MG組VEGF蛋白表達較高（t=18.569，P=0.000）；與MG組比較，YYM、CB、YYM+CB組VEGF蛋白表達較低（tYYM=9.493，tCB=16.065，tYYM+CB=18.569，均P=0.000），差異均有統計學意義。

（2）p-p38 MAPK：與BG組比較，MG組p-p38 MAPK蛋白表達較高（t=22.097，P=0.000）；與MG組比較，YYM、CB、YYM+CB組p-p38 MAPK蛋白表達均較低（tYYM=8.942，tCB=16.033，tYYM+CB=21.378，均P=0.000），差異均有統計學意義。

（3）p-SAPK/JNK：與BG組比較，MG組p-SAPK/JNK蛋白表達較高（t=17.548，P=0.000）；與MG組比較，YYM、CB、YYM+CB組中p-SAPK/JNK蛋白表達均較低（tYYM=8.683，tCB=15.558，tYYM+CB=17.005，均P=0.000），差異均有統計學意義。

（4）p-ERK1/2：與BG組比較，MG組p-ERK1/2蛋白表達較高（t=18.567，P=0.000）；與MG組比較，YYM、CB、YYM+CB組中p-ERK1/2蛋白表達均較低（tYYM=8.929，tCB=13.890，tYYM+CB=16.583，均P=0.000），差異均有統計學意義。

（5）Bax：與BG組比較，MG組Bax蛋白表達較高（t=20.575，P=0.000）；與MG組比較，YYM、CB、YYM+CB組中Bax蛋白表達均較低（tYYM=8.849，tCB=16.043，tYYM+CB=20.071，均P=0.000），差異均有統計學意義。

（6）Bcl-2：與BG組比較，MG組Bcl-2蛋白表達較低（t=18.879，P=0.000）；與MG組比較，YYM、CB、YYM+CB組中Bcl-2蛋白表達均較高（tYYM=4.863，tCB=6.579，tYYM+CB=11.442，均P=0.000），差異均有統計學意義。

（7）Cyc：與BG組比較，MG組Cyc蛋白表達較高（t=28.196，P=0.000）；與MG組比較，YYM、CB、YYM+CB組中Cyc蛋白表達均較低（tYYM=11.832，tCB=22.028，tYYM+CB=26.560，均P=0.000），差異均有統計學意義（圖3、表2）。

表2 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞VEGF/MAPKs通路的影響（±s，n=3）

表2 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞VEGF/MAPKs通路的影響（±s，n=3）

注：* 與BG組比較，P<0.05；# 與MG組比較，P<0.05；BG 空白組；MG 模型組；YYM 益腎養肝明目方組；CB 康柏西普組；YYM+CB 益腎養肝明目方+康柏西普組；YYM-CG 益腎養肝明目方對照組；VEGF 血管內皮生長因子；p38 MAPK p38絲裂原活化蛋白激酶；SAPK/JNK 應激活化蛋白激酶/Jun N-末端激酶；ERK1/2 外源性調節蛋白激酶1/2；Bax Bcl-2相關蛋白X；Bcl-2 B細胞淋巴瘤蛋白-2；Cyc 細胞色素c；β-actin β-肌動蛋白

Cyc/β-actin 1.01±0.09 3.25±0.18*2.31±0.07#1.50±0.07#1.14±0.07#0.96±0.04#263.139 0.000組別BG MG YYM CB YYM+CB YYM-CG F值P值VEGF/β-actin 1.01±0.09 2.79±0.16*1.88±0.11#1.25±0.06#1.01±0.18#0.94±0.03#115.896 0.000 p-p38 MAPK/p38 MAPK 1.01±0.09 3.16±0.15*2.29±0.16#1.60±0.11#1.08±0.12#0.92±0.05#170.325 0.000 p-SAPK/JNK/SAPK/JNK 1.01±0.09 1.98±0.11*1.50±0.04#1.12±0.05#1.04±0.04#0.91±0.04＃108.524 0.000 p-ERK1/2/ERK1/2 1.00±0.08 2.31±0.09*1.68±0.07#1.33±0.13#1.14±0.07#0.91±0.06＃110.808 0.000 Bax/β-actin 1.01±0.09 3.87±0.33*2.64±0.06#1.64±0.14#1.08±0.16#0.89±0.09#144.260 0.000 Bcl-2/β-actin 1.00±0.02 0.34±0.02*0.51±0.01#0.57±0.02#0.74±0.04#1.04±0.09#127.571 0.000

圖3 YYM對H2O2誘導的AREP-19細胞VEGF/MAPKs通路的影響

3 討論

RPE細胞受到長期的氧化應激攻擊是年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）發病的關鍵因素之一，因此，保護RPE細胞免受氧化應激是預防AMD重要方式[15-16]。眼內VEGF水平升高引發RPE通透性增加[17]，而抗VEGF藥物治療，如阿柏西普、雷珠單抗或貝伐珠單抗等已被證實能夠緩解AMD[18]。康柏西普是一種新型的誘餌受體蛋白，通過將VEGF受體1和VEGF受體2細胞外結構域與人免疫球蛋白的Fc區融合，可以結合不同的VEGF-A亞型從而產生顯著的抗血管生成作用，從而治療AMD等新生血管相關性疾病[19]。而VEGF在一定程度上能夠通過VEGF受體2引起ROS的增加[20]，因此，抑制VEGF受體也是抑制ROS的途徑之一。雖然康柏西普具有良好的藥效，但是臨床使用需要通過玻璃體腔注射，具有一定的風險[21-22]。

YYM是由駐景方加減得到的中藥方劑，熟地黃是該藥最主要的成分，已有報道[23]表明其具有減輕神經細胞氧化應激的功效；方中菟絲子、女貞子益精強陰；枸杞子滋補肝腎；熟地黃、桑葚滋陰補血；黃芪、太子參合用益氣養陰；車前子清熱利水明目。相比康柏西普的治療方式，YYM僅需口服就能達到一定的治療效果，更易被患者接受。此外，中醫學[24]認為，肝與黃斑聯系密切。首先，黃斑周圍脈絡血管豐富而充盈，故肝血的盛衰影響黃斑的功能；其次，視錐細胞和神經節細胞在黃斑部及其周圍密度最高，神經纖維形成乳斑束連于視乳頭（目系），而肝經上連目系，因此主張從肝論治AMD。YYM經過筆者團隊不斷改進得到現有的方劑組成，經臨床使用后證實，該方有助于改善由氧化應激引起的RPE細胞凋亡，但其對于AMD的作用還有待進一步研究。

為了探究YYM對RPE細胞的氧化應激保護作用的機制，本研究通過體外細胞實驗驗證。結果顯示，H2O2造成的氧化應激降低了AREP-19細胞活力，導致細胞形態發生顯著皺縮，增加了細胞凋亡率和ROS生成，而YYM減少了H2O2對ARPE-19細胞氧化應激損傷，減少細胞皺縮，且降低了細胞凋亡和ROS的表達。康柏西普也呈現類似的緩解作用，與XIA JP等[25]的研究結果相似。且YYM聯合康柏西普使用能夠進一步降低細胞凋亡率，這表明兩者聯合或可提高治療效果。

已知康柏西普是通過抑制VEGF起到治療作用，為進一步研究YYM對RPE細胞保護的潛在機制是否也與VEGF通路相關，本研究通過Western Blot法檢測下游蛋白的表達變化。結果表明，YYM組ARPE-19細胞的磷酸化的MAPK（p38、ERK1/2、SAPK/JNK）和下游Bax、Bcl-2及Cytochrome c蛋白發生了顯著變化，提示YYM可能通過調節氧化損傷的ARPE-19細胞中的Bax、Bcl-2和Cytochrome c表達來抑制細胞凋亡，這與LIU H等[26]的研究結果相似。Cytochrome c主要以其在線粒體中的功能而聞名，是腺苷三磷酸合成生命支持功能的關鍵參與者，氧化損傷導致了ARPE-19細胞內線粒體內部存儲的細胞呼吸鏈復合物Cytochrome c的上升。然而，當細胞接受凋亡信號刺激時，Cytochrome c被釋放到細胞質中并通過細胞凋亡觸發程序性細胞死亡。Cytochrome c介導的細胞凋亡由多層調節控制，Bcl-2家族是最關鍵的參與者之一。除了在細胞凋亡中的作用外，Cytochrome c還能放大其他凋亡途徑產生的信號并參與某些非凋亡功能[27]，但這些作用的深入機制還有待進一步探究。此外，有研究[28]表明，VEGF可能通過蛋白激酶C依賴性途徑激活MAPK。康柏西普通過下調VEGF表達來抑制炎癥、血管生成和氧化反應[25]，而YYM的潛在的機制需要進一步研究。

綜上所述，本研究發現YYM能通過降低VEGF/MAPKs通路相關蛋白的表達，提高H2O2誘導RPE細胞的細胞活性，降低細胞凋亡率和ROS表達，減輕氧化應激損傷。這項研究可為YYM的臨床運用提供理論基礎，但還需要更多的臨床及分子生物學研究探討更深入的作用機制。