基于植物代謝組學和網絡藥理學分析預測雞骨草藥材的質量標志物*

徐月陽，史軍杰，彭麗華，方碧煙，陳煒璇，成金樂**

（1.廣州中醫藥大學中藥學院 廣州 510006；2.廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心/嶺南中藥資源教育部重點實驗室 廣州 510006；3.國家中成藥工程技術研究中心 南藥研發實驗室 廣州 510006；4.中山市中智藥業集團有限公司 中山 528437）

雞骨草為豆科植物廣州相思子Abrus cantoniensisHance的干燥全株，始載于《嶺南采藥錄》，別名黃頭草、黃仔強。其味甘、微苦，性涼，歸肝、胃經，具有利濕退黃、清熱解毒、疏肝止痛的功效，用于治療濕熱黃疸、脅肋不舒、胃脘脹痛、乳癰腫痛[1]等癥。雞骨草主要分布于廣東、廣西壯族自治區、福建及海南等地區，含有多種化學成分，如氨基酸、酚類、強心苷、三萜類、黃酮類、香豆素類、生物堿類、植物甾醇、多糖類等，其中生物堿類、黃酮類、三萜類是其主要化學成分[2-3]?，F代藥理研究表明，雞骨草具有抗癌、抗菌、抗氧化、促進傷口愈合、降脂保肝、增強免疫等作用[4-9]。在臨床上與其他中藥配伍還可以應用于治療慢性肝炎、黃疸型肝炎、膽囊炎、肝硬化腹水、母兒ABO血型不合[10-14]等疾病。

中藥質量標志物（Q-Marker）的概念在2016年由劉昌孝院士提出[15]，近年來，在中藥材、中藥飲片、中藥復方的研究中廣泛應用，其從傳遞與溯源、成分特有性、有效性、可測性以及復方配伍5個方面開展科學研究[16]，為中藥全程質量控制研究提供了新的研究思路。植物代謝組學是采用液質、氣質、核磁等技術方法通過對藥用植物的次生代謝產物進行分析，結合多元統計學分析方法，從整體上探討藥用植物化學成分的分布規律[17]。網絡藥理學利用大數據統計技術結合系統生物學和網絡生物學將藥物作用與生物學網絡整合，綜合分析在網絡中藥物與節點或網絡模塊的關系，具有整體性和系統性的特點，在中藥學領域中可應用于闡述中藥多成分和多靶點的網絡關系、篩選中藥的活性成分、闡述中藥藥效作用機制等[18]。

雞骨草作為藥食同源品種在民間廣泛應用，《中國藥典》2020年版中，雞骨草僅以浸出物等作為質量控制指標[1]，缺乏活性成分的含量測定指標，且目前對雞骨草的藥效物質基礎及作用機制的相關研究報道較少。因此，本研究結合中藥的Q-Marker理念，基于植物代謝組學、多元統計學、網絡藥理學相結合的方法預測雞骨草藥材的潛在Q-Marker，以期為雞骨草藥材的質量控制和藥效物質基礎研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器與軟件

M150型中藥磨粉機（金華市旋風藥材機械廠）；UPLC-QTOF-MS液質聯用系統：ACQUITY UPLC HClass型超高效液相色譜串聯Xevo G2-XS QTOF型四極桿飛行時間質譜（美國waters公司）；UNIFI Portal工作站（美國waters公司）；KQ-700DE型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204型萬分之一、MS105型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；SPSS26.0軟件（美國IBM公司）；SIMCA14.1軟件（瑞典Umetrics公司）；TBtools軟件（https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）；Openbabel 3.1.1軟件（https://openbabel.org/wiki/Main_Page）；Cytoscape 3.8.2 軟件（Cytoscape Consortium； https:// cytoscape.org/）；Pymol 2.4.0軟件（美國Schrodinger公司；https://github.com/schrodinger/pymol-open-source），AutoDock 4.2.6軟件（美國Scripps研究所；https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/）。

1.2 試劑與試樣

甲醇、乙腈（質譜級，美國默克公司）；水（屈臣氏，廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲酸（質譜級，德國默克公司）；葫蘆巴堿（純度：98%，上海源葉生物科技有限公司）；維采寧-2（批號：PS012054，純度：98.0%）；下箴刺桐堿（批號：PS000241，純度：98.0%）；異夏佛塔苷（批號：PS001083，純度：98.0%）均購自成都普思生物科技股份有限公司；相思子堿（批號：111808-202003）；夏佛塔苷（批號：111912-201703，純度：95.6%）均購自中國食品藥品鑒定研究院；實驗用11批次雞骨草藥材采集于主產地廣西壯族自治區靈山、平南等地，經中智藥業集團有限公司賈世清中藥師鑒定為豆科植物廣州相思子（Abrus cantoniensisHance），藥材來源信息詳見表1。

表1 11批次雞骨草藥材來源信息

2 方法

2.1 雞骨草藥材供試品和對照品溶液的制備

取雞骨草藥材適量，粉碎，過3號篩，精密稱取粉末1 g，置150 mL的具塞錐形瓶中，加入30%甲醇15 mL，精密稱定重量，超聲提取45 min（功率560 W，頻率40 kHz），冷卻，再稱定重量，用30%甲醇補足減失的重量，搖勻，倒入50 mL的離心管中，離心5 min（9000 r·min-1），取上清液2 mL，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

用十萬分之一電子天平精密稱取葫蘆巴堿、維采寧-2、相思子堿、下箴刺桐堿、夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品適量，分別置于10 mL的容量瓶中，后用甲醇定容至刻度線，超聲處理15 min，得對照品濃度依次為0.988 mg·mL-1、1.167 mg·mL-1、1.201 mg·mL-1、1.370 mg·mL-1、1.089 mg·mL-1、1.182 mg·mL-1的對照品儲備液，于4℃貯藏，備用。取配置好的對照品儲備溶液各1 mL于20 mL的容量瓶中，后加甲醇定容至刻度線，混勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得葫蘆巴堿濃度為49.40 μg·mL-1、維采寧-2濃度為58.35 μg·mL-1、相思子堿濃度為60.05 μg·mL-1、下箴刺桐堿濃度為68.50 μg·mL-1、夏佛塔苷濃度為54.45 μg·mL-1、異夏佛塔苷濃度為59.10 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 色譜及質譜條件

色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）色譜柱；ACQUITY UPLC柱在線過濾器；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35℃；進樣量：1 μL；流動相：乙腈（A）-0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序為：0-8 min:0%-8%（A）；8-10 min:8%-12%（A）；10-18 min:12%-19%（A）；18-20 min:19%-24%（A）；20-32 min:24%-38%（A）；32-41 min: 38%-52%（A）；41-45 min: 52%-67%（A）；45-60 min:67%-90%（A）；60-63 min:90%-0%；63-70 min:0%-0%（A）。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），毛細管電壓：3.0 kV（ESI+），離子源溫度：140℃，錐孔電壓：40 V，錐孔氣流速：50 L·h-1，脫溶劑氣溫度：450℃，脫溶劑氣流速：800 L·h-1，高能量通道碰撞電壓：20-40 eV，低能量通道碰撞電壓：6 eV，質量掃描范圍100-1200 m·z-1，采用亮氨酸-腦啡肽進行精確質量校正（[M-H]-為554.2620，[M+H]+為556.2766）。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取適量雞骨草藥材，按2.1項下供試品制備方法制備供試品溶液，并按2.2項下色譜質譜條件連續進樣6次，進行測定，計算6個已知化學成分（與對照品比對）的保留時間和響應值的RSD值分別為0.1%-0.4%和1.62%-3.35%，結果表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

精密稱取同一雞骨草樣品適量，按2.1項下供試品制備方法制備供試品溶液，平行制備6份，并按2.2項下色譜質譜條件進行測定，計算6個已知化學成分（與對照品比對）的保留時間和響應值的RSD值分別為0.11%-0.13%和1.75%-5.24%，結果表明該方法的重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗

取適量雞骨草藥材，按2.1項下供試品制備方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h下按2.2項下色譜質譜條件進行測定，計算6個已知化學成分（與對照品比對）的保留時間和響應值的RSD值分別為0.61%-1.22%和2.31%-4.99%，結果表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.4 雞骨草化合物鑒定解析

2.4.1 雞骨草化合物的檢索和整理

利用中國知網（https://www.cnki.net/）、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SciFinder（https://scifinder-n.cas.org/）、PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、ChemSpider（http://www.chemspider.com/）等網站檢索雞骨草化學成分研究的相關文獻，收集文獻中有關雞骨草化學成分的分子式、CAS號、化學名等信息匯總到Excel表格中，共103個化合物信息。登錄SciFinder網站，根據收集到的有關雞骨草化學成分的CAS號檢索化學成分的結構式，下載結構式的mol文件格式，將化學成分Excel信息表和結構式文件放入同一個文件夾中導入UNIFI軟件中，補充UNIFI軟件本地中藥數據庫的雞骨草化學成分信息。

2.4.2 11批次雞骨草藥材化學成分的鑒定分析

按照“2.2”項下的色譜質譜條件進樣后，得到11批次雞骨草藥材樣品的質譜數據，后將質譜數據通過UNIFI軟件處理，與文獻收集的成分和本地雞骨草數據庫化學成分信息比對，設置鑒定參數為響應值≥5000，質量差≤5 ppm，并進一步通過對照品及文獻報道數據比對精確分子質量、特征碎片離子、保留時間等信息進行鑒定。將所鑒定的成分結果導出并匯總到Excel表中，通過分析11批次雞骨草藥材的化學成分，篩選得到共有成分。為了比較不同批次間所含共有成分的含量差異，利用TBtools軟件根據其響應值對成分進行熱圖分析。

2.5 多元統計學分析

利用SPSS26.0軟件，以11批次雞骨草藥材中共有成分的響應值為變量，對數據進行標準化處理，選用Ward聯結法作為聚類方法，以平方歐式距離計算測量區間，進行聚類分析。利用SIMCA14.1軟件，以11批次雞骨草藥材中共有成分的響應值為變量進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA），找出造成雞骨草藥材分類的主要含量差異成分。

2.6 網絡藥理學研究

2.6.1 活性成分篩選及靶點預測

通過PubChem網站查詢上述主要含量差異成分的smiles號，將smiles號輸入Swiss ADME數據庫（http://www.swissadme.ch/）中以判斷其是否具有活性，以胃腸道吸收（GI absorption）顯示為“High”，類藥性（Druglikeness）項下的5個參數（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）至少滿足兩個“Yes”為標準篩選出符合條件的潛在活性成分。將潛在活性成分的smiles號輸入Swiss Target Prediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）中設置物種為“Homo sapiens”進行預測，以表格中“Probability＞0”作為篩選標準預測化合物的靶點信息。

2.6.2 “含量差異潛在活性成分-潛在靶點”網絡圖的構建

在Excel表中整理11批次雞骨草藥材中含量差異潛在活性成分和潛在靶點的網絡信息表及類型表，導入Cytoscape 3.8.2軟件進行繪制“含量差異潛在活性成分-潛在靶點”的網絡圖。

2.6.3 蛋白質與蛋白質互作網絡分析（Protein-Protein Interaction，PPI）及核心靶點篩選

為了進一步篩選出核心靶點，在STRING數據庫（https://www.string-db.org/）中導入上述潛在靶點信息的基因名，物種選擇“Homo sapiens”，將獲得的PPI數據下載其信息文件后導入Cytoscape 3.8.2軟件進行繪制PPI圖，使用軟件工具中的“Analyze Network”分析其拓撲參數，下載信息表并用Excel表處理，計算靶點信息的Degree值和Betweenness Centrality（中介中心性）值的中位數，以同時滿足大于等于兩者2倍中位數為標準篩選出核心靶點。

2.6.4 核心靶點的基因本體（Gene ontology，GO）功能富集分析與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

在Metascape數據庫（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）中上傳核心靶點的基因名，物種選擇“H.sapiens”，點擊“Custom Analysis”，在“Enrichment”界面分別進行GO分析和KEGG分析，點擊Analysis Report Page，下載所有的注釋結果（All in One Zip），根據所得結果繪制GO分析柱狀圖及KEGG分析氣泡圖。

2.6.5 “核心成分-核心靶點-核心通路”網絡圖的構建

篩選出富集核心靶點蛋白較多的前20條信號通路，在Excel表中整理核心靶點相關的前20條核心通路和涉及相關核心成分的網絡信息表及類型表，導入Cytoscape 3.8.2軟件進行繪制“核心成分-核心靶點-核心通路”的網絡圖。

2.6.6 分子對接驗證

以上述“核心成分-核心靶點-核心通路”網絡圖中Degree值排名靠前的兩個核心成分為配體，在PubChem網站中下載其3D結構的sdf文件格式，并在Openbabel 3.1.1軟件中轉換sdf格式為pdb格式。以網絡圖中Degree值排名前五的核心靶點作為受體，并在RCSB PDB網站（https://www.rcsb.org/）中下載核心靶點蛋白3D結構的pdb文件。利用Pymol 2.4.0軟件對核心靶點蛋白進行去水、去配體處理，用AutoDock 4.2.6軟件對配體和處理過的受體進行加氫、加電荷等操作，并進行分子對接，以獲得最佳活性位點，得到配體與受體的結合能。并將2個核心成分最優結合模式的對接結果導入Pymol 2.4.0軟件，繪制成三維圖進行可視化展示。

3 結果

3.1 雞骨草化學成分分析

通過對11批次雞骨草藥材的質譜數據進行鑒定分析，將所鑒定的成分結果導出并匯總到Excel表中，篩選得到39個共有成分，以ACH1樣品為例，總離子流圖見圖1，共有化學成分鑒定結果詳見表2，分別為17個三萜皂苷類、10個黃酮類、3個異黃烷醌類、2個生物堿類、2個色原酮類、2個醇類、1個氨基酸類、1個蒽醌類、1個三萜類成分。通過熱圖分析（見圖2），圖中顏色越深表示響應值越大，從圖中看出Soyasaponin I、Quebrachitol、Abrine、Isoschaftoside、Isobiflorin、Hypaphorine、Schaftoside、Biflorin、Arginine這9個化學成分在不同批次間成分含量均較高。

圖1 雞骨草ACH1樣品的UPLC-Q-TOF-MSE總離子流圖

圖2 11批次雞骨草藥材中39個共有成分的熱圖分析

表2 11批次雞骨草藥材的共有成分

3.2 多元統計學分析

3.2.1 聚類分析

利用SPSS26.0軟件，以11批次雞骨草藥材中39個共有成分的響應值為變量進行聚類分析，結果見圖3，當平方歐式距離為15時，11批次雞骨草樣品被分為4類，ACH1、2、3、4聚為一類，ACH5為一類，ACH6、9、10、11聚為一類。ACH7、8聚為一類，說明不同來源雞骨草藥材之間存在一定的差異。

圖3 11批次雞骨草藥材的聚類分析圖

3.2.2 主成分分析和正交偏最小二乘判別分析

利用SIMCA14.1軟件，以11批次雞骨草藥材中39個共有成分的響應值為變量進行主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，結果見圖4和圖5所示，圖中不同顏色的圓點代表不同產地的雞骨草藥材，主成分分析計算結果顯示4個主成分的累計貢獻率為83.7%，且從圖中看出可以將11批次雞骨草藥材分為4類，ACH1、2、3、4為一類，ACH5為一類，ACH6、9、10、11為一類。ACH7、8為一類，分類結果與聚類分析結果相一致。為進一步找出造成分類差異的因素，進行正交偏最小二乘判別分析，模型的主成分回歸系數Q2Y＝0.628＞0.5，說明模型的預測能力較強，反映樣本具明確分離的趨勢；R2Y＝0.919，說明模型對因變量變異貢獻的百分比為91.9%，模型的擬合度較好，對建立的模型進行200次的置換檢驗，得到Q2回歸線的截距為負值（見圖6），表明所構建的OPLS-DA模型具有較好的預測能力及有效可用。從OPLS-DA圖中提取重要性變量的VIP（Variable Importance for the Projection）值，結果見圖7，對其變量的VIP值進行排序，顯示化學成分Quebrachitol（2.335 98）、Arginine（2.209 89）、Abrine（1.997 67）、Isobiflorin（1.925 93）、SoyasaponinⅠ（1.809 06）、Hypaphorine（1.759 42）、Isoschaftoside（1.668 29）、Biflorin（1.579 85）、Schaftoside（1.532 21）的VIP值大于1，結合上述熱圖分析結果表明雞骨草藥材中以上9個化學成分的含量差異是影響11批次雞骨草藥材分類的主要因素。

圖4 11批次雞骨草藥材PCA-X得分圖

圖5 11批次雞骨草藥材OPLS-DA得分圖

圖6 OPLS-DA模型的排列檢驗圖

圖7 11批次雞骨草藥材共有成分的VIP得分圖

3.3 含量差異成分的活性篩選與靶點預測

利用Swiss ADME數據庫以判斷上述9個含量差異成分是否具有活性，結果這9個化合物均為潛在活性成分。通過Swiss Target Prediction數據庫預測這9個潛在活性成分的靶點信息，預測出的靶點刪除重復值后共得到166個靶點信息。

3.4 含量差異潛在活性成分的“成分-靶點”網絡圖的構建

將9個潛在活性成分及166個潛在靶點分別導入Cytoscape 3.8.2軟件中，構建“含量差異潛在活性成分-潛在靶點”網絡圖如圖8所示，并進行“Analyze Network”分析其拓撲參數，圖中共產生了175個節點，223條邊，其中紅色代表活性成分，藍色代表靶點基因。每個成分作用于多個靶點，每個靶點平均作用于2個成分，存在多成分多靶點相互作用的現象。網絡圖中的節點以度值（Degree）計算，Degree值表示網絡中節點與靶點相連的邊數，Degree值越大，其節點形狀越大，顏色越深，進一步說明該節點在網絡圖中的作用大。從圖中看出Hypaphorine（degree 103）、Abrine（degree 71）這2個成分作用的靶點多，影響大。

圖8 “含量差異潛在活性成分-潛在靶點”網絡圖

3.5 蛋白互作PPI網絡構建及核心靶點篩選

將上述9個潛在活性成分的166個潛在靶點信息的基因名導入STRING數據庫中進行PPI分析，結果獲得159個靶點的蛋白質互作信息，下載其信息文件后導入Cytoscape 3.8.2軟件進行繪制PPI圖，通過分析其拓撲參數，以同時滿足大于等于靶點信息的Degree值和Betweenness Centrality值的中位數的2倍為標準篩選出核心靶點，結果見圖9，共篩選出29個核心靶點（見表3）。

圖9 蛋白質與蛋白質互作核心靶點篩選圖

表3 29個核心靶點信息

3.6 GO功能和KEGG通路分析結果

利用Metascape數據庫對29個核心靶點進行GO分析和KEGG分析，GO分析包括生物過程（Biological process，BP）、細胞組分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）3個部分，GO分析共富集480個條目，其中BP有368個條目，主要富集在血管發育、細胞激活、細胞分化的負調控、正向調節轉移酶活性等過程，CC有61個條目，主要富集在膜筏、膜微區、突觸膜等區域，MF有51個條目，主要富集在蛋白激酶結合、核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等功能，分別選取BP、CC、MF的LogP值最小的排名前10的條目繪制柱狀圖（見圖10）。KEGG分析共富集了86條通路，主要涉及的通路有癌癥通路（Pathways in cancer）、血脂和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、肺小細胞癌（Small cell lung cancer）、軸突引導（Axon guidance）、糖尿病并發癥AGR受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等，通過Excel表處理選取LogP值最小的排名前20的核心通路并繪制氣泡圖（見圖11），結果表明，雞骨草藥材中的化學成分通過作用于多靶點進而調控多條通路從而發揮治病療效。

圖10 GO功能富集分析柱狀圖

圖11 KEGG通路富集分析氣泡圖

3.7 雞骨草“核心成分-核心靶點-核心通路”網絡分析

將29個核心靶點相關的前20條核心通路和涉及的4個核心成分分別導入Cytoscape 3.8.2 軟件進行繪制“核心成分-核心靶點-核心通路”的網絡圖，結果見圖12，圓形代表核心成分，菱形代表靶點，V形代表通路，共有53個節點，178條邊，并進行“Analyze Network”分析其拓撲參數，結果顯示，Degree值較大的前兩個成分為Hypaphorine（degree 17）、Abrine（degree 12），前兩個靶點為PIK3CA（degree 20）、JUN（degree 13）、前兩個通路為Pathways in cancer（degree 15）、Lipid and atherosclerosis（degree 10）。雞骨草具有清熱解毒的功效，清熱解毒類中藥大多具有抗腫瘤的作用[19]，通過提取主要的節點網絡圖發現（見圖13），Hypaphorine通過作用于PIK3CA、ITGB1、PTGS2、MMP9、PPARG、CXCL8、RHOA靶點及Abrine作用于CTNNB1、CDK2、NOS2靶點進而對癌癥通路產生作用，從而發揮雞骨草清熱解毒的功效。Hypaphorine還通過作用于PIK3CA、ITGB1靶點及Abrine作用于CDK2靶點進而對PI3K-Akt信號通路產生作用。PI3K-Akt信號通路參與調控細胞的基本進程，其中包括細胞的生長、轉錄、翻譯、增殖及糖原代謝等，相關研究表明PI3K-Akt信號通路在癌癥如胰腺癌[20]、胃癌[21-22]、肝癌[23]、宮頸癌[24]等，糖脂代謝[25-26]，帕金森癥[27]，肌少-骨質疏松癥[28]等發揮重要作用。并且從圖12中顯示Hypaphorine作用于PIK3CA、CXCL8、MMP9靶點及Abrine作用于CDK2靶點也對乙型肝炎信號通路產生作用，結合雞骨草疏肝止痛的功效作用進一步說明下箴刺桐堿（Hypaphorine）和相思子堿（Abrine）為雞骨草藥材的主要活性成分。

圖12 “核心成分-核心靶點-核心通路”網絡圖

圖13 核心網絡圖

3.8 分子對接結果

以上述核心網絡圖中相思子堿和下箴刺桐堿為配體，核心靶點PIK3CA、JUN、RHOA、ITGB1、CTNNB1為受體，將這2個核心成分與5個核心靶點進行分子對接，結果見表4，根據文獻研究表明[29]，結合能＜0表示配體和靶點蛋白能自發進行結合，結合能≤-4.0 kcal·mol-1表示配體和靶點蛋白具有較好的結合活性，數值越低結合強度越大。相思子堿與核心靶點RHOA、ITGB1及下箴刺桐堿與核心靶點RHOA、ITGB1、JUN的結合能均小于-4.0 kcal·mol-1，使用Pymol 2.4.0軟件對相思子堿和下箴刺桐堿與核心靶點蛋白RHOA得到的最優結合模式進行可視化處理，結果見圖14，表明雞骨草藥材中相思子堿和下箴刺桐堿具有較好的生物活性。

圖14 成分與靶點分子對接圖

表4 成分與核心靶點蛋白的結合能

4 Q-Marker的預測分析

本研究通過對11批次雞骨草藥材的共有成分進行多元統計學分析，獲得了造成多批次雞骨草藥材分類的主要含量差異性成分，并進行網絡藥理學分析，建立“核心成分-核心靶點-核心通路”的網絡圖，大豆皂苷I（Soyasaponin Ⅰ）為豆科植物中常見的化學成分[30]，精氨酸（Arginine）在植物中廣泛存在均不易作為雞骨草藥材的Q-marker。根據度值的大小，相思子堿和下箴刺桐堿在網絡圖中起主要作用，且通過液質分析表明11批次雞骨草藥材中相思子堿和下箴刺桐堿的響應值均較高，為不同來源11批次雞骨草藥材所共有，這兩個成分通過作用靶點進而對與雞骨草藥材清熱解毒、疏肝止痛功效相關的通路產生作用。并根據Q-Marker理念中的可測性、有效性結合文獻研究對這2個化合物進行分析，黃平等[31]采用反相高效液相色譜法，色譜柱選用Kromasil C18，以甲醇-乙腈-水-冰醋酸-三乙胺為流動相，檢測波長為220 nm，流速為1.0 mL·min-1，建立了雞骨草中相思子堿和下箴刺桐堿的含量測定方法。徐柯心等[32]采用超高效液相色譜法，選用色譜柱為HSS T3柱，以乙腈-0.2%甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長為270 nm，建立了能同時測定雞骨草中相思子堿和下箴刺桐堿的含量測定方法，體現了所預測的雞骨草藥材Q-Marker的可測性。鐘正賢等[33]、陳學芬等[34]將雞骨草提取物中分離出的相思子堿和下箴刺桐堿分別作用于小鼠耳廓腫脹、小鼠肝損傷及黃疸小鼠模型，結果表明相思子堿和下箴刺桐堿均能明顯減少小鼠耳廓腫脹的重量，能降低肝損傷小鼠和黃疸小鼠模型血清中的總膽紅素含量及轉氨酶活性，還通過測定其對小鼠溶血素抗體生成的影響，發現相思子堿和下箴刺桐堿均能增加免疫器官胸腺、脾臟的重量，表明相思子堿和下箴刺桐堿具有抗炎、退黃降酶、抗肝損傷及免疫增強的作用，體現了所預測的雞骨草藥材Q-Marker的有效性。以上文獻研究為所預測雞骨草藥材的Q-Marker提供了有利依據，也進一步表明所預測雞骨草藥材Q-Marker的合理性。

5 討論

中藥質量是中醫藥產業健康發展的生命線，中藥質量的好壞在中醫發揮臨床療效的方面至關重要，中藥作為天然產品，其質量受諸多因素的影響。因此，為保證生產出質量優良且療效穩定的中藥品種，需要建立科學的質量評價體系，中藥質量標志物（QMarker）的提出，為中藥的質量標準和質量控制研究提供了新的科研思路。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS方法分析11批次雞骨草藥材的化學成分，獲得39個共有成分，主要為三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類成分。雞骨草中皂苷類成分具有抗肝癌、抗乙型病毒性肝炎、保護化學性及免疫性肝損傷等[35-37]作用，黃酮類成分具有抗氧化、保護肝損傷、防治胃潰瘍等[38-40]作用，生物堿類成分具有抗炎、退黃降酶、抗肝損傷及免疫增強的作用[33-34]。以共有成分作為Q-Marker的備選成分，先以共有成分的響應值為變量進行多元統計學分析，初步篩選出影響多批次雞骨草藥材分類的主要9個化學成分，且這9個化學成分在雞骨草藥材中的含量均較高選為QMarker的候選化學成分，后進一步通過網絡藥理學結合文獻研究預測相思子堿和下箴刺桐堿為雞骨草藥材的Q-Marker。Q-Marker相思子堿和下箴刺桐堿，均具有抗炎、退黃降酶、抗肝損傷及免疫增強的作用。

核心靶點PIK3CA、JUN、RHOA、ITGB1、CTNNB1與雞骨草Q-Marker抗炎、免疫調節、抗腫瘤、抗肝癌作用等相關。核心靶點PIK3R1與癌癥、免疫缺陷、發育障礙有關[41]，CTNNB1與結直腸癌、肝細胞癌、卵巢癌相關，JUN與惡性腫瘤相關，RHOA與腫瘤細胞的增殖和轉移相關，ITGB1與促進膠質瘤細胞增殖、食管癌相關[42-43]。分子對接驗證了雞骨草Q-Marker與核心靶點PIK3CA、JUN、RHOA、ITGB1、CTNNB1均能自發進行結合，并與RHOA、ITGB1有較好的結合活性，理論上證實了Q-Marker較好的生物活性，且這些核心靶點作用于與雞骨草藥材清熱解毒功效相關的主要核心通路癌癥通路（Pathways in cancer）。基因本體富集分析中生物過程主要涉及細胞激活、細胞分化的負調控、正向調節轉移酶活性等；分子功能涉及蛋白激酶結合，配體激活的轉錄因子活性等；細胞組成主要為膜筏、膜微區、突觸膜等。由此可知核心靶點、核心通路、Q-Marker存在緊密的相關性，后期可在本研究的基礎上進一步結合實驗研究證明其關聯性。

本研究首次結合植物代謝組學、多元統計學和網絡藥理學從化學、數理統計和生物信息學的角度預測分析了雞骨草藥材的Q-Marker，后結合文獻證明其合理性，為雞骨草藥材及相關制劑的質量標準提升和質量控制研究提供了科學依據。通過網絡藥理學分析結果所獲得的靶點和通路，可為后續雞骨草藥材的藥效和藥理作用機制研究提供參考。