膿毒癥與中性粒細胞功能

楊雪媛 郝東

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，濱州 256600

膿毒癥被定義為宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙。雖然現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)發(fā)展迅速，對膿毒癥的病理生理認識有了顯著增加，但是目前除了抗感染和支持治療，尚無特效治療方法［1］。由于膿毒癥晚期免疫細胞大量損傷死亡，導(dǎo)致免疫功能缺損或抑制，最后因器官衰竭和感染死亡。中性粒細胞占人類所有白細胞的50%～70%，是最早到達感染部位的細胞，是抵御感染的第一道防線的重要組成部分。膿毒癥期間中性粒細胞的失調(diào)激活會影響其功能，包括遷移、吞噬、脫顆粒、活性氧和細胞因子的產(chǎn)生、中性粒細胞胞外陷阱（NETs）等［2］，所以評估膿毒癥如何影響中性粒細胞功能的病理生理有助于發(fā)現(xiàn)治療膿毒癥的新策略。

中性粒細胞遷移受損

1.骨髓中性細胞的釋放

生理狀態(tài)下，中性粒細胞的產(chǎn)生和釋放都受到嚴格的控制，只有1%～2%被釋放到循環(huán)中［3］，中粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）刺激中性粒細胞的增殖、分化和活化。中性粒細胞的釋放受到半胱氨酸-X-半胱氨酸趨化因子（cysteine-X-cysteine chemokine，CXC趨化因子）及其受體的嚴格控制，其中CXC趨化因子配體（CXC chemokine ligand，CXCL）12與CXC趨化受體（CXC chemokine receptor type，CXCR）4型介導(dǎo)中性粒保留在骨髓中，CXCL1/2與CXCR2介導(dǎo)中性粒細胞從骨髓中釋放，但是膿毒癥時骨髓CXCL12的表達下調(diào)，而CXCL1的表達增加，促進中性粒細胞從骨髓到外周循環(huán)的動員［4］。若膿毒癥持續(xù)存在，循環(huán)中甚至可以出現(xiàn)中性粒細胞祖細胞，導(dǎo)致中性粒細胞“骨髓衰竭”，患者免疫功能受損，加重組織和器官損傷。

2.變形性和黏附作用的改變

中性粒細胞變形性是遷移和滾動的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮表達的E-選擇素和P-選擇素與中性粒細胞表達的L-選擇素相互作用，L-選擇素在中性粒細胞表面組成型表達并介導(dǎo)低親和力黏附作用，中性粒細胞也表達出相對高水平的β整合素，細菌產(chǎn)物等可以上調(diào)其表達來響應(yīng)炎癥［5-6］。膿毒癥時產(chǎn)生的細菌產(chǎn)物和促炎因子促進L-選擇素的脫落并刺激中性粒細胞表面β整合素的表達，β整合素和血管內(nèi)皮上的細胞間黏附分子-1和血管細胞黏附分子-1相互作用，介導(dǎo)與內(nèi)皮細胞的高親和力黏附作用［4，7］。膿毒癥時促炎介質(zhì)如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α也可以通過刺激過氧化物酶增殖體激活受體γ（peroxidase proliferators activate receptor γ，PPAR-γ）介導(dǎo)f肌動蛋白（細胞骨架的主要構(gòu)成成分）累積，降低細胞的變形性［8］。由于變形性的降低和高親和力的黏附作用，中性粒細胞被阻隔在毛細血管床中導(dǎo)致血管閉塞加重，加劇組織缺血和器官功能障礙。

3.跨內(nèi)皮遷移

甲酰甲硫酰基-亮酰基-苯丙氨酸（formylmethanesulfoyl-leucoyl-phenylalanine，fMLP）、血小板活化因子C5a、白三烯B4、白細胞介素（IL）8等與中性粒細胞表達的趨化因子受體結(jié)合介導(dǎo)中性粒細胞的定向遷移或趨化［3，9］。大多數(shù)趨化因子屬于CC和CXC趨化因子亞家族，中性粒細胞表達CXCR1和CXCR2并對CXC趨化因子反應(yīng)［10］。一些研究表明，膿毒癥期間中性粒細胞遷移受損與循環(huán)中性粒細胞CXCR2表達下降有關(guān)，趨化因子長期或反復(fù)刺激配體激活G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCR），將GPCR激酶（G protein-coupled receptor kinase，GRK）募集到細胞膜上，隨后GPCR C末端的GRK磷酸化導(dǎo)致趨化因子以β-逮捕素和網(wǎng)格蛋白依賴性方式脫敏［11-12］。脂多糖（LPS）、磷壁酸和Toll樣受體（TLR）2、4、9上調(diào)CRK2的表達來誘導(dǎo)CXCR2的內(nèi)化［3，12］。一氧化氮（NO）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）可以導(dǎo)致中性粒細胞遷移受損。膿毒癥時NO的增加會觸發(fā)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的活化、蛋白激酶G磷酸化和環(huán)磷酸鳥苷形成，誘導(dǎo)中性粒細胞GRK2的表達，促進CXCR2的內(nèi)化［3］。磷酸肌醇3-激酶γ（phosphoinositide 3-kinase gamma，PI3Kγ）信號通路被認為參與iNOS的二聚，Martin等［13］的實驗證明膿毒癥PI3Kγ-/-存活小鼠的CXCR2表達增加，GRK2表達降低，體外結(jié)果還證實，與CXCL2一起孵育的PI3Kγ-/-中性粒細胞顯示CXCR2的內(nèi)化降低，由此可見PI3K負調(diào)控CXCR2內(nèi)化。中性粒細胞可以表達PPAR-γ，Reddy等［14］的研究證明PPAR-γ在中性粒細胞遷移中通過下調(diào)fMLP誘導(dǎo)的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1/2（extracellular signal-regulated kinase-1/2，ERK-1/2）絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活起到負調(diào)控作用。

細胞內(nèi)抗菌性

LPS、脂蛋白、脂磷壁酸等均可以通過病原體相關(guān)分子模式與中性粒細胞上的TLR相互作用，識別并吞噬病原體，然后在吞噬溶酶體中將其消滅。中性細胞的抗菌活性主要有2個來源：（1）氧依賴途徑。還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴性氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生超氧自由基以及其他次級衍生的活性氧。中性粒細胞受到刺激后，在吞噬體膜上組裝完成NADPH，活性氧酶復(fù)合物將電子從NADPH上跨膜輸送到電子受體分子氧，產(chǎn)生超氧離子和活性氧，在吞噬體中代謝為高度殺菌的最終產(chǎn)物，例如羥基自由基、過氧化氫和次氯酸等［15］。活性氧可以上調(diào)細胞因子及黏附分子的表達，該過程中，中性粒細胞耗氧量激增，可以達到正常值2～20倍，稱為呼吸爆發(fā)［16］。（2）非氧依賴途徑。主要是細胞內(nèi)脫顆粒，中性粒細胞有4種胞漿顆粒：嗜天青顆粒、特異性顆粒、三級顆粒和分泌囊泡，顆粒中富含蛋白質(zhì)，中性粒細胞誘導(dǎo)顆粒與吞噬體融合以消滅病原體［17］。在膿毒癥時，炎癥持續(xù)存在過度激活中性粒細胞生成大量活性氧，呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的大量自由基損害線粒體功能，導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡，對全身血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生損害。

NETs

中性粒細胞也可以釋放NETs來消滅病原體的DNA和抗菌蛋白網(wǎng)［18］。NET由中性粒細胞主動排出DNA、染色質(zhì)和顆粒蛋白形成的原纖維組成，含有來自嗜氮顆粒的蛋白酶，例如中性粒細胞彈性蛋白酶、髓過氧化物酶和組織蛋白酶G；來自二級顆粒和三級顆粒的蛋白質(zhì)，例如乳鐵蛋白和明膠酶以及核蛋白［19］。NETosis是一種導(dǎo)致中性粒細胞NETs主動釋放的細胞死亡方式，這種形式的細胞死亡依賴于NADPH氧化酶復(fù)合物，可通過蛋白激酶C方式誘發(fā)［20］。但Yipp等［21］研究數(shù)據(jù)表明，NETosis形成不一定導(dǎo)致中性粒細胞死亡。目前認為，NETosis有2種形式：（1）自殺性NETosis（suicidal NETosis）。細胞被裂解，脫縮的染色質(zhì)參與構(gòu)成的NETs被釋放。（2）存活的NETosis（vital NETosis）。含有核DNA的囊泡通過出芽的方式釋放NETs，細胞仍保持著完整性并具有正常的功能［20］。NETs能捕獲微生物、限制微生物生長和抑制其散播，但膿毒癥期間過度的NETosis誘導(dǎo)組織損傷及血栓形成［22］。NETs成分都被發(fā)現(xiàn)有促凝血的活性，如游離DNA可以激活內(nèi)源性凝血系統(tǒng)，組蛋白可以通過血小板TLR2和TLR4相互作用直接誘導(dǎo)血小板聚集、誘導(dǎo)凝血酶的產(chǎn)生以及抑制抗凝血途徑［23-24］。NETs黏附在血管內(nèi)皮，以組蛋白和髓過氧化物酶依賴性的方式導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和器官損害，此外，組蛋白可以與損傷相關(guān)分子模式相互作用，通過髓系分化初級反應(yīng)基因88信號傳導(dǎo)通路促進促炎因子的產(chǎn)生［3］。在膿毒癥時，體內(nèi)各部位的中性粒細胞都可以產(chǎn)生NET，組蛋白的釋放導(dǎo)致內(nèi)皮細胞空泡化，導(dǎo)致肺泡內(nèi)出血和其他組織損傷。

中性粒細胞死亡失調(diào)

1.凋亡

凋亡細胞被巨噬細胞吞噬以限制炎性反應(yīng)，目前認為細胞凋亡有2條途徑：（1）外在途徑。由TNF家族的細胞外死亡配體信號與特定細胞表面的TNF受體相互作用介導(dǎo)的；（2）內(nèi)在途徑。細胞受到刺激，線粒體內(nèi)部細胞色素c釋放到細胞質(zhì)中，激活半胱天冬酶形成凋亡體切割DNA和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白［25］。中性粒細胞表達的髓系細胞白血病-1因子（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）、B細胞淋巴瘤因子（B-cell lymphoma-extra large，Bcl-xL），膜聯(lián)蛋白A1，Bak均是Bcl-2家族抗凋亡因子，從膿毒癥患者分離的中性粒細胞檢測到MCL-1水平升高，MCL-1的累積可防止線粒體內(nèi)膜釋放細胞色素c以及細胞凋亡誘導(dǎo)因子。因此，MCL-1是通過保護線粒體跨膜點位來調(diào)節(jié)內(nèi)在凋亡途徑的［25-26］。在膿毒癥期間，外周循環(huán)中LPS和補體C5a等促炎介質(zhì)可以誘導(dǎo)ERK-1/2和磷酸肌醇-3激酶活化，進一步誘導(dǎo)AKT磷酸化和隨后的Bad磷酸化，抑制線粒體釋放細胞色素c，從而抑制凋亡體形成；LPS還可以使髓系核分化抗原的重新定位和切割受損，并防止MCL-1的蛋白酶體降解，從而致使中性粒細胞凋亡延遲［3］。Li等［27］的研究表明，膿毒癥中由糖酵解酶丙酮酸激酶M2介導(dǎo)中性粒細胞程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）上調(diào)來拮抗中性粒細胞凋亡，此外半胱天冬酶3、9的抑制以及CD24的下調(diào)均參與了細胞凋亡的抑制。中性粒細胞的累積有利于病原體的清除，但大量中性粒細胞長期浸潤會導(dǎo)致持續(xù)的組織損傷。

2.焦亡

焦亡是半胱天冬酶依賴性的調(diào)節(jié)性細胞死亡方式，目前認為焦亡主要有2種途徑：（1）半胱天冬酶-1依賴性經(jīng)典途徑。細胞內(nèi)Nod樣受體家族識別病原體和其他的信號，例如炎性小體，通過銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）與半胱天冬酶-1原結(jié)合激活酪蛋白酶-1，被激活的半胱天冬酶-1切割促炎因子gasdermin D（GSDMD），GSDMD的N端和細胞膜上的磷脂酰肌醇結(jié)合形成“gasdermin通道”釋放內(nèi)容物誘導(dǎo)炎癥，活化的半胱天冬酶-1也可以切割前IL-1β和原IL-18轉(zhuǎn)換為IL-1β和IL-18誘導(dǎo)炎癥。（2）半胱天冬酶-4/5/11依賴性非經(jīng)典途徑。LPS的脂質(zhì)A可以直接與半胱天冬酶活化的N端結(jié)合，并結(jié)合半胱天冬酶4/5/11的募集結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)其寡聚化，被激活的半胱天冬酶4/5/11裂解GSDMD并誘導(dǎo)其焦亡，同時誘導(dǎo)半胱天冬酶-1裂解IL-1β和原IL-8轉(zhuǎn)換為IL-1β和IL-8［28-29］。中性粒細胞焦亡后，大部分受損的細胞器與細胞骨架和細胞殘體聯(lián)系在一起形成孔誘導(dǎo)的細胞內(nèi)陷阱，將細菌留在細胞殘體內(nèi)進行二次吞噬殺傷或者募集中性粒細胞釋放活性氧進行殺傷［30-31］。但是Chen等［32］的研究表明，中性粒細胞和經(jīng)典炎癥小體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白ASC中的半胱天冬酶-1低表達，GSDMD不能被有效切割，導(dǎo)致中性粒細胞不依賴經(jīng)典途經(jīng)的局灶性死亡，但是該過程釋放IL-1β，會招募更多中性粒細胞。當宿主被病原體感染時就會有焦亡發(fā)生，細胞膜破裂以及促炎因子的釋放阻斷病原體的復(fù)制并招募免疫細胞消滅病原體，但是過度的焦亡會產(chǎn)生過多的促炎因子，引起失控的炎性反應(yīng)，加速膿毒癥的進程。

3.自噬

自噬是由自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related protein，ATG）調(diào)控的自我降解的過程。自噬對中性粒細胞起雙向調(diào)節(jié)作用，其一，中性粒細胞自噬體形成后與溶酶體融合分解清除胞內(nèi)壞死物質(zhì)，維持中性粒細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下的生存；其二，自噬體也可以激活凋亡蛋白加速細胞死亡［33］。膿毒癥時可以有多個靶點來誘導(dǎo)自噬，例如LPS與TLR4結(jié)合通過MAPK/p38信號軸激活自噬；LPS也可以通過影響核因子κB來激活自噬；而磷脂壁酸與TLR2結(jié)合通過MAPK1/ERK-2-MAPK3/ERK-1途徑誘導(dǎo)自噬［28，34］。由研究發(fā)現(xiàn)自噬和NET誘導(dǎo)與PI3K-AKT-mTOR軸相連，阻斷自噬體形成的PI3K Ⅲ型信號通路可以抑制NETs形成，敲除ATG5的基因會導(dǎo)致自噬缺陷，但不會導(dǎo)致NETs形成缺損，由此推斷自噬不是NETs形成的必要條件［25］。另一項研究發(fā)現(xiàn)，LPS干預(yù)的自噬缺陷中性粒細胞會導(dǎo)致其遷移抑制因子分泌增加并加重炎癥［35］。自噬是機體應(yīng)激反應(yīng)的一部分，可以通過減少細胞因子的釋放控制炎癥，但是自噬紊亂會導(dǎo)致炎癥失控。

總結(jié)與展望

膿毒癥早期，中性粒細胞動員增加并凋亡受損，導(dǎo)致其在循環(huán)中大量累積，到膿毒癥晚期，大量幼稚中性粒細胞釋放到循環(huán)中導(dǎo)致骨髓耗竭，且幼稚的細胞無法有效清除病原體，加之中性粒細胞遷移受損，致使無法有效控制感染。此外，中性粒細胞死亡失衡導(dǎo)致組織損傷和器官衰竭進一步加重。在多種機制的共同作用下，膿毒癥患者免疫系統(tǒng)受到抑制，血栓形成增加甚至出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血。因此，探索中性粒細胞在膿毒癥中的功能的病理生理有助于找到治療的新靶點。有研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥中髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCS）上調(diào)以及幼稚中性粒細胞增多會導(dǎo)致免疫抑制［36］。Wang等［37］研究表明，中性粒細胞上程序性死亡配體-1（PD-L1）表達增加加速細胞凋亡，以驅(qū)動肺損傷并增加臨床和實驗中敗血癥的病死率，所以抑制MDSCS的表達和促進細胞成熟及釋放以及抗PD-1/PD-L1抗體治療可以改善膿毒癥者預(yù)后。此外GM-CSF、G-CSF也開展了臨床試驗，這些治療手段都已經(jīng)取得了不錯的效果。

作者貢獻聲明楊雪媛：起草文章；郝東：對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)