云南松松塔抗HIV 活性提取物對人冠狀病毒229E抑制活性的研究

李亞飛，尚方建，羅春雨，石哲芳，劉 奇

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000；3.首都醫科大學附屬北京兒童醫院保定醫院，河北保定 071000）

新型冠狀病毒在全球范圍的傳播引起了科研人員對冠狀病毒（coronavirus，CoV）新一輪的研究熱潮。冠狀病毒亞科分為α、β、γ、δ 4 個屬，β 屬由A、B、C、D 4 個亞群組成〔1〕。至今為止，科研人員先后從患者體內發現了7 種可引起人類患病的人冠狀病毒（human coronavirus，HCoV），分別為α 屬的HCoV-229E 和HCoV-NL63，A 亞群的HCoV-OC43和HCoV-HKU1，B 亞群的SARS-CoV 和SARSCoV-2，C 亞群的中東呼吸綜合征病毒〔1-2〕。普通冠狀病毒229E、OC43 和NL63 能引起人上呼吸道感染，是導致近三分之一普通感冒的病因〔3〕。盡管普通冠狀病毒感染的癥狀不嚴重且能自愈，但會導致兒童、老年人和免疫功能低下患者產生嚴重甚至致命的疾病〔2，4〕。松塔為松科植物的果球，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化和增強免疫功能的作用，有較高的研究價值〔5-6〕。云南松主要分布在中國西南地區，研究〔7〕發現云南松松塔提取物對HIV-1ⅢB、HIV-1RF、HIV-1A17等病毒株具有抑制效果，然而其是否具有抗冠狀病毒的活性尚無相關報道。

本研究通過建立HCoV-229E S 蛋白介導的細胞-細胞融合模型和假病毒模型，探究云南松松塔抗HIV 活性提取物（以下簡稱“松塔提取物”）對HCoV-229E 的抑制活性，并初步明確其活性部位和作用機制，為松塔藥物后續活性單體追蹤及抗HCoV-229E 機制研究奠定基礎，豐富云南松松塔的醫學研究價值和經濟價值，為抗冠狀病毒天然藥物研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒、細胞 感受態細菌（DH-5α）購自天根生物科技有限公司（批號：CB101-02）；293T、Huh-7 細胞、表達綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的克隆載體質粒pAAVIRES-EGFP、質粒pNL4-3.luc.R-E（編碼env 缺陷，含有螢火蟲酶報告基因的HIV-1 骨架質粒）、表達HCoV-229E S 蛋白的重組真核表達質粒pCDNA3.1-229E-S、共表達S 蛋白和EGFP 的重組質粒pAAV-IRES-EGFP-229E-S 均由本實驗室團隊前期成功構建保存。

1.1.2 主要試劑 大提質粒試劑（天根生化科技有限公司，批號：DP117）；EZ Trans 細胞轉染試劑（上海李記生物科技有限公司，批號：AC04L091）；螢火蟲酶檢測系統試劑盒、細胞裂解液（Promega公司，批號：E1501、E153A）；DMEM 高糖培養基、胎牛血清（大連美侖生物技術有限公司，批號：MA0212、PW1001）；DAPI 溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號：C0065）；PBS、青鏈霉素混合液、CCK-8 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1020、MA0110、MA0218-L）；松塔提取物由大理大學藥學院劉光明教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 293T 細胞與靶細胞Huh-7 均采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM 完全培養基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養。轉染前12 h 將293T 細胞以8×106個/孔鋪于6孔板，待細胞密度達70%～80%且形態良好時，采用EZ Trans 轉染試劑按說明書操作進行質粒pAAVIRES-EGFP-229E-S 轉染，繼續培養24～48 h 后得到穩定共表達HCoV-229E S 和EGFP 蛋白的效應細胞（293T/229E/EGFP），轉染質粒pAAV-IRESEGFP 作為陰性對照細胞（293T/EGFP）。

1.2.2 細胞-細胞融合模型建立 融合前1 d 將Huh-7 細胞以3×104個/孔鋪于96 孔板培養12 h。融合前2 h 加入20 μL DAPI 溶液作用20 min，進行Huh-7 細胞和293T/229E/EGFP 細胞核染色，PBS 洗凈DAPI 溶液后將293T/229E/EGFP 和293T/EGFP 以每孔約1×104個熒光細胞與Huh-7 細胞共培養，分別作為實驗組和陰性對照組，于不同時間段用熒光顯微鏡觀察細胞-細胞融合情況，計算細胞-細胞融合率。細胞-細胞融合率=（1-n1/n0）×100%（式中n1表示不同融合時間后單個熒光細胞數；n0表示融合前單個熒光細胞數），繪制時間融合關系曲線。

1.2.3 假病毒HCoV-229E 包裝及靶細胞感染 假病毒包裝主要步驟如下：按1 ∶2 比例將質粒pCDNA3.1-229E-S 與pNL4-3.luc.R-E 共轉染于293T 細胞，10～12 h 后將液體更換為DMEM 完全培養基。48～72 h 后，收集細胞培養液，3 000 r/min 離心10 min，去除細胞沉淀，取上清液分裝后于-80 ℃保存備用。感染靶細胞主要步驟如下：感染前12 h于96 孔板中鋪入靶細胞Huh-7，2×104個/孔，PBS洗滌細胞2 次，每孔加入100 μL 用1∶2 DMEM 稀釋的假病毒，感染10～12 h 后，更換為DMEM。培養48～72 h，用PBS 洗滌2 次，每孔加40 μL 細胞裂解液，100 r/min 振蕩裂解30 min，取裂解后的液體20 μL 于96 孔板中，加20 μL 螢火蟲酶底物，混勻后檢測熒光值。

1.2.4 抑制活性檢測 細胞-細胞融合抑制活性檢測以293T/229E/EGFP 與Huh-7 細胞共培養作為陽性對照組；293T/EGFP 與Huh-7 細胞共培養作為陰性對照組；梯度稀釋松塔提取物和293T/229E/EGFP在37 ℃、5% CO2條件下孵育1 h 與Huh-7 細胞共培養作為實驗組。假病毒抑制活性檢測以HCoV 細胞-229E 假病毒與Huh-7 細胞共培養作為陽性對照組；無假病毒和松塔提取物作為陰性對照組；假病毒梯度稀釋松塔提取物37 ℃孵育1 h 與Huh-7細胞共培養為實驗組，按“1.2.3”項下方法檢測熒光值，計算抑制率。抑制率=［1-（E-N）/（P-N）］×100%（式中E 表示實驗組的細胞-細胞融合率或熒光值；P 和N 分別表示陽性對照組和陰性對照組的細胞-細胞融合率或熒光值）。以松塔提取物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制藥物抑制曲線，使用Calsusyn軟件計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.5 時間-移除實驗 松塔提取物分別與293T/229E/EGFP、Huh-7 細胞共孵育1 h，洗除未結合的藥物，將兩者共培養，觀察是否仍具有抑制作用，初步檢測其作用靶點。實驗組分為3組：組1 為松塔提取物與293T/229E/EGFP 作用1 h，與Huh-7 細胞共培養；組2 為松塔提取物與293T/229E/EGFP 作用1 h，用DMEM 洗滌細胞2 次去除未結合的藥物，與Huh-7 細胞共培養；組3 為松塔提取物與Huh-7細胞作用1 h，用DMEM 洗滌細胞2 次去除未結合的藥物，與293T/229E/EGFP 共培養。不加松塔提取物293T/229E/EGFP 與Huh-7 細胞直接共培養作為陽性對照組；293T/EGFP 與Huh-7 細胞共培養作為陰性對照組，測定熒光值，按“1.2.4”項下方法計算抑制率。

1.2.6 時間-添加實驗 293T/229E/EGFP 與Huh-7細胞共孵育，分別于0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h 加入松塔提取物作為實驗組；不加松塔提取物293T/229E/EGFP 與Huh-7 細胞直接共培養作為陽性對照組；293T/EGFP 與Huh-7 細胞共培養作為陰性對照組，測定熒光值，按“1.2.4”項下方法計算抑制率。

1.2.7 細胞增殖毒性檢測 按CCK-8 試劑說明書操作，測定松塔提取物對293T、Huh-7 細胞的毒性作用。酶標儀測定450 nm 處的吸光度（OD）值，計算細胞毒性率。細胞毒性率=［（OD實驗-OD空白）/（OD對照-OD空白）］×100%。

2 結果

2.1 細胞-細胞融合模型的構建 實驗結果顯示，3 h 后于熒光顯微鏡下可觀察到實驗組產生明顯的細胞-細胞融合現象，同一熒光強度下與未融合的細胞比，熒光強度弱且形狀不規則，陰性對照組沒有融合現象。見圖1A。48 h 后熒光視野下實驗組有大面積融合現象，DAPI 染色可見融合區域有多個細胞核。見圖1B。說明HCoV-229E S 蛋白會介導細胞-細胞融合現象的發生，細胞-細胞融合模型構建成功。于不同時間觀察同一視野細胞-細胞融合情況，繪制時間融合關系曲線，由時間融合關系曲線可知6 h 后，實驗組細胞-細胞融合率達到50%。見圖2。

圖1 HCoV-229E S 蛋白介導的細胞-細胞融合情況

圖2 時間融合關系曲線

2.2 松塔提取物對HCoV-229E 的抑制作用 利用細胞-細胞融合模型檢測松塔提取物對HCoV-229E的抑制活性，6 h 后觀察各組細胞-細胞融合情況，計算抑制率并繪制抑制曲線，結果顯示：松塔提取物能以劑量依賴方式有效抑制由HCoV-229E S 蛋白介導的細胞融合現象發生。見圖3A。松塔提取物濃度為2 mg/mL 時，能抑制75%的細胞融合，IC50為（0.136±0.010）mg/mL，而不加松塔提取物的陰性對照組沒有抑制作用。假病毒模型檢測結果顯示：松塔提取物能抑制HCoV-229E 假病毒感染，在1 mg/mL 時對HCoV-229E 假病毒感染的抑制率達到90%，且以劑量依賴方式有效抑制感染，IC50為（0.069±0.015）mg/mL。見圖3B。實驗結果表明松塔提取物能有效抑制HCoV-229E 的進入。

圖3 松塔提取物抑制曲線

2.3 時間-移除實驗結果 實驗組1 松塔提取物與293T/229E/EGFP 作用1 h 后直接加入Huh-7 細胞中，抑制率為（82.10±5.30）%。實驗組2 松塔提取物僅與293T/229E/EGFP 作用，以明確藥物作用靶點是否在S 蛋白上，抑制率為（77.25±4.92）%。實驗組3 松塔提取物僅與Huh-7 細胞作用，明確藥物作用靶點是否在靶細胞的受體上，抑制率為（25.28±3.07）%。由此可見，松塔提取物抑制活性靶向HCoV-229E 的S 蛋白。

2.4 時間-添加實驗結果 共培養293T/229E/EGFP 和Huh-7 細胞后，于不同時間加入松塔提取物，觀察其抑制活性，結果顯示：融合初始階段加入松塔提取物抑制活性能達到60%，隨著時間的推移，抑制活性逐漸降低，2.0 h 后，抑制活性只達到10%，說明松塔提取物作用時間在HCoV-229E 感染的早期。見圖4。

圖4 松塔提取物作用時間檢測

2.5 細胞毒性檢測結果 檢測了松塔提取物的細胞毒性率，結果顯示：不同濃度松塔提取物對293T及Huh-7 細胞沒有明顯毒性作用。見表1。

表1 松塔提取物對293T、Huh-7 細胞的細胞毒性率（%，x±s）

3 討論

在新型冠狀病毒全球傳播的大背景下，雖然針對冠狀病毒的疫苗研發技術在迅速發展，但藥物研究方面迄今為止仍沒有針對SARS-CoV-2 或其他冠狀病毒的有效藥物〔8-9〕，因此急需研究開發新的治療藥物。

松塔含許多天然化合物，具有抗病毒、免疫增強、抗腫瘤等多種作用〔10-11〕，有極其廣泛的藥用價值。云南松主要分布在中國西南地區，其松塔中的木質素-碳水化合物復合物具有多種藥理特性。張海珠等〔12〕于云南松松塔提取物中發現并提取了木質素，分析證明其與抗HIV 作用有關；崔雪青等〔13〕采用合胞體抑制實驗等方法證明了思茅松松塔提取物SMS-F 能作用于HIV-1 進入融合階段，從而阻斷合胞體的形成，具有很好的抗HIV-1 活性。多項研究〔6，14〕表明，天然的木質素對流感病毒、HIV-1、輪狀病毒、單純皰疹病毒、腸病毒的生長均有抑制作用，具有多方面的抗病毒活性。基于此，本研究進一步對松塔提取物的抗HCoV-229E 的活性進行評價，并探討了其作用機制。

S 蛋白是研究抗冠狀病毒進入抑制劑藥物及疫苗的主要靶點之一。其中進入抑制藥物可以通過阻斷S1 與相應受體的結合，或靶向S2 抑制其6-HB的形成，從而阻斷病毒包膜與靶細胞細胞膜的融合進程，最終抑制冠狀病毒的感染。本研究成功構建了由HCoV-229E S 蛋白介導的可視化細胞-細胞融合模型，制備了HCoV-229E 假病毒，以檢測松塔提取物對HCoV-229E 的抑制活性。結果顯示：松塔提取物能有效抑制由HCoV-229E S 蛋白介導的細胞-細胞融合（IC50：0.136±0.010 mg/mL），同時能有效抑制HCoV-229E 假病毒對靶細胞的感染（IC50：0.069±0.015 mg/mL）。進一步通過時間-添加實驗以及時間-移除實驗研究作用時間及作用靶點，結果表明松塔提取物作用是在病毒感染的早期，靶向S 蛋白。

綜上所述，本研究初步建立了一種安全性高的抗HCoV-229E 感染活性體外檢測模型，對松塔提取物抗HCoV-229E 活性作出評價并研究其機制。結果顯示：松塔提取物具有較強的抗HCoV-229E活性和低細胞毒性。松塔具有來源廣泛及廉價易取的特點，適宜量產，有望成為抗冠狀病毒的候選藥物之一，但其具體機制和體內抗HCoV-229E 病毒活性和毒性有待進一步評價。