納米金棒應用于肝吸蟲血清循環抗原檢測的研究

陳麗萍，廉曉麗，蔡子涵，李 倩，歐陽天昭，楊毅梅

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000；2.山西醫科大學晉祠學院，太原 030000；3.大理大學臨床醫學院，云南大理 671000；4.大理大學第一附屬醫院，云南大理 671000）

肝吸蟲Clonorchis sinensis是一種食源性人畜共患寄生蟲，人或貓、狗等食入含有活囊蚴的淡水魚、蝦后，在消化液作用下，幼蟲循膽汁逆行至肝膽管發育為成蟲。以寄生部位上皮增生、結構紊亂及擴張為主要病理變化的肝吸蟲病，如沒有正確診斷并及時治療，可發展為肝膽慢性炎癥、膽汁性肝硬化甚至肝膽管惡性腫瘤〔1〕。持續炎癥、肝吸蟲感染等是引起膽管癌的主要誘因，肝膽管惡性腫瘤的預后差、生存率低〔2〕。由于肝吸蟲早期及低度感染時無明顯臨床癥狀，易導致治療延誤，對宿主造成不良后果。因此，只有早發現并及時治療才能減少其對宿主的實質性損害。

目前，肝吸蟲病的診斷方法主要是糞便或膽汁查蟲卵及血清抗體檢測。病原檢測發現肝吸蟲蟲卵是確診的依據，但肝吸蟲蟲卵不明顯，易被污染物覆蓋而漏檢〔3〕。肝吸蟲在宿主體內發育和寄生的過程中主要產生特異性IgG 抗體〔4〕。血清IgG 抗體檢測是診斷肝吸蟲感染的有效方法，但IgG 抗體通常在感染一段時間后才開始產生，無法早期診斷及分辨感染的時期，且經治療痊愈后抗體水平變化不明顯，無法用于肝吸蟲病的療效考核，而檢測循環抗原可彌補上述不足〔5-6〕。肝吸蟲循環抗原是蟲體在發育過程中產生的蟲卵抗原及蟲體分泌物等，在肝吸蟲感染早期、急性期或活動期的血液中存在，是肝吸蟲現癥或急性感染的證據，可作為活蟲感染的標志并用于療效考核〔7-8〕。由于血清中肝吸蟲循環抗原成分較難獲取，研究〔9〕證明循環抗原的主要成分是排泄分泌抗原，但其在血清中的含量較低，目前使用常規免疫學方法檢測的研究甚少，研發高靈敏的檢測方法是當下早期診斷肝吸蟲病所面臨的新課題。

納米金是指在三維結構中至少有一維小于100 nm 的金粒子，其合成簡單、體積小、表面易于修飾、生物相容性好，單位面積可結合多個生物分子從而起到信號放大的作用，且結合后生物分子的活性幾乎不會發生改變〔10-11〕。納米金棒是一種棒狀納米金，通過紫外分光光度計掃描可見橫向和縱向2個吸收帶，其中縱向吸收帶的位置隨著其縱橫比的增加而產生位移，能實時反映抗原-抗體的相互作用〔12〕。因此，本研究在李家萌〔13〕對納米金棒的最佳聚合條件研究基礎上，將納米金棒與巰基化的特異性抗體結合，利用其縱向吸收帶的特性，對肝吸蟲感染的大鼠血清循環抗原進行檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 HAuCl4（上海杰泰生物技術公司，批號：A601926）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，華美生物工程公司，批號：112-020-74）；NaBH4（成都華夏化學試劑有限公司，批號：MFCD0035）；乙二胺四乙酸（EDTA，碧云天生物技術有限公司，批號：C0503）；AgNO3（華夏試劑公司，批號：20563439）；抗壞血酸（晶美生物工程有限公司，批號：20006621）；特勞特試劑（上海生工公司，批號：TR4720853）；PEG-6000（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：473-3CWRD）；PAGE 蛋白回收試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司，批號：PG114）；BCA 蛋白定量試劑盒（Signalway Antibody 公司，批號：3415）；大鼠血清抗體酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（昆明嬌曼生物有限公司，批號：D2020495）。

1.2 實驗動物 含有活囊蚴的麥穗魚由廣西醫科大學提供；健康雄性SD 大鼠（150～200 g），購自大理大學動物實驗中心，動物生產許可證號：SCXK（云）2021-0015。

1.3 制備肝吸蟲特異性IgG 抗體

1.3.1 建立大鼠肝吸蟲病模型 將含有活囊蚴的麥穗魚用清水沖洗數遍，剪刀剪去魚的魚鰭、魚尾、魚骨等，剩下的魚肉剪碎放入絞肉機絞成肉泥，將魚肉和消化液以1∶10 的比例混合，置于恒溫搖床中消化過夜約10 h。將消化后的魚肉過濾到量杯中，倒出上清液留沉淀，重復4～5 次，直到分離出沉渣中的囊蚴，以備灌胃。將待感染的SD 大鼠分為3組，每組20 只，按囊蚴感染量50、100、200 條，分別對大鼠進行灌胃，即獲得大鼠肝吸蟲病輕度、中度、重度感染模型。

1.3.2 收集不同感染度、不同感染時間大鼠血清樣品 收集輕度、中度、重度感染后3、10、17、31 d 的大鼠眼內眥靜脈血樣，4 ℃放置數小時，4 000 r/min離心30 min，-80 ℃儲存備用。

1.3.3 純化并鑒定肝吸蟲特異性IgG 抗體 利用親和層析法純化收集的血清，鑒定純化后的肝吸蟲特異性IgG 抗體純度。

1.4 納米金棒標記肝吸蟲特異性IgG 抗體及抗體篩選

1.4.1 制備金晶種子液 混合0.2 mmol/L CTAB 1.88 mL、2 mmol/L HAuCl4625 μL、純水1.37 mL，將4 ℃冰箱中現配的0.01 mmol/L NaBH4450 μL 加入上述混合液中，快速震蕩2 min，27 ℃放置120 min。1.4.2 制備生長媒介及聚合納米金棒 向50 mL離心管中加入0.2 mmol/L CTAB 11.88 mL、純水7.71 mL、2 mmol/L HAuCl45.00 mL、10 mmol/L AgNO3150 μL、100 mmol/L 抗壞血酸160 μL 混勻制備成生長媒介。取108 μL 金晶種子液，加入25 mL 生長媒介中，27 ℃孵育12 h 后用紫外分光光度計掃描納米金棒，對其吸收峰進行分析。

1.4.3 純化納米金棒 參照文獻〔14〕的方法并稍加改進，將納米金棒懸浮液8 500 r/min 離心20～40 min，留沉淀，加入純水，13 000 r/min 再次離心10 min，棄上清液，加入新配制的0.5 mmol/L CTAB 1.5 mL，獲得高純度的納米金棒。

1.4.4 制備肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒及抗體篩選 將BCA 蛋白定量試劑盒測定的特異性IgG 抗體稀釋至10、20、30、40 μg/mL，各取200 μL分別加到800 μL 含EDTA 的PBS 緩沖液滅菌管中，再加入5 mg/mL 特勞特試劑5 μL 混合，27 ℃放置60 min。將處理后的特異性抗體混合液進行脫鹽，除去雜抗體，收集所需的特異性抗體。將處理后的抗體100 μL 加至2 mL 分裝的納米金棒溶液中，靜置數分鐘后加入1 mL PEG-6000 溶液，28 ℃放置120 min，用紫外分光光度計掃描標記不同濃度特異性IgG 抗體納米金棒，根據吸收峰位移變化確定特異性IgG 抗體的最佳標記濃度。

1.5 篩選并鑒定循環抗原組分

1.5.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析循環抗原 SDS-PAGE 法純化獲得不同感染時間血清樣品中分子量為26、28 kDa的血清排泄分泌純化抗原條帶，用PAGE 蛋白回收試劑盒收集凝膠中的蛋白質。

1.5.2 肝吸蟲血清循環抗原的抗原性鑒定 采用BCA 蛋白定量試劑盒測定血清循環抗原濃度，分別向400 μL 含EDTA 的PBS 緩沖液中加入上述不同感染時間的循環抗原100 μL，再取5 mg/mL 特勞特試劑5 μL，加入上述混合液中，27 ℃放置60 min。將處理后的循環抗原混合液進行脫鹽，直至收集到所需抗原。取上述循環抗原200 μL 與4 mL 納米金棒溶液混勻5 min，加入2 mL PEG-6000，28 ℃放置120 min。紫外分光光度計測定納米金棒的吸收峰，判斷是否標記成功。向2 mL 納米金棒標記的不同時間肝吸蟲循環抗原內各加入40 μL 大鼠陽性血清抗體，28 ℃反應10 min。

1.6 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測血清循環抗原 用肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒分別檢測不同感染度、不同感染時間、不同稀釋度的血清循環抗原，檢測結果與陰性對照進行對比。

1.7 ELISA 檢測肝吸蟲血清特異性抗體 用ELISA 試劑盒檢測肝吸蟲不同感染度、不同感染時間、不同稀釋度的血清特異性抗體，檢測結果與臨界值進行對比。本研究的臨界值為0.211 5。

2 結果

2.1 肝吸蟲特異性IgG 抗體純化結果 肝吸蟲特異性IgG 抗體純化后顯示2 個條帶。見圖1。

圖1 原始樣品及抗體純化后流出各部分電泳圖

2.2 肝吸蟲特異性IgG 抗體最佳標記濃度 納米金棒分別標記濃度為10、20、30、40 μg/mL 的特異性IgG 純化抗體，結果顯示標記前后納米金棒吸收峰均發生不同程度的位移，位移分別為10.0、20.0、15.0、4.0 nm?？贵w標記濃度為20 μg/mL 時，吸收峰位移最大為20.0 nm，表明肝吸蟲特異性IgG 純化抗體最佳標記濃度為20 μg/mL。

2.3 循環抗原各組分電泳結果 SDS-PAGE 法純化獲得不同感染時間大鼠血清樣品的電泳條帶，結果顯示各時間點的血清樣品中均有分子量為26、28 kDa 的排泄分泌純化抗原條帶。見圖2。

圖2 不同感染時間大鼠血清SDS-PAGE 電泳圖

2.4 肝吸蟲血清循環抗原的抗原性鑒定結果 納米金棒分別標記感染后3、10、17、31 d 的肝吸蟲排泄分泌純化抗原，檢測肝吸蟲陽性血清抗體。結果表明，檢測前后納米金棒吸收峰均不同程度地發生位移，位移分別為13.0、15.5、16.5、15.5 nm，檢測結果均為陽性，即不同感染時間的肝吸蟲排泄分泌純化抗原均能識別陽性血清抗體。因此，不同感染時間的肝吸蟲排泄分泌純化抗原均具有較強的抗原性。

2.5 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒血清循環抗原檢測結果

2.5.1 不同程度感染后3 d 大鼠血清循環抗原光譜掃描結果 陰性對照血清的吸收峰最大位移為2.0 nm，用肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測輕度、中度、重度肝吸蟲囊蚴感染后3 d 大鼠血清循環抗原的吸收峰最大位移分別為3.0、11.0、13.0 nm。見圖3 A～C，檢測結果為陽性。

圖3 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測不同程度感染后3 d 大鼠血清循環抗原光譜掃描曲線

2.5.2 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測相同感染度、不同感染時間血清循環抗原結果 用肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒對感染度相同、感染時間分別為3、10、17、31 d 的血清循環抗原進行檢測，結果均為陽性。肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒與輕度感染后的血清循環抗原反應，吸收峰分別移動了3.0、17.5、10.5、12.0 nm；與中度感染后的血清循環抗原反應，吸收峰分別移動了11.0、20.0、14.0、32.5 nm；與重度感染后的血清循環抗原反應，吸收峰分別移動了13.0、25.0、16.0、34.5 nm。見圖4。表明肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒可檢出50、100、200 條囊蚴感染后3、10、17、31 d 的血清循環抗原。

圖4 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測相同感染度、不同感染時間血清循環抗原吸收峰位移結果

2.5.3 不同稀釋度的大鼠血清循環抗原光譜掃描結果 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測稀釋度為1∶100、1∶200、1∶400、1∶600 的大鼠血清循環抗原，吸收峰位移分別為9.0、7.0、4.5、1.0 nm。見圖5 A～D。其中稀釋度為1∶600 的檢測結果為陰性，其他檢測結果均為陽性。

圖5 肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測不同稀釋度血清循環抗原光譜掃描曲線

2.6 ELISA 檢測肝吸蟲血清抗體結果 ELISA 檢測結果顯示，輕度感染后第17 天、中度和重度感染后第10 天、第17 天出現陽性結果。見表1。稀釋度為1∶100 的血清抗體結果為陽性。見表2。

表1 ELISA 檢測肝吸蟲不同感染度感染大鼠后不同時間的血清抗體結果

表2 ELISA 檢測不同稀釋度的肝吸蟲感染大鼠后血清抗體結果

3 討論

本研究采用優化的金晶種子生長法成功聚合出縱橫比穩定的納米金棒，利用Au-S 共價鍵結合的方式將巰基化的肝吸蟲特異性IgG 抗體包被在納米金棒表面〔15〕，通過紫外分光光度計測定納米金棒的吸收峰位移，優選出高敏感性的肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒，并檢測不同感染度及不同感染時間血清循環抗原。當血清循環抗原與納米金棒上的肝吸蟲特異性IgG 抗體反應后，再次增大納米金棒的縱橫比，使得納米金棒固有頻率發生改變，從而引起納米金棒縱向吸收峰再次產生位移，實現了對肝吸蟲感染的微量血清循環抗原的檢測，建立了早期肝吸蟲病的臨床診斷實驗基礎。

由于肝吸蟲血清排泄分泌抗原具有高活性成分，因此可用于診斷肝吸蟲病〔16〕。Li 等〔17〕證實肝吸蟲血清排泄分泌抗原中存在多種蛋白條帶，其中分子量為26、28 kDa 是特異性較強的蛋白條帶，與其他寄生蟲無交叉反應。為鑒定其抗原性，構建了不同時間的肝吸蟲血清排泄分泌純化抗原納米金棒檢測大鼠血清抗體，通過吸收峰的位移判斷不同感染時間排泄分泌純化抗原的抗原性。結果顯示，不同感染時間的排泄分泌純化抗原納米金棒均可檢測出大鼠血清抗體，抗原性強，可作為肝吸蟲病的診斷抗原。

分析肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒檢測不同感染度、不同感染時間的大鼠血清結果，能間接發現宿主體內循環抗原的動態變化。肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒與輕度感染后3、10、17、31 d 的血清循環抗原反應，吸收峰分別移動了3.0、17.5、10.5、12.0 nm，說明感染后3 d 就可檢測出最低感染量為50 條囊蚴的血清循環抗原，且感染后10 d 吸收峰的位移較感染后17 d 的大，推測是早期感染后產生的循環抗原還沒有被宿主免疫系統清除，而與納米金棒上的特異性IgG 抗體結合，使得吸收峰位移較大。研究〔18〕發現IgG 抗體于感染后14 d 開始上升，宿主體內的循環抗原被逐漸清除，使得循環抗原逐漸減少，因此感染后17 d 吸收峰的位移減小。而感染后31 d 吸收峰位移增大，分析原因應該是宿主體內的蟲體發育成熟，循環抗原的量增多。ELISA 結果也證實，輕度感染后17 d、中度和重度感染后10、17 d 的大鼠血清特異性抗體為陽性反應，判斷是因為感染度與血清抗體含量成正比。宿主體內抗體滴度的動態變化與相同感染度、不同感染時間吸收峰位移先增大、后減小、再增大的規律相符。相同時間內，輕度、中度、重度感染的吸收峰位移逐漸增加，說明隨著感染量的增加，循環抗原的量越多，與納米金棒上的特異性IgG 抗體結合得越多，吸收峰位移越大，即宿主體內的循環抗原的含量與蟲體數量呈正相關。經臨床有效治療后蟲體數量逐漸減少，血清中循環抗原的量逐漸減少，位移減小。因此，肝吸蟲血清循環抗原的檢測不僅可作為肝吸蟲感染早期及低蟲荷的診斷依據，也是判斷臨床治療效果的評估依據。

本研究進一步檢測了稀釋度為1∶100、1∶200、1∶400、1∶600 的血清循環抗原，結果顯示吸收峰分別位移了9.0、7.0、4.5、1.0 nm。由此可見隨著稀釋度的增加，抗原抗體反應的比例降低，使得吸收峰位移逐漸減小。稀釋度為1∶600 時，吸收峰位移僅為1.0 nm，推測是由于誤差造成。ELISA 僅能檢測到稀釋度為1∶100 的血清抗體，實驗結果證明納米金棒具有更高的靈敏度。

本研究結果證實了肝吸蟲特異性IgG 抗體納米金棒可用于檢測血清循環抗原，且具有檢測時間早和靈敏度高的優勢。針對肝吸蟲感染者可在早期感染、低度感染時提供診斷依據，在肝吸蟲患者治療過程中循環抗原的檢測可為臨床醫生提供治療效果的評估，更好把握療程，提高療效。納米金生物技術更大的拓展空間源于納米金棒合成簡單、檢測快速且穩定性強、結果觀察不需要特殊的儀器等特點，其優勢完全滿足了即時檢驗的要求，為實現在患者床旁進行疾病的快速診斷和監測奠定了良好的基礎，國外已有研究〔19〕表明，納米金診斷技術與即時檢驗的結合已經成為個人醫療領域全集成即時檢驗系統發展的最新趨勢，應用前景可觀。