二甲雙胍對Ⅰ型成骨不全小鼠間充質干細胞成骨分化的影響及療效探討

王娟　趙玉霞　茹雅維　汪子涵　付婷　李光

摘要：目的 研究二甲雙胍對Ⅰ型成骨不全小鼠（oim）脂肪間充質干細胞（oimADSCs）向成骨細胞分化的影響并初步探討二甲雙胍在oim中的治療效果。方法 從oim中分離培養oimADSCs，通過觀察細胞形態，堿性磷酸酶（ALP）染色和油紅O染色對其分化能力進行鑒定；將oimADSCs分組進行誘導培養，通過觀察ALP染色、檢測ALP活性和實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測幾種成骨分化相關分子的表達情況，分析二甲雙胍對oimADSCs向成骨細胞分化的影響；利用微計算機斷層掃描技術（Micro-CT）分析股骨的骨骼微觀結構，觀察二甲雙胍在oim模型小鼠中的治療效果。結果 在二甲雙胍處理oimADSCs后，ALP染色顯著加深、ALP活性顯著提高，骨鈣素（Bglap）、Ⅰ型膠原（Col1a1）、Runt相關轉錄因子2（Runx2）以及骨形成蛋白2（BMP2）的mRNA表達水平升高；Micro-CT分析發現oim模型小鼠經過二甲雙胍治療后，股骨骨小梁的骨體積/總體積增加，股骨骨小梁數目增多、厚度增加。結論 二甲雙胍能夠促進oimADSCs向成骨細胞分化，改善oim的骨骼生長情況。

關鍵詞：成骨不全；間質干細胞；二甲雙胍；Ⅰ型成骨不全；脂肪間充質干細胞；成骨分化

中圖分類號：R681.1文獻標志碼：ADOI：10.11958/20221341

Study of effects of metformin on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and bone tissue regeneration in type I osteogenesis imperfecta mice

WANG Juan， ZHAO Yuxia， RU Yawei， WANG Zihan， FU Ting， LI Guang

Department of Genetics， School of Basic Medicine， Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China

Corresponding Author E-mail： lig@tmu.edu.cn

Abstract： Objective To evaluate the effect of metformin on the osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells of type I osteogenesis imperfecta mice （oimADSCs）， and the therapeutic effect of metformin on bone tissue regeneration in oim mice. Methods The oimADSCs were isolated and cultured. Cell morphology observation， alkaline phosphatase staining and oil red O staining were used to validate the multiple differentiation potential of oimADSCs．After osteogenic induction，ALP staining and ALP activity were compared between groups. qPCR was applied to analyze the expression of osteogenic differentiation associated genes. Micro-CT was used to detect the femoral microstructure and analyze effects of metformin on bone regeneration in oim mice. Results Compared with the control group， ALP staining was more deeper and the ALP activity level was obviously increased in the osteogenesis+metformin group. The transcription levels of Bglap， Col1a1， Runx2 and BMP2 were significantly up-regulated. The micro-CT results revealed that after metformin treatment， BV/TV， trabecular number and Tb.Th of oim mice were increased. Conclusion Metformin can enhance osteogenic differentiation of oimADSCs in vitro and improve bone microstructure of oim mice in vivo．

Key words： osteogenesis imperfecta; mesenchymal stem cells; metformin; type I osteogenesis imperfecta; adipose derived mesenchymal stem cells; osteogenic differentiation

成骨不全（osteogenesis imperfecta，OI）是以反復骨折、骨質脆弱、骨畸形為臨床特征的遺傳性疾病［1-2］。Sillence等［3］將OI分為Ⅰ—Ⅳ型。Ⅰ型最常見的致病原因是編碼Ⅰ型膠原蛋白α鏈的基因Col1a1突變，導致Ⅰ型膠原數量減少，進一步導致患者單位骨質的骨量下降和骨組織的代謝和（或）生長異常［4-5］。二甲雙胍是臨床治療2型糖尿病的常用藥。有研究發現其還具有骨保護作用［6］。糖尿病患者骨折率明顯高于非糖尿病人群，長期服用二甲雙胍可顯著降低糖尿病患者的骨折發生率［7］；且骨質疏松癥患者服用二甲雙胍可以增加骨密度［8］。體內外研究發現二甲雙胍不僅可以促進脂肪間充質干細胞向成骨細胞分化，還可以促進成骨細胞的增殖、抑制破骨細胞的形成［9］。但是目前二甲雙胍在OI患者或動物模型中的研究鮮見報道。本研究通過分離培養Ⅰ型OI小鼠（type Ⅰ osteogenesis imperfecta mice，oim）的脂肪間充質干細胞（adipose derived mesenchymal stem cells of oim mouse，oimADSCs），研究二甲雙胍對oimADSCs向成骨細胞分化的影響，并初步探討二甲雙胍在oim中的治療效果，以期為二甲雙胍用于治療Ⅰ型OI提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器

oim由本實驗室構建［10］：該小鼠品系為C57BL/6小鼠，該小鼠模型為通過CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除Col1a1外顯子2—5，構建而成的Col1a1缺失突變模型。本實驗所用oim為8～9周齡，雄性，飼養于天津醫科大學實驗動物中心無特定病原體級別的屏障系統中。α-MEM培養基、鏈霉素、青霉素購自美國Hyclone公司，地塞米松、β-甘油磷酸酯、抗壞血酸、吲哚美辛、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購自美國Sigma公司，Trizol試劑購自美國Thermo Scientific公司，反轉錄試劑盒購自美國Promega公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒購自德國Qiagen公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，胎牛血清購自以色列Biological Industries公司，堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒、ALP活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，Ⅰ型膠原酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司，組織基因組DNA提取試劑盒購自美國Biomiga公司。成骨誘導培養基具體成分如下：取100 μL地塞米松溶液（終濃度為1×10-7 mol/L）、10 mL β-磷酸甘油酯溶液（終濃度為1×10-5 mol/L）、2 mL抗壞血酸溶液（終濃度為100 mg/L），加入含5%胎牛血清的α-MEM培養基至100 mL。成脂誘導培養基具體成分如下：取500 μL地塞米松溶液（終濃度為1×10-6 mol/L）、500 μL 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤溶液（終濃度為5×10-4 mol/L）、100 μL吲哚美辛溶液（終濃度為1×10-6 mol/L）、142.86 μL胰島素溶液（終濃度為5 μg/L），加入含5%胎牛血清的α-MEM培養基至100 mL。

1.2 研究方法

1.2.1 oimADSCs的分離和培養

參照文獻［11］，從oim中分離培養oimADSCs。頸椎脫臼法處死oim小鼠，在無菌環境中取出小鼠兩側腹股溝和附睪處脂肪組織，去除脂肪表面的結締組織，將脂肪組織剪碎后加入Ⅰ型膠原酶，37 ℃恒溫搖床消化45 min。加入胎牛血清終止消化，將細胞過濾離心后培養。用含15%胎牛血清的α-MEM培養基重懸細胞，然后接種到細胞培養皿中，第3天更換半量培養基，第4天更換全部培養基，以后每2 d換1次培養基進行常規傳代。

1.2.2 oimADSCs的成骨、成脂分化能力鑒定

選用P3代oimADSCs進行誘導分化。消化oimADSCs，制成細胞懸液并計數，按1×105個/孔接種到6孔板中。待細胞密度達到80%時，將細胞分組進行誘導培養，分為成骨對照組（加入α-MEM培養基）、成骨誘導組（加入成骨誘導培養基）、成脂對照組（加入α-MEM培養基）、成脂誘導組（加入成脂誘導培養基）。每組設置3個重復，每3 d更換1次新鮮培養基。對于成骨對照組、成骨誘導組在誘導14 d后固定細胞，隨后進行ALP染色鑒定成骨分化能力；對于成脂對照組、成脂誘導組在誘導14 d后固定細胞，隨后進行油紅O染液染色鑒定成脂分化能力。

1.2.3 ALP染色及活性檢測

接種oimADSCs細胞，將細胞分為成骨誘導組（加入成骨誘導培養基）和實驗組（成骨誘導培養基+500 μmol/L二甲雙胍）進行誘導培養。每組重復3次，每隔2 d更換相應的培養基。在誘導7 d后，分別收集各組細胞培養上清液，按照試劑盒說明書檢測ALP活性。在誘導14 d后，按照ALP染色試劑盒說明書要求固定細胞，隨后進行ALP染色，通過ALP染色判定細胞向成骨方向分化能力。

1.2.4 qPCR檢測成骨相關因子

消化P3代oimADSCs，計數后以1×105個/孔接種到6孔板，將細胞分為成骨誘導組（加入成骨誘導培養基）和實驗組（成骨誘導培養基+500 μmol/L二甲雙胍）進行誘導培養。每隔2 d更換相應的培養基。14 d后收集細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，再用試劑盒反轉錄成cDNA，采用qPCR檢測骨鈣素（Bglap）、Ⅰ型膠原α鏈（Col1a1）、Runt相關轉錄因子2（Runx2）以及骨形成蛋白2（BMP2）的表達量，引物序列見表1。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環40次。以GAPDH為內參，2^-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

1.2.5 動物實驗分組

取oim 12只，隨機分為二甲雙胍組（2 mg·kg-1·d-1）和對照組（生理鹽水），每組6只，治療2個月，二甲雙胍組每天灌胃含二甲雙胍的生理鹽水，對照組每天灌胃等體積的生理鹽水。在治療結束后，頸椎脫臼處死各組小鼠，分離股骨，并在4%多聚甲醛中固定3 d，用于檢測股骨微觀結構。

1.2.6 微計算機斷層掃描（Micro-CT）檢測股骨微觀結構

應用Micro-CT分析儀（SkyScan 1276）對小鼠股骨進行掃描。掃描完成后用軟件（CTAn，1.15.4）對股骨三維結構進行重建，并分析從生長板下緣至骨小梁消失處區域的微觀結構參數。骨小梁參數包括骨體積/總體積（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）和骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，計量數據用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 oimADSCs的成骨和成脂分化能力鑒定

隨著成骨分化誘導的進行，細胞形態逐漸由梭形變為錐體形，沉淀增多并聚集凝結在一起形成鈣結節；隨著成脂分化誘導的進行，細胞形態逐漸由梭形變為圓形、橢圓形，從胞膜下脂肪小顆粒逐漸形成脂滴，見圖1。ALP染色結果顯示，oimADSCs在成骨分化誘導后ALP表達活性增高；油紅O染色結果顯示oimADSCs在成脂分化誘導后出現紅色的脂滴，見圖2。表明oimADSCs成骨分化、成脂分化誘導成功，分離得到的oimADSCs具有多向分化潛能，為典型的間充質干細胞。

2.2 二甲雙胍對oimADSCs成骨分化的影響

與成骨誘導組相比，實驗組的ALP染色加深、ALP活性升高［（2.91±0.28）U/L vs. （1.07±0.12）U/L，n=3，t=10.664，P＜0.01］。見圖3。與成骨誘導組相比，實驗組細胞中成骨分化相關因子BMP2、Runx2、Col1a1、Bglap的mRNA表達水平升高，見表2。

2.3 二甲雙胍對oim的治療效果

Micro-CT結果顯示，與對照組相比，二甲雙胍組BV/TV增高，Tb. N增多，Tb. Th增厚，見圖4、表3。

3 討論

3.1 OI的臨床癥狀及治療方法

OI患者的臨床表現包括頻繁骨折和骨折愈合不良，給患者帶來極大的痛苦和經濟負擔。Ⅰ型OI是發病率最高的一種OI，最常見的致病原因是Col1a1突變，導致Ⅰ型膠原數量減少，從而導致骨基質量不足。本研究所用的oim經過Ⅰ型膠原水平、骨密度、骨量、力學性能及骨代謝等多方面檢測，其表型符合oim特征［10］。OI是一種由于基因突變導致的遺傳性疾病，目前尚無治愈的方法，當前主要是采用外科手術和藥物聯合等方法治療［12-13］。雖然取得了一定的療效，但不能從根本上解決患者干細胞分化能力缺陷、成骨細胞功能降低、Ⅰ型膠原合成不足等問題［14-15］。

3.2 二甲雙胍對骨代謝的影響

作為治療2型糖尿病的經典藥物，二甲雙胍具有價格低廉和療效可靠的優點［16］。隨著研究者對二甲雙胍降糖以及降糖以外作用研究的不斷深入，發現其具有促進組織再生的功能。在小鼠皮膚涂抹二甲雙胍可以促進毛發生長，其通過腺苷酸活化蛋白激酶和mTOR信號通路激活自噬，促使毛囊從休止期進入生長期，從而促進毛發再生［17］。Neumann等［18］發現二甲雙胍可以促進大鼠老化的少突膠質細胞祖細胞的分化功能，并進一步促進髓鞘再生。多項研究亦證實二甲雙胍對骨代謝具有有益的作用，包括抑制成脂分化、減少破骨細胞數目、修復骨缺損等［19-20］。二甲雙胍在Ⅰ型OI中是否具有促進骨組織再生的作用以及是否對骨代謝有益有待進一步研究。本研究利用Micro-CT分析發現，oim在經二甲雙胍治療后，股骨骨小梁的BV/TV增高，Tb. N增多，Tb. Th增厚，說明在oim中二甲雙胍能夠顯著改善股骨的微觀結構。

3.3 二甲雙胍對oimADSCs細胞成骨分化的影響

有研究發現，二甲雙胍干預后MC3T3E1細胞和成骨細胞中Col1a1的mRNA表達水平顯著增加［21-22］。本研究發現二甲雙胍不僅能夠促進oimADSCs向成骨細胞分化，還能促進Col1a1的表達。Ⅰ型膠原是由兩條α1（Ⅰ）鏈和一條α2（Ⅰ）鏈構成的三股螺旋結構，占骨基質有機物的90%左右，是骨礦物質沉積的礦化支架；其中α1鏈是由基因Col1a1編碼合成的，Col1a1的表達水平直接影響了Ⅰ型膠原的含量。在Ⅰ型OI中由于Ⅰ型膠原的含量減少導致機體成骨微環境被破壞，而二甲雙胍可以促進Col1a1的表達，有望提高Ⅰ型膠原的含量并改善Ⅰ型OI患者的成骨微環境。

綜上所述，本研究利用體外細胞實驗表明二甲雙胍具有促進oimADSCs細胞向成骨細胞分化以及促進Col1a1表達的能力，體內實驗發現在經二甲雙胍治療后，oim的股骨的微觀結構有很大程度改善。本實驗為二甲雙胍治療Ⅰ型OI奠定了一定的理論基礎和實驗依據，為Ⅰ型OI患者的臨床治療提供了新的思路與方法。

參考文獻

［1］ FORLINO A，MARINI J C. Osteogenesis imperfecta［J］. Lancet，2016，387（10028）：1657-1671. doi：10.1016/S0140-6736（15）00728-X.

［2］ MARINI J C，FORLINO A，BACHINGER H P，et al. Osteogenesis imperfecta［J］. Nat Rev Dis Primers，2017，3：17052. doi：10.1038/nrdp.2017.52.

［3］ SILLENCE D O，RIMOIN D L. Classification of osteogenesis imperfect［J］. Lancet，1978，1（8072）：1041-1042. doi：10.1016/s0140-6736（78）90763-8.

［4］ BOTOR M，FUS-KUJAWA A，UROCZYNSKAR M，et al. Osteogenesis imperfecta：current and prospective therapies［J］. Biomolecules，2021，11（10）：1493. doi：10.3390/biom11101493.

［5］ NIJHUIS W，VERHOEF M，VAN B C，et al. Fractures in osteogenesis imperfecta：pathogenesis，treatment，rehabilitation and prevention［J］. Children （Basel），2022，9（2）：268. doi：10.3390/children9020268.

［6］ ZHAO X，PATHAK J L，HUANG W，et al. Metformin enhances osteogenic differentiation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth through AMPK pathway［J］. J Tissue Eng Regen Med，2020，14（12）：1869-1879. doi：10.1002/term.3142.

［7］ SUN J，LIU Q，HE H，et al. Metformin treatment is associated with an increase in bone mineral density in type 2 diabetes mellitus patients in China：a retrospective single center study［J］. Diabetes Metab，2022，48（5）：101350. doi：10.1016/j.diabet.2022.101350.

［8］ BAHRAMBEIGI S，YOUSEFI B，RAHIMI M，et al. Metformin：an old antidiabetic drug with new potentials in bone disorders［J］. Biomed Pharmacother，2019，109：1593-1601. doi：10.1016/j.biopha.2018.11.032.

［9］ SMIESZEK A，TOMASZEWSKI K A，KORNICKA K，et al. Metformin promotes osteogenic differentiation of adipose-derived stromal cells and exerts pro-osteogenic effect stimulating bone regeneration［J］. J Clin Med，2018，7（12）：482. doi：10.3390/jcm7120482.

［10］ LIU Y，WANG J H，LIU S，et al. A novel transgenic murine model with persistently brittle bones simulating osteogenesis imperfecta type I［J］. Bone，2019，127：646-655. doi：10.1016/j.bone.2019.07.021.

［11］ 程勝承，劉義，景亞青，等. 羥基磷灰石誘導脂肪間充質干細胞成骨分化的實驗研究［J］. 天津醫藥，2018，46（7）：687-691. CHENG S C，LIU Y，JING Y Q，et al. Experimental study on osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells induced by hydroxyapatite［J］. Tianjin Med J，2018，46（7）：687-691. doi：10.11958/20180604.

［12］ GLORIEUX F H，BISHOP N J，PLOTKIN H，et al. Cyclic administration of pamidronate in children with severe osteogenesis imperfecta［J］. N Engl J Med，1998，339（14）：947-952. doi：10.1056/NEJM199810013391402.

［13］ SCHINDELER A，LEE L R，O'DONOHUE A K，et al. Curative cell and gene therapy for osteogenesis imperfecta［J］. J Bone Miner Res，2022，37（5）：826-836. doi：10.1002/jbmr.4549.

［14］ CLAEYS L，STORONI S，EEKHOFF M，et al. Collagen transport and related pathways in osteogenesis imperfecta［J］. Hum Genet，2021，140（8）：1121-1141. doi：10.1007/s00439-021-02302-2.

［15］ CHEN Y，YANG S，LOVISA S，et al. Type-Ⅰ collagen produced by distinct fibroblast lineages reveals specific function during embryogenesis and osteogenesis imperfecta［J］. Nat Commun，2021，12（1）：7199. doi：10.1038/s41467-021-27563-3.

［16］ FLORY J，LIPSKA K. Metformin in 2019［J］. JAMA，2019，321（19）：1926-1927. doi：10.1001/jama.2019.3805.

［17］ CHAI M，JIANG M，VERGNES L，et al. Stimulation of hair growth by small molecules that activate autophagy［J］. Cell Rep，2019，27：3413-3421. doi：10.1016/j.celrep.2019.05.070.

［18］ NEUMANN B，BAROR R，ZHAO C，et al. Metformin restores CNS remyelination capacity by rejuvenating aged stem cells［J］. Cell Stem Cell，2019，25：473-485. doi：10.1016/j.stem.2019.08.015.

［19］ STUNES A K，ERBEN R G，SCHULER C，et al. Skeletal effects of plyometric exercise and metformin in ovariectomized rats［J］. Bone，2020，132：115193. doi：10.1016/j.bone.2019.115193.

［20］ LOH D K W，KADIRVELU A，PAMIDI N. Effects of metformin on bone mineral density and adiposity-associated pathways in animal models with type 2 diabetes mellitus：a systematic review［J］. J Clin Med，2022，11（14）：4193-4212. doi：10.3390/jcm11144193.

［21］ KANAZAWA I，YAMAGUCHI T，YANO S，et al．Metformin enhances the differentiation and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells via AMP kinase activation as well as eNOS and BMP-2 expression［J］. J Bioehem Biophys Res Commun，2008，375：414-419. doi：10.1016/j.bbrc.2008.08.034.

［22］ MALTA F S，GARCIA R P，AZARIAS J S，et al. Impact of hyperglycemia and treatment with metformin on ligature-induced bone loss，bone repair and expression of bone metabolism transcription factors［J］. PLoS One，2020，15（8）：e0237660. doi：10.1371/journal.pone.0237660.

（2022-09-01收稿 2023-02-28修回）

（本文編輯 李鵬）