金銀花源miR2911 靶向非洲豬瘟病毒基因區域分析

杜非凡 陳星宇 李 碩 張 昊 常怡悅 張自瑞 閆衛疆 肖 非 孫雪梅 盛金良 孫延鳴* 張彥兵,*

（1 石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2 新疆泰昆集團股份有限公司，新疆昌吉 831203）

miRNA（microRNA）是一類長約19～25 nt 的非編碼RNA，具有較高的保守性[1,2]。一般miRNA 的成熟需要經過3 個階段：在細胞核中轉錄得到pri-miRNA、由RNase Ⅲ-Drosha 酶剪切得到pre-miRNA、由premiRNA 運轉出核進入胞漿內并成熟[3-7]。含有miRNA 引導鏈的RISC 與靶mRNA 的3’UTR 不完全互補配對時會阻礙靶蛋白的翻譯，從而抑制目的基因的表達；miRNA 與靶mRNA 發生完全互補配對時，靶mRNA 則被AGO2 蛋白降解[8]。由于miRNA 序列、結構多樣，其在生物調控及蛋白質合成方面發揮著重要作用，包括病毒細胞的增殖與凋亡、癌癥治療等方面[9,10]。

金銀花是一種重要的藥用植物，因為具有多種生物活性，所以在生理上主要有解熱、抗炎、抗菌、抗氧化等作用，其作為中藥材被廣泛應用于治療流感病毒等方面[11]。2015 年Zhou 等[12]發現灌服金銀花湯后的小鼠體內miR2911 豐度較高。由于miR2911 的功能在于能夠靶向多種甲型流感病毒（IAVs），所以化學合成的miR2911不但可以顯著抑制H1N1 的PB2 和SN1 蛋白的表達，而且還能降低H5N1 感染小鼠的死亡率。最新研究顯示，miR2911 可有效抑制SARS-CoV-2（新型冠狀病毒）的復制，并且miR2911 在SARS-CoV-2 基因區域存在多個抑制靶點[13]，因此，猜測金銀花miR2911 可能具有較廣泛的抗病毒作用。

非洲豬瘟病毒（ASFV）是一種雙鏈DNA 病毒，屬于非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae） 非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）。ASFV 病毒粒子直徑一般可達260～300 nm，其基因組長度介于170～193 kb，可編碼150～167 個蛋白。并且ASFV 是一種烈性病毒，急性期ASFV 可引起豬100%的死亡率，感染ASFV 的病豬癥狀包括嗜睡、血性腹瀉、高熱、血管變化等[14,15]。目前已研發出的非洲豬瘟滅活疫苗無法完全誘導生豬機體產生中和抗體，且效果不佳，而基因缺失疫苗正在研發中。因此，針對非洲豬瘟病毒缺乏有效的治療手段，仍需要以防控為主。

鑒于miR2911 具有強大的抗病毒功效，本文通過生物信息學等方法，探討金銀花源miR2911 對ASFV 相關基因靶向區域，以期為研發抗ASFV 感染的藥物提供理論依據。

1 試驗材料與方法

1.1 金銀花miR2911 序列獲得

在miRbase（http://www.mirbase.org/index.shtml）數據庫中，下載金銀花源miR2911 的成熟序列，5’-GGCCGGGGGACGGACUGGGA-3’。

1.2 ASFV 全基因序列下載

進入NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 數據庫，搜索ASFV 的全基因組序列，下載我國當前非洲豬瘟病毒流行毒株的全基因組序列。

1.3 miRNA 靶向ASFV 基因區域預測

在windows 環境下，打開網頁版本的miRanda 軟件（http://www.bioinformatics.com.cn/local_miranda_m iRNA_target_prediction_120），在操作界面輸入miRNA序列和ASFV 全基因組序列，點擊分析，則會運行程序顯示分析結果。

1.4 靶向區域進化樹構建

在構建miR2911 靶向ASFV 基因區域進化樹時，先將每個病毒被靶向區域與其他流行毒株進行比對，從而獲取不同毒株相應靶向區域。每個毒株被靶向區域按照一定順序拼到一起，1 個毒株作為1 個整體的基因序列，利用MAGE7 軟件，按照臨近法構建進化樹，相當于多基因法構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 miR2911 靶向ASFV 基因區域預測

利用miRanda 軟件預測，首先，將miR2911 分別靶向ASFV 的NP1450L 基因、GL1340L 基因、MGF_110-5L-6L 基因及EP1242L 基因等4 個基因的2 個區域，其中對NP1450L 基因130 231～130 255 區域的靶向性較好，其分值為108 分，自由能（Energy）為-35.37 kCal/Mol。其次，miR2911 對ASFV 的G1340L 基因的112 860～112 881 區域靶向時，其分值可以達到102分，自由能（Energy） 為-25.40 kCal/Mol；在靶向ASFV 的EP1242L 基因的2 個區域（69 000～69 022 和67 435～674 54）時，區域69 000～69 022 的靶向性相對較高，其分值可達99 分，自由能可達到-32.02 kCal/Mol；靶向ASFV 的MGF_110-5L-6L 基因的10 218～10 237 區域，其分值為93 分，自由能為-23.81 kCal/Mol。綜合miR2911 靶向AFSV 的4 個基因的各項數據，表明miR2911 具有潛在抑制AFSV 中NP1450L基因和ASFV G1340L 基因復制的能力（圖1）。

圖1 miR2911 靶向ASFV 基因分析結果

2.2 miR2911 靶向ASFV 基因區域序列進化樹分析

在NCBI 數據庫中，下載miR2911 靶向ASFV 基因區域序列，將多個區域按先后串聯，利用MEGA 7.0 軟件中鄰近法構建miR2911 靶向病毒基因區域進化樹，miR2911 靶向ASFV 的基因區域100%同源（圖2）。

圖2 miR2911 靶向ASFV 基因多區域序列進化樹

3 討論

金銀花性甘、寒，具有多種生物活性，可起到清熱解毒，消炎退腫的作用；金銀花與其他中藥配伍后可預防和治療病毒性感染。據報道，金銀花源miR2911 通過與病毒特定基因序列的相互作用，可以有效抑制病毒的復制，在抗病毒方面發揮著重要作用。在畜禽養殖過程中，抗病毒感染與治療是當前全球范圍內探討的一個熱點話題。研究表明，miR2911 性質穩定，經口服可被動物體吸收。鑒于miR2911 的抗病毒作用，以miR2911為研究對象，通過應用miRanda 軟件分析miR2911 靶向ASFV 基因的具體區域、分值及自由能的高低，從而進一步分析miR2911 靶向病毒區域的保守性，以期為治療豬病毒性傳染病提供借鑒。

自2018 年非洲豬瘟疫情在我國發生以來，豬主要病毒性傳染病防控形勢愈發嚴峻，“老病未滅，新病又起”是我國目前養豬業面臨的主要問題。目前病毒性傳染病往往需要免疫疫苗進行防控，還沒有特效治療藥物。經研究考慮到金銀花源miR2911 在抵抗流感病毒感染和新型冠狀病毒感染時發揮的中藥作用，猜測金銀花miR2911 可能在ASFV 基因上存在潛在的靶向位點，并利用miRanda 軟件成功預測了miR2911 在ASFV 基因上的靶向位點。由于miR2911 在豬病毒基因上的靶向區域很多，所以將得分低于82 分的全舍棄。miR2911 可靶向ASFV 的4 個基因，其中在ASFV 的EP1242L 基因上有2 個靶向區域。

非洲豬瘟病毒中的NP1450L、EP1242L 和MGF_110-5L-6L 等3 個基因在病毒感染生豬過程中發揮重要作用。NP1450L 蛋白與RNA 聚合酶的最大亞基具有廣泛的相似性。而EP1242L 蛋白類似于第2 大RNA 聚合酶亞基。NP1450L 蛋白和EP1242L 與真核RNA 聚合酶Ⅱ的亞基更相似；NP1450L 和EP1242L 主要在非洲豬瘟病毒感染晚期開始表達。外源表達MGF110-5L-6L蛋白還可誘導高爾基體和過氧化物酶體的亞細胞定位與形態發生顯著改變，認為MGF110-5L-6L 蛋白可能通過影響內質網腔中氧化還原穩態、蛋白質分泌途徑及相關膜性細胞器發生等，而打破細胞的正常生理功能穩態，導致豬只發病。已證實外源表達MGF110-5L-6L蛋白可誘導宿主細胞發生內質網應激和未折疊蛋白反應，并通過活化PERK 和PKR 激酶觸發e IF2α 的磷酸化，進而誘發綜合應激反應，致使豬機體的細胞蛋白翻譯阻滯以及應激顆粒產生。

miR2911 在非洲豬瘟病毒基因中的靶點非常保守，不同時期和不同地區的非洲豬瘟病毒分離毒株的靶點同源性很高。因此，金銀花源miR2911 具有潛在抑制當前非洲豬瘟病毒流行毒株復制的作用。下一步，將與其他實驗室合作，構建miR2911 過表達質粒，在細胞水平驗證miR2911 抑制上述病毒復制的能力；在此基礎上，進一步將miR2911 導入酵母菌、馬鈴薯、番茄、苜蓿等植物中，通過給豬只飼喂上述轉基因菌株的植物，提高豬抗病毒的能力。并通過檢測豬只排毒情況和病理損傷程度，在動物體內開展miR2911 抗病毒感染作用。

4 結論

本試驗通過生物信息學方法預測了miR2911 對非洲豬瘟病毒關鍵基因的靶向性并對此展開分析。miR2911可較好地靶向非洲豬瘟病毒的NP1450L 基因，顯示出miR2911 潛在抑制非洲豬瘟病毒復制的能力。根據遺傳進化樹結果顯示miR2911 在非洲豬瘟病毒基因上的靶向區域100%同源，表明miR2911 具有靶向不同流行非洲豬瘟病毒毒株的能力。綜上所述，本文發現miR2911 對于非洲豬瘟病毒具有潛在抑制作用，為進一步探索其抑制原理及相關藥物的研發提供理論依據。