東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2基因的分子特性及系統進化分析

王思懿,胡 穎,劉小玉,荊 欣,馮佩林,朱樂冉,姚雨桐,陳大福,2,郭 睿,2*,徐國鈞*

(1. 福建農林大學動物科學學院(蜂學學院),福州 350002;2. 福建農林大學蜂療研究所,福州 350002)

意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(簡稱意蜂),是一種優良的西方蜜蜂Apismellifera亞種,具有優越的采集和造脾能力,在養蜂生產中廣泛使用(曾志將, 2009)。東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae特異性侵染成年蜜蜂的中腸上皮細胞,可引起宿主的細胞凋亡和免疫應答抑制,消化系統紊亂,記憶受損和壽命縮短,導致的微孢子蟲病給養蜂生產造成較大損失(Burnham, 2019)。目前,東方蜜蜂微孢子蟲廣泛感染世界各地的飼養蜂群(梁勤和陳大福,2009)。雖然東方蜜蜂微孢子蟲的參考基因組(Pelinetal., 2015)和全長轉錄組均已公布,但轉基因操作技術體系的缺失導致相關基因功能研究較為滯后。

脂肪酸輔酶A連接酶(fatty acid CoA ligase,FAL)也稱脂酰輔酶A合成酶(acyl-CoA Synthetase,ACS)在真核細胞中廣泛存在,催化長鏈脂肪酸轉化為酰基輔酶A,在脂質生物合成、能量合成及基因表達調控等方面起到重要作用(Dongetal., 2012)。Sung(2007)等研究發現用脂肪酸輔酶A連接酶家族的抑制劑Triacsin C處理后,細胞的生長受到抑制,且細胞凋亡顯著增加。Tenagy(2019)等發現在培養基中加入Triacsin C后,3種馬拉色菌Malasseziaspp.的生長受到抑制且這種抑制與Triacsin C呈劑量依賴關系。然而,東方蜜蜂微孢子蟲的LCFAL研究迄今仍然缺失,相關信息匱乏。

前期研究中,筆者團隊測定了東方蜜蜂微孢子蟲侵染意大利蜜蜂工蜂的過程中nce-miR-15338及其靶基因LCFAL2在的表達譜,發現二者均呈持續下降的表達趨勢(未發表數據)。本研究對東方蜜蜂微孢子蟲孢子中的LCFAL2基因進行表達驗證,進而分析LCFAL 2蛋白的分子特性,并對東方蜜蜂微孢子蟲和其他物種的LCFAL 2進行系統進化分析,以期豐富東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL2的基本信息,并為深入開展LCFAL2的功能研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 LCFAL 2基因的生物信息學分析

根據前期預測出的東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL2序列,利用NCBI網站上(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/)的ORF工具對LCFAL 2的氨基酸序列進行預測。通過Expasy網站(https://www.espasy.org/resources)上的Protparam、ProtScale和SWISS-model等軟件分析LCFAL 2的理化性質、親水性和三級結構。采用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM和SOPMA等軟件預測信號肽、磷酸化位點、跨膜結構域及二級結構。通過PSORTⅡ軟件(Sedaghat-Nejadetal., 2021)進行亞細胞定位預測。

1.2 LCFAL 2蛋白的保守基序和結構域預測

使用MEME軟件(Bailey and Elkan, 1994)預測東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae、蜜蜂微孢子蟲Nosemaapis、東方赤孢子蟲Hamiltosporidiumtvaerminnensis、腸腦炎微孢子蟲Encephalitozoonintestinalis、兔腦炎微孢子蟲Encephalitozooncuniculi、巨蟹腸孢菌Enterosporacanceri、畢氏腸細胞蟲Enterocytozoonbieneusi、煙粉虱Spraguealophii、管孢屬微孢子蟲Tubulinosemaratisbonensis、褶皺臂尾輪蟲Brachionusplicatilis。LCFAL 2的保守基序,參數為:結構域最小氨基酸殘基數為 6 aa,結構域最大氨基酸殘基數為50 aa,不同結構域的數量為5,其余參數為默認設置。通過NCBI Conserved Domains Search (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/cdd)對LCFAL 2蛋白的結構域,再使用TBtools軟件進行分析。

1.3 LCFAL 2蛋白的系統進化分析

采用Blast工具將東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2氨基酸序列比對到GeneBank數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)以搜索序列相似性較高的其他物種的LCFAL 2。通過Mega 11.0軟件(Tamuraetal., 2021)對東方蜜蜂微孢子蟲和上述其他物種的LCFAL 2構建系統進化樹,選擇默認參數。

2 結果與分析

2.1 LCFAL 2蛋白的分子特性

LCFAL2共含有1 836個核苷酸,可編碼611個氨基酸(MEKRTNKNKFGEISHTNFLENIEC LQNGSKTLLEVFSSTCQKYENKNFLGTIKDNKLIWQT FSEINIKIQKLSTFLNSILQENAIFGIFSVNRYEWIVSE LAGYMSNCINCPLYSTFGPDAVNLIINETEMTVCCVS GDKAESLLDILLSSKKHFLKDIIIFDDDFNRENEFLDL EINVHYISQIFLETEINLRSNKLDLNSLATICYTSGTSG IPKGVQITHKNFIANISAFFRGQTKNEMYRVSDSEVY LSYLPLAHIMERIVVHVITSVGGSIGFYRGNPKKIESD YLIVRPTFIIAVPRVLNIFKQKIEEGVAERGKLSKFIFN IALKIKMWLQCRGSVKCWPLDSLIFNKISNKFGGRIK ACLCGSAALSHNVLTFLKATMSMRIFQGYGQTETTG ATTLCPLDGDNFDNVGIPYPSCKIKLSPVDGHDKYSG ELLVKGDNVTKGYFKRPELNAELFTEDNWLKTGDIA RFYNGVFKIIGRTKDRFKTGHGEYIEPEKIETLLTGGL IQDIIITTLKGYDKLLALVVCEKEGIQEKEVLDYLIKK GNKLVDDKKMNRYEIPSHIILLKKGFDTFDGGKLLSP TAKKIRVKIEKFFYEDIKRALSKK)。LCFAL 2的分子式為C3145H4985N813O904S23,分子量約為69.39 kDa,脂溶系數為96.82,等電點為8.79。LCFAL 2中含量最高和最低的氨基酸分別為異亮氨酸和色氨酸(表1);包含71個負電荷氨基酸,其中天冬氨酸和谷氨酸分別有30和41個;82個正電荷氨基酸,其中精氨酸和賴氨酸分別有21個和61個(表1)。

表1 LCFAL 2蛋白的氨基酸組成

LCFAL 2的平均親水系數為-0.161,親水氨基酸數量比疏水氨基酸多(圖1-A),說明其可能為親水性蛋白。在LCFAL 2中不存在跨膜螺旋域(圖1-B),LCFAL 2中不存在典型的信號肽,說明其可能為胞內蛋白(圖1-C)。另外,LCFAL 2含有64個磷酸化位點,包括27個絲氨酸磷酸化位點,14個酪氨酸磷酸化位點及23個蘇氨酸磷酸化位點(圖1-D)。

圖1 LCFAL 2的親水/疏水性(A)、跨膜螺旋域(B)、信號肽(C)和磷酸化位點(D)

LCFAL 2含有240個(39.28%)α-螺旋,124個(20.29%)延長鏈,48個(7.86%)β-轉角,199個(32.57%)無規則卷曲(圖2-A)。LCFAL 2三級結構的模板為5mst.1.A,LCFAL 2與5mst.1.A之間的同源性為21.44%(圖2-B)。此外,預測LCFAL 2同時定位于細胞質、線粒體和細胞核,占比分別為52.20%、21.70%和17.40%。

圖2 LCFAL 2的二級結構(A)和三級結構(B)

2.2 LCFAL 2蛋白的保守基序與結構域分析

在東方蜜蜂微孢子蟲的LCFAL 2中鑒定到 6個保守基序:motif 1, motif 2, motif 3, motif 4, motif 5和motif 6;類似地,在蜜蜂微孢子蟲、東方赤孢子蟲(TBU15843.1)、腸腦炎微孢子蟲、兔腦炎微孢子蟲、巨蟹腸孢菌、畢氏腸細胞蟲、煙粉虱、管孢屬微孢子蟲和褶皺臂尾輪蟲的LCFAL 2蛋白中也鑒定到上述6個保守基序(圖3),說明LCFAL 2在東方蜜蜂微孢子蟲和其他9個物種中高度保守。東方赤孢子蟲(TBU20354.1)中不含保守基序6。此外,東方蜜蜂微孢子蟲、管孢屬微孢子蟲、蜜蜂微孢子蟲、巨蟹腸孢菌、煙粉虱、畢氏腸細胞蟲、東方赤孢子蟲、褶皺臂尾輪蟲的LCFAL 2含有AFD_class_I superfamily結構域;在兔腦炎微孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲的LCFAL 2含有FAA1結構域。

圖3 東方蜜蜂微孢子蟲和其他9個物種LCFAL 2的保守基序和結構域

2.3 LCFAL 2蛋白的系統進化分析

搜索結果顯示,東方蜜蜂微孢子蟲含有1個LCFAL 2,蜜蜂微孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲、巨蟹腸孢菌、腸細胞蟲、煙粉虱、管孢屬微孢子蟲和褶皺臂尾輪蟲也含有1個LCFAL 2,而東方赤孢子蟲和兔腦炎微孢子蟲均含有2個LCFAL 2(表2)。系統進化分析結果顯示,東方蜜蜂微孢子蟲、蜜蜂微孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲、兔腦炎微孢子蟲、巨蟹腸孢菌和畢氏腸細胞蟲的LCFAL 2聚為一個大支,而東方赤孢子蟲、煙粉虱和管孢屬微孢子蟲的LCFAL 2聚為另一個大支(圖4);東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2(XP_024331795.1)與蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2(EQB61677.1)聚為一支,進化距離最近(圖4)。以上結果說明東方蜜蜂微孢子蟲與蜜蜂微孢子蟲的LCFAL 2親緣關系最近,LCFAL 2在不同微孢子蟲中具有較高的保守性。

圖4 鄰接法構建基于LCFAL 2的東方蜜蜂微孢子蟲與其他9個物種的系統進化樹

表2 東方蜜蜂微孢子蟲與其他9個物種的LCFAL 2概覽

3 結論與討論

目前,東方蜜蜂微孢子蟲的LCFAL2研究缺失。本研究中,生物信息學分析結果顯示,東方蜜蜂微孢子蟲的LCFAL2含有1 836個核苷酸,編碼611個氨基酸,分子式為C3145H4985N813O904S23,分子量約為69.39 kDa,脂溶系數為96.82,等電點為8.79,說明該氨基酸為堿性氨基酸;平均親水系數為-0.161,親水氨基酸數量比疏水氨基酸多(圖1-A),說明LCFAL 2可能為親水性蛋白;不含跨膜結構域(圖1-B),說明LCFAL 2可能不是跨膜蛋白;不存在典型的信號肽,說明LCFAL 2可能是胞內蛋白(圖1-C);主要定位于細胞質,進一步說明LCFAL 2可能在細胞質中發揮功能。以上結果豐富了東方蜜蜂微孢子蟲的LCFAL2的基本信息,為進一步開展相關研究提供了理論依據。

本研究發現東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2中含有6個保守基序(motif 1, motif 2, motif 3, motif 4, motif 5和motif 6),上述6個保守基序同樣存在于蜜蜂微孢子蟲、東方赤孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲、兔腦炎微孢子蟲、巨蟹腸孢菌、畢氏腸細胞蟲、煙粉虱、管孢屬微孢子蟲和褶皺臂尾輪蟲的LCFAL 2中(圖3),表明LCFAL 2在上述物種中較為保守。此外,在東方蜜蜂微孢子蟲和蜜蜂微孢子蟲等8個物種中均鑒定到AFD_class_I superfamily結構域,表明LCFAL 2在上述8個物種中具有較高的保守性。AFD_class_I superfamily屬于非核糖體肽合成酶A結構域,負責催化ATP形成(李根,2017)。推測東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL 2具有催化ATP形成的功能,參與能量合成。

東方蜜蜂微孢子蟲與蜜蜂微孢子蟲是感染蜜蜂的兩種主要微孢子蟲,互為姐妹種(梁勤和陳大福,2009)。本研究中,系統進化分析結果顯示東方蜜蜂微孢子蟲與蜜蜂微孢子蟲的LCFAL 2聚為一支,進化距離最近,表明二者的LCFAL 2親緣關系最近(圖4),符合客觀事實。研究表明LCFAL 2參與真核細胞的增殖、分化和凋亡(Tomodaetal., 1991;Xuetal., 2011)。推測LCFAL 2在東方蜜蜂微孢子蟲與蜜蜂微孢子蟲侵染蜜蜂宿主的過程中發揮功能,值得進一步探究。下一步擬建立東方蜜蜂微孢子蟲侵染意大利蜜蜂工蜂或中華蜜蜂Apisceranacerana工蜂的模型(Paldietal., 2010),并通過飼喂特異性dsRNA或siRNA對處于侵染過程的東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL2進行RNAi,以探究LCFAL2的分子功能。