黑水虻消化道形態及組織結構的觀察

孫秋璇,李向策,譚小紅,游翠紅,董燁煒,高紅燕,黃燕華*,周 萌*

(1．仲愷農業工程學院,健康養殖創新研究院,廣州 510225;2．仲愷農業工程學院,動物科技學院,廣州 510225;3．廣東省水環境與水產品安全工程技術研究中心,廣州 510225;4．廣州市水產病害與水禽養殖重點實驗室,廣州 510225)

全球餐廚垃圾、畜禽糞污等有機廢棄物的持續產生和資源化利用不足,造成了環境污染和資源浪費的雙重壓力。聯合國糧農組織提倡利用昆蟲轉化有機廢棄物,實現廢棄物的無害化處理的同時,還可生產優質的昆蟲蛋白和脂肪(Riudavetsetal., 2020)。黑水虻Hermetiaillucens屬于雙翅目水虻科扁角水虻屬,廣泛分布于熱帶和溫帶地區(Wang and Shelomi, 2017)。其幼蟲能以多種有機廢棄物為食,且繁殖速度快、生物量大、蟲體營養豐富(Cifuentesetal., 2020; Hopkinsetal., 2021),具有其它昆蟲難以比擬的優勢,成為全球最具開發潛力的資源性昆蟲之一。

近年來的大量研究表明,黑水虻幼蟲、預蛹或其生物制品具有良好的飼用價值,可部分甚至完全替代魚粉、豆粕等傳統飼料原料(Mohanetal., 2022),保證動物的生長性能,提高其免疫力與抗病力(許豐孟等, 2020; 余苗等, 2020; Heueletal., 2021)。

黑水虻幼蟲對有機廢棄物高效的生物轉化能力主要得益于其強大的消化系統(Clissoldetal., 2010)。Bonelli等(2019)根據黑水虻中腸組成細胞的形態功能特征以及管腔pH,將其劃分為3個區域,并評估了各段涉及的消化酶活性,總結了其功能特征。在此基礎上,Sun等(2021)比較了攝食不同有機廢棄物黑水虻幼蟲的消化道pH值、中腸細胞形態及消化酶活性的差異,揭示了黑水虻廣泛適應多種食物的消化生理基礎。此外,對取食不同有機廢棄物黑水虻腸道微生物群落的比較研究發現,腸道菌群的多樣性受食物的影響較大,但厚壁菌門始終占據優勢地位(Brunoetal., 2019)。然而,作為一種廣受關注的研究對象,對黑水虻消化道器官和組織水平的研究仍較少,尤其是其消化道的顯微與超微結構缺乏系統報道。

為此,本研究對黑水虻主要生長階段(幼蟲、預蛹、成蟲)的消化道形態進行了比較,并重點對幼蟲消化系統各部分的組織結構進行了顯微和超微觀察,為深入了解黑水虻的消化生理研究提供形態學和組織學依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及其飼養

供試昆蟲黑水虻在本實驗室內孵化和養殖。黑水虻蟲卵由廣東省農業科學院動物科學研究所提供。以含水量60%的膨化豆粕(粗蛋白42%,粗脂肪8%)作為培養基,在環境溫度28℃、相對濕度60%的條件下孵化并養殖至3日齡。隨后將100頭幼蟲轉移到塑料盒(規格18.5 cm×12 cm×5.5 cm)中,每盒放置200 g養殖基質(豆粕∶麥麩=1∶1),在其中添加適量無菌水保持養殖基質水分含量為60%±2%,共3個重復。養殖期間環境保持在溫度28±1℃,相對濕度70%～80%,自然光照,每3 d補充適量養殖基質,保證營養供應。分別于養殖過程中,選取生長情況良好的5齡幼蟲(14日齡)、預蛹(16日齡)及成蟲(30日齡)用于消化道形態學和組織學研究。

1.2 消化道樣品采集與觀察

1.2.1消化道分段

結合本課題組前期研究中對黑水虻消化道pH的測定結果(Sunetal., 2021),為進一步明確主要消化部位中腸的功能結構,在本研究中,將中腸劃分為分別呈現酸性、強酸性和堿性的前、中、后三部分;此外結合中腸中段形態及細胞組成的差異(Bonellietal., 2019),將中段進一步細分為直徑較細的A段以及直徑較粗的B段。

1.2.2形態學觀察

每盒分別取10頭黑水虻5齡幼蟲、預蛹及成蟲,用解剖剪沿蟲體腹壁中線剪開,暴露體腔,取出整個消化道,去除消化道上黏附的組織,用PBS緩沖液沖洗干凈,并用濾紙吸干水分;使用游標卡尺(JING, SIDA Rang: 150 mm; Jinhua, China, P.R.)測量體長與消化道長度,使用體視鏡(Mshot MZ62; Guangzhou, China, P.R.)觀察消化道形態并拍照。

1.2.3石蠟切片制作及觀察

取出幼蟲的完整消化道,分離出唾液腺、前腸、中腸、后腸、馬氏管,分別浸入4%多聚甲醛固定24 h。經75%、85%、90%、95%和100%乙醇溶液逐級脫水后,用石蠟包埋修整,將蠟塊置于手動切片機切出厚4 μm的切片;用載玻片撈片并于烘箱60℃烤干后,使用二甲苯以及梯度乙醇中脫蠟至水,將切片分別放入蘇木素和伊紅染液中染色。將染好色的切片經95%、100%乙醇及二甲苯脫水透明后,用中性樹膠封片。使用光學顯微鏡(LeicaDM500; Wetzlar, Germany)對組織切片進行觀察。

1.2.4掃描電鏡制片及觀察

取出幼蟲完整的消化道,分別取前腸、中腸、后腸及馬氏管組織,修整成大小為5 mm×5 mm×2 mm的塊狀,用2.5%戊二醛固定液(PBS 0. 1 M,pH=7.4)在4℃下固定4 h,然后用PBS沖洗3次,再置于1%鋨酸-0.1 mol/LPBS進行后固定30 min,再用PBS緩沖液沖洗3次。為了觀察消化道管腔內表面結構,在脫水前先用解剖針剖開管腔,用PBS緩沖液將內容物沖洗掉。分別用50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進行脫水,每個濃度脫水15 min;脫水結束后,放入乙酸異戊酯10～20 min,移入臨界點干燥儀(Quorum K850; East Sussex, UK.),進行干燥。將組織塊用導電膠粘貼在標本臺上(觀察面朝上),用離子濺射儀(HITACHI MC1000; Tokyo, Japan)進行鍍膜(金膜)。放入掃描電子顯微鏡(HITACHI U8010; Tokyo, Japan)進行觀察并采集圖像分析。

1.3 數據分析

使用SPSS 19.0軟件(Armonk, NY, USA)對黑水虻5齡幼蟲、預蛹及成蟲的體長、腸道長和中腸長分別進行了單因素ANOVA檢驗,顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 5齡幼蟲、預蛹及成蟲的消化道形態

體視顯微鏡下可見,黑水虻幼蟲的消化道包括前腸、中腸、后腸三部分,總長137.44±13.07 mm,為體長的6.85±0.18倍(圖1-A,表1)。前腸由食道和前胃組成,食道呈細長管狀,前胃膨大為球狀,可見食道末端延入前胃,形成套管狀結構。中腸始于前胃末端,是一條粗細不均的管道,為消化道中最長的部位,是整個消化道長度的0.71±0.03倍(表1)。后腸以馬氏管著生處與中腸為界,粗細均一。馬氏管呈細長盲管狀,分為4支。

表1 黑水虻5齡幼蟲(A)、預蛹(B)及成蟲的體長、腸道長和中腸長(n=8)

圖1 黑水虻5齡幼蟲(A)、預蛹(B)及成蟲(C)的消化道形態

預蛹的消化道形態與幼蟲相似(圖1-B),但較幼蟲階段其腸道直徑變小,長度縮短為97.75±7.65 mm,是體長的5.22±0.18倍。其中,中腸長度為消化道長度的0.63±0.06倍(表1)。

與幼蟲和預蛹相比,成蟲的消化道形態發生了明顯變化,總長變短,長14.90±1.26 mm,是體長的0.96±0.08倍(圖1-C,表1)。前胃消失,出現了嗉囊,以一細長管開口于食道末端。中腸長度進一步縮短為7.78±1.36 mm,是整個消化道長度的0.52±0.07倍(表1);前端出現一對囊狀、對稱分布的胃盲囊,與食道相接。后腸分化為回腸、結腸和直腸3部分,其中回腸和直腸呈短而膨大的囊狀。后腸與中腸交界處著生馬氏管,依然分為4支。

2.2 幼蟲消化系統的顯微與超微結構

2.2.1唾液腺

黑水虻幼蟲的唾液腺由兩支對稱、膨大的管狀腺體和腺管組成,兩個腺管匯合為一個分泌管與口腔相通(圖2-A)。每個腺體長0.85±0.15 mm,光學顯微鏡下可觀察到腺體細胞較大,細胞核扁圓形,染色深,胞質染色淺,似粘液性腺細胞(圖2-B,C)。對唾液腺的管狀腺體進行掃描電鏡觀察,發現腺壁較厚,似有縱肌圍繞,腺壁內表面粗糙,似有微絨毛突起入腺腔(圖2-D)。

圖2 黑水虻5齡幼蟲唾液腺的形態與組織結構

2.2.2前腸

黑水虻幼蟲的前腸由食道與前胃組成,食道末端延伸至前胃內(圖3-A)。由內至外,食道組織包括呈刺狀突起的角質內膜層、環肌層和縱肌層(圖3-B)。前胃膨大為囊狀,由內至外也分為三層:內層為食道的延伸,與食道結構相似;外層由單層扁平上皮細胞構成;中間層為緊貼外層的圍食膜,其內容物呈嗜酸性染色。圍食膜下端一直延伸至中腸(圖3-A,C)。掃描電鏡顯示,食道深入前胃部分的內壁可見向管腔突出的胃刺,整齊而密集,平均長度為6.36 μm(圖3-D)。2.2.3中腸幼蟲中腸前段由內到外,分為圍食膜層、腸壁細胞層、底膜層及肌層(圖4-A)。其中,腸壁細胞主要由柱狀上皮細胞、分泌細胞以及再生細胞構成。柱狀細胞是腸道上皮的主要組成細胞,其頂端具有微絨毛結構,通過掃描電鏡也可觀察到腸壁上布滿大量的微絨毛(圖4-C,D)。再生細胞隨機分布在腸道上皮基底部,分泌細胞位于腸道基底區(圖4-B)。

圖3 黑水虻5齡幼蟲前腸的顯微和超微結構

圖4 黑水虻5齡幼蟲中腸前段顯微與超微結構

根據腸道細胞形態的差異,中腸中段可明顯分為A、B兩段。其中,A段腸壁較厚(圖5-A),主要由柱狀細胞、分泌細胞、再生細胞和杯狀的銅細胞構成(圖5-B);B段腸壁較薄(圖5-C),主要由單層扁平上皮細胞構成(圖5-D)。掃描電鏡顯示,中腸中段內壁較光滑,未見微絨毛結構(圖5-E,F)。

圖5 黑水虻5齡幼蟲中腸中段的顯微結構

中腸后段與前段組織結構類似,腸壁細胞以柱狀上皮細胞為主,在基底區可以觀察到分泌細胞和再生細胞的分布(圖6-A,B)。掃描電鏡結果顯示,中腸后段具有發達的微絨毛,間布有大量囊泡(圖6-C,D)。

圖6 黑水虻5齡幼蟲中腸后段顯微結構

2.2.4后腸

黑水虻幼蟲的后腸由內至外分別為內膜層、腸壁細胞層和肌層(圖7-A,B)。內膜層薄,腸壁細胞單層,排列稀疏,細胞核大。肌層不發達,縱肌在內,環肌在外。通過掃描電鏡,可觀察到腸腔內褶皺豐富(圖7-C),上附數量較多的桿狀細菌(圖7-D)。

圖7 黑水虻5齡幼蟲后腸顯微和超微結構

2.2.5馬氏管

馬氏管管壁由單層上皮細胞構成,圍繞形成管腔;細胞排列稀疏,可見大而清晰的細胞核(圖8-A),向管腔面排列有密集的頂端微絨毛(圖8-B,C),掃描電鏡下可觀察到內表面的微絨毛呈豆芽狀(圖8-D)。

圖8 黑水虻5齡幼蟲馬氏管的顯微及超微結構

3 結論與討論

3.1 黑水虻不同發育階段消化道的形態特征

昆蟲的消化道根據其發生來源和機能的不同,可分為前腸、中腸和后腸,它們分別承擔著食物攝取與臨時儲存、營養物質的消化與吸收,以及形成和排出食物殘渣的功能(Nation, 2002)。對于變態發育的昆蟲來說,從幼蟲到成蟲,其大部分內部器官,包括消化道,在蛹期將進行重塑(Miguel-Aliagaetal., 2018),以適應昆蟲在不同發育階段組織器官生理功能的轉換。本研究中,也觀察到了在黑水虻在三個發育階段消化道形態上的顯著差異。

類似家蠅Muscadomestica等雙翅目幼蟲,黑水虻幼蟲的前腸也由口、食道和前胃組成。前胃較發達,除儲存食物外,還可調節食物進入中腸,兼有過濾的作用(牛長纓等, 1999;Bonellietal., 2019)。中腸是昆蟲最重要的消化器官(Cacciaetal., 2019)。黑水虻幼蟲中腸長度占據了整個消化道長度的近2/3,這與蚋、蠅等其它雙翅目的消化道特征相符合(Boonsriwongetal., 2007; 尋慧等, 2011)。進入預蛹期(6齡幼蟲)后,黑水虻的口器被角質板覆蓋并硬化(Barrosetal., 2019),停止攝食,為化蛹做準備(Tomberlinetal., 2009; 蕭鴻發等, 2020)。本研究在黑水虻預蛹的腸道中也未發現食糜,且和幼蟲相比,預蛹腸道直徑變小,長度變短,但在形態結構上尚未出現明顯的變化。

本研究觀察到,和幼蟲及預蛹相比,黑水虻成蟲的消化道形態和結構發生了劇烈變化,包括前胃消失、出現了嗉囊和胃盲囊、中腸長度進一步縮短、后腸分化為回腸、結腸和直腸?？梢?黑水虻成蟲的消化道具有高度分化的結構及功能分工,可能仍具有較強的消化與吸收能力,這與某些對黑水虻成蟲消化生理研究的結果相符。Bruno等(2019)的研究表明,黑水虻成蟲腸道重塑出了具有功能性的上皮結構,糖類的攝入對部分消化酶的表達產生了一定的影響;給予成蟲富含蛋白質的牛奶,能夠增加雌蟲的壽命且增加產卵量(Bertinettietal., 2019),并指出可以通過調控成蟲飲食以提高其在大規模飼養過程中的性能。李芷瑜等(2018)也在黑水虻成蟲的口器唇瓣上發現了可感受機械壓力和味道的錐形和毛形感受器,且具有對味覺進行反饋的功能,表明成蟲可能具有一定的食物選擇和感受能力。黑水虻成蟲的食道后方具有較發達的嗉囊,是雙翅目昆蟲特有的結構,主要起到暫時儲存食物的作用(Boonsriwongetal., 2007),還能夠確保腸道內容物進入主消化道。成蟲中腸前端出現了胃盲囊,可能是由于中腸縮短,無法對食物進行充分的消化和吸收,需要通過胃盲囊增大中腸的消化吸收面積,滿足機體對于營養物質的吸收需求(王蔭長, 2004; 毛蕾, 2015)。推測黑水虻成蟲出現的胃盲囊,可能也具有類似功能。成蟲的中腸顯著縮短,后腸分化為回腸、結腸和直腸,也和已報道的雙翅目昆蟲成蟲類似(Gillott, 2005);其中一些組織特征可能和適應成蟲期羽化、飛翔、交配、授精和產卵等行為有關(陳長琨等, 1996)。以上對黑水虻成蟲的消化道形態特征的描述,為進一步了解黑水虻成蟲的攝食與消化生理提供了基礎數據。

3.2 黑水虻幼蟲消化道的組織結構

與家蠅幼蟲等其它雙翅目昆蟲相比,黑水虻幼蟲的食性更廣泛、對營養物質的吸收轉化率更高(Mirandaetal., 2021),這主要得益于其強大的消化系統,包括消化道結構和功能的細分、針對營養不均衡的食物調節消化酶的分泌、可高效轉化多種有機廢棄物的腸道微生物(Clissoldetal., 2010; 鄧雨英等, 2020; Zhanetal., 2020)。本研究初步查明了黑水虻消化系統的組織結構,為進一步深入黑水虻消化生理的研究補充了形態學和組織學數據。

唾液腺是昆蟲消化系統中的重要分泌腺,其形態和功能在不同昆蟲種類中差異較大(任朝都, 2021)。本研究發現,黑水虻幼蟲的唾液腺由兩支對稱、膨大的管狀腺體和腺管組成,分布于食管兩側,腺體外覆脂肪體,這和虻、蠅等雙翅目昆蟲的唾液腺形態類似(王蔭長, 2004)。光鏡觀察結果表明,幼蟲的唾液腺細胞更類似于黏液性腺細胞,胞質內未見明顯的分泌顆粒,而以半透明的分泌物為主。Kim等(2011)提取黑水虻幼蟲唾液腺和腸道消化酶并分別測定其活性,發現腸道中的消化酶活性遠高于唾液腺,表明唾液腺分泌消化酶的能力有限,其分泌物主要為粘性的粘糖蛋白。本研究初步進行了黑水虻唾液腺組織結構的觀察,但其細胞內部的超微結構,還需利用透射電鏡進行進一步觀察,以有助于了解其分泌特性。

黑水虻幼蟲前腸由食道與前胃組成。食道有發達的肌肉層和角質的內壁,說明食道可起到研磨、擠壓及過濾食物的作用(Zhangetal., 2012)。前胃的結構和家蠅幼蟲類似,內層為食道末端陷入形成的套管樣結構,管內壁有密集的胃刺;外層是一層強嗜堿性上皮(胡蓉等, 2013),兩者之間是圍食膜包裹的圓形囊腔,腔內嗜酸性染色。表明經研磨的食物通過食道末端的胃刺過濾后,進入前胃,并可能經胃內的消化液(酸性)進行初步消化后進入中腸。此外,果蠅的前胃可誘導表達抗菌肽基因(Tzouetal., 2000),黑水虻前胃是否具有類似的功能還有待進一步的研究。

中腸是消化吸收的主要場所。和其它昆蟲類似,黑水虻的中腸具有多樣性的腸壁細胞,包括柱狀細胞、再生細胞等(Miguel-Aliagaetal., 2018)。果蠅的中腸大致可分為前中腸,中中腸以及后中腸三個部分,但還可以根據細胞形態及功能進一步細分為十多個區域(Buchonetal., 2013)。類似的,黑水虻幼蟲的中腸也可大致分為前、中、后三部分,pH染色分別呈現酸性、強酸性和堿性,每個區域都具有獨特的細胞形態和功能特征,其中,承擔消化分泌功能的部位主要是中腸前段(Bonellietal., 2019)。本研究對腸道形態及腸壁細胞的組織學觀察結果基本與之相符,即將中腸分為前、中、后三段,但又對中腸中段進行了進一步的細分(A段和B段)。其中,中腸前段腸壁較厚,腸上皮細胞包括柱狀上皮細胞、分泌細胞以及再生細胞,微絨毛發達。本實驗室前期研究發現,此部位的柱狀上皮細胞中含有大量線粒體、內質網以及高爾基體,可能為產生消化酶及進行能量代謝的重要場所(Sunetal., 2021)。中段被分為A、B兩段的依據是,在A段的腸上皮發現了銅細胞;該細胞具有酸化腸道內容物的能力,使得黑水虻此段腸腔pH值明顯低于其他腸段(McNultyetal., 2001)。在果蠅中腸也觀察到類似的現象(Overendetal., 2016),推測可能是為某些消化生理活動提供獨特的環境。而B段腸腔較大,腸壁薄,細胞扁平,掃描電鏡在此段則未觀察到類似于前段的微絨毛結構。Bonelli等(2019)在此段檢測到了較高的溶菌酶活性,推測此段可能不參與消化過程,而是在殺滅食物中的病原體方面發揮作用。中腸后段的組織結構與前段相似,但有研究發現,此段分泌細胞數量較前段有所減少,表明可能此段消化酶的分泌功能有所減弱(Bonellietal., 2019)。掃描電鏡在此段發現了球狀細菌的定植,但其種屬和功能尚不清楚。梅承等(2017)從黑水虻幼蟲腸道中分離及培養了腸球菌屬Enterococcus,其豐度可能受食物成分和養殖環境的誘導(Liuetal., 2020)。腸球菌屬被發現為家蠶腸道中的優勢菌群(Whitmanetal., 1998),也從海南象白蟻Nasutitermeshainanensis前腸和中腸被分離到(楊書燕, 2016)。黑水虻幼蟲的后腸未分化,腸壁較薄,腸上皮細胞排列稀疏,內膜向腸腔凹陷,形成豐富的褶皺,這是大部分昆蟲后腸的組織特征(Novak, 1975)。這樣的特征使后腸吸收表面積大大增加,有利于物質的交換及重吸收(程會昌, 2007; Miguel-Aliagaetal., 2018)。本研究還在后腸內壁發現了豐富的桿狀細菌,表明后腸也是共生微生物活動的重要場所(Aoetal., 2021)。

馬氏管著生于中、后腸交界處,為大多數昆蟲的排泄系統,對調節機體水分平衡起到重要作用(Cagan, 2003)。黑水虻幼蟲的馬氏管有4根,管壁由單層上皮細胞組成,每2～5個細胞環繞一圈形成管壁(王蔭長, 2004)。電鏡照片顯示,馬氏管管腔內壁有大量的微絨毛;類似的結構在大頭金蠅Chrysomyamegacephala中能夠被觀察到(Boonsriwongetal., 2007),大大增加了馬氏管管腔內的表面積,從而有利于物質的交換(Zhangetal., 2012)。

綜上,本研究對黑水虻不同發育階段的消化道形態進行了觀察比較,并重點對幼蟲消化系統的組織結構進行了研究,初步掌握了各消化器官及消化腺的組織學特征。研究結果為進一步了解黑水虻的消化生理特征提供了重要的形態學依據。然而,由于光學顯微鏡和掃描電鏡的局限性,本研究對消化道各組織細胞的內部結構缺乏進一步的了解。因此,未來還需利用透射電鏡,結合組織化學等工具或方法,對黑水虻消化系統的細胞結構及功能作深入的分析,從而深入地了解黑水虻對營養物質的消化、吸收、代謝過程。