貴州佛頂山國家級自然保護區東方蜜蜂群體遺傳分析

萬 煒,李 應,黎華君,姚 丹,于瀛龍,韋小平

(貴州省農業科學院現代農業發展研究所,貴陽 550006)

蜜蜂是自然界重要的傳粉者,在長期的進化過程中與植物形成了相互依賴、相互促進的協同進化關系,在后足、絨毛等形態構造上發生了特化,使其成為最理想的傳粉昆蟲,能夠保障植物的生存與繁衍,促進植物遺傳多樣性的形成,是生態系統中不可或缺的重要組成部分(王華堂等,2022)。自然保護區將生態景觀、野生動植物劃定在相對隔離的區域內,以保護棲息地、物種、亞種和種群的完整,保障生物多樣性和生態系統多樣性(王昌海,2019;王偉和李俊生,2021)。自然保護區在維持野生動植物的多樣性上發揮了重要作用(馬堆芳等,2021;劉鋒等,2022;閆振天等,2022)。

佛頂山國家級自然保護區(簡稱“佛頂山保護區”)位于貴州省銅仁市石阡縣,環境溫暖濕潤,雨量充沛,具有明顯的中亞熱帶季風山地濕潤氣候特征(劉鋒等,2022)。保護區以中亞熱帶常綠闊葉林森林生態系統及其珍稀動植物物種為保護對象,內有蜜粉源植物紫云英Astragalussinicus、刺槐Robiniapseudoacacia、獼猴桃Actinidiachinensis等野生植物2 392種(羅惠寧等,2021),為蜜蜂的生存和繁衍提供了基礎。佛頂山處于武陵山脈和苗嶺山脈之間,北鄰梵凈山、南接雷公山,扮演著生態廊道的角色,是3個保護區物種基因交流的中間地帶。此前對這3個保護區的苔蘚植物進行比較研究發現苔蘚植物相似性系數較接近、親緣關系較近(楊冰等,2018)。東方蜜蜂群體遺傳研究有涉及到梵凈山、雷公山保護區,從單個保護區的角度展示了對蜜蜂資源的保護作用,但佛頂山保護區對東方蜜蜂遺傳多樣性的保護效果、在維持保護區間的蜜蜂基因交流中的作用仍然未知。

微衛星標記屬于共顯性遺傳分子標記,多態信息含量高,常被用來解決形態標記等連續性數量標記無法解決的蜜蜂遺傳多樣性問題。利用微衛星標記已明確了我國云南(Jietal.,2011)、廣西(周姝婧等,2021)、東北(郝璐楠等,2019)等地的東方蜜蜂遺傳多樣性水平。本研究擬利用15個微衛星標記對貴州佛頂山國家級自然保護區的東方蜜蜂進行群體遺傳分析,并與梵凈山和雷公山東方蜜蜂進行比較分析,以闡明佛頂山保護區東方蜜蜂的遺傳特征、遺傳分化現狀和遺傳多樣性水平,揭示佛頂山保護區在東方蜜蜂基因交流上的生態廊道效應,為東方蜜蜂種質資源保護與評價提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

蜜蜂樣本采自貴州佛頂山國家級自然保護區,該保護區位于貴州東北部,介于梵凈山和雷公山之間,與梵凈山、雷公山的距離分別為79 km和108 km。蜜蜂樣本量為168群(表1),樣本采集對象為健康、群勢正常、無外來引種的蜂群。蜂群全部為非活框原始飼養,來源為野外自然分蜂。樣本采集后用無水乙醇保存,并放置在-20℃的冰箱中保存備用。

表1 佛頂山保護區東方蜜蜂樣本信息

1.2 實驗方法

每個蜂群的樣本取1頭工蜂,利用UNIQ-10柱式試劑盒、2×SanTaq PCR Mix試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取蜜蜂胸部基因組。同類研究中使用的微衛星位點共有72個(Takahashietal.,2009;吉挺等,2009;Yuetal.,2019;周姝婧等,2021),根據其在東方蜜蜂中的多態性情況,篩選多態性良好的UN244T、Ac-1、Ac-2、Ac-5、AC011、Ac-26、Ac-35、AP085、AP189、AP313、AT004、AT185、BI314、K0715、UN117共15個微衛星位點進行擴增,擴增條件參考Yuetal.(2019),擴增產物委托生工生物工程(上海)股份有限公司用ABI 3730xl自動測序儀(美國應用生物系統公司)進行毛細管電泳檢測,電泳內標為GeneScanTMLIZ?[500],利用Genemapper 4.0軟件生成電泳圖譜,程序選擇GS500(-250)LIZ,其余程序默認。

1.3 數據分析

檢測獲取的微衛星數據開展遺傳多樣性與遺傳分化的數據分析。遺傳多樣性分析中,利用GenAlEx 6.5軟件(Peakall and Smouse,2012)計算期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)、等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、香農指數(I)和多態信息含量(PIC);利用Neestimator 2.01軟件(Doetal.,2014),采用連鎖不平衡方法(臨界值0.05)計算蜜蜂有效種群大小。在遺傳分化分析中,為了分析佛頂山保護區的生態廊道效應,引入梵凈山、雷公山同類研究的數據開展遺傳分化研究(于瀛龍等,2021)。利用Structure 2.3.4軟件(Pritchardetal.,2000)分析遺傳結構,K值設為2～6,每個K值重復10次,馬爾可夫鏈重復次數設置為100 000,burn-in設置為10 000,利用CLUMPP 1.1.2(Jakobsson and Rosenberg,2007)和Distruct 1.1軟件(Rosenberg,2004)繪制圖片。利用R 4.0.5軟件(R Core Team,2016)進行主成分判別分析(DACP),保留主成分的80%變異信息,以評價3個自然保護區之間的遺傳分化程度。利用GenAlEx 6.5軟件(Peakall and Smouse,2012)計算遺傳分化系數(FST)、基因流(Nm)和Nei遺傳距離,并進行Mantel Test以評估遺傳分化與地理距離之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 佛頂山保護區東方蜜蜂的遺傳多樣性

佛頂山保護區東方蜜蜂在15個微衛星位點上的平均期望雜合度為0.6948±0.0374、觀察雜合度0.6682±0.0094、等位基因數10.07±5.55、有效等位基因數4.06±2.02、香農指數1.5345±0.5060、PIC值0.6552±0.1608,有效種群大小為825.3(396.8～34 974.4)(表2)。

表2 佛頂山保護區東方蜜蜂的遺傳多樣性水平

2.2 佛頂山保護區東方蜜蜂與鄰近保護區的基因交流

Structure分析顯示在K=2～6的假設下,佛頂山保護區與臨近的梵凈山、雷公山保護區的東方蜜蜂沒有表現出明顯的分組情況,說明3個保護區之間的東方蜜蜂沒有發生遺傳分化(圖1)。DAPC分析結果顯示佛頂山保護區東方蜜蜂與臨近的雷公山、梵凈山保護區聚在一起,沒有明顯的分離(圖2)。

圖1 佛頂山保護區與梵凈山、雷公山保護區的東方蜜蜂Structure分析圖

圖2 佛頂山保護區與梵凈山、雷公山保護區的東方蜜蜂主成分判別分析

佛頂山、梵凈山、雷公山3個自然保護區的東方蜜蜂在15個微衛星位點上的FST為0.006±0.001(0.001～0.013),Nei遺傳距離介于0.012～0.027,處于無遺傳分化狀態。Nm為65.911±15.816(18.631～266.122),基因交流現象明顯。Mantel Test顯示遺傳分化程度與地理距離之間無相關關系(R2=0.0058,P=0.300)(圖3),與高度差異之間無相關關系(R2=0.0065,P=0.250)(圖4)。

圖3 佛頂山、梵凈山、雷公山保護區東方蜜蜂遺傳分化與地理距離的Mantel Test分析

圖4 佛頂山、梵凈山、雷公山保護區東方蜜蜂遺傳分化與高度差的Mantel Test分析

綜合多種遺傳分析的結果,佛頂山保護區的東方蜜蜂與臨近的梵凈山、雷公山保護區之間沒有發生遺傳分化,存在暢通的基因交流。

3 結論與討論

3.1 佛頂山保護區東方蜜蜂的遺傳多樣性

通過與同類研究比較,佛頂山保護區東方蜜蜂擁有較高的遺傳多樣性。與臨近的梵凈山、雷公山保護區東方蜜蜂相比(于瀛龍等,2021),佛頂山保護區東方蜜蜂在15個微衛星位點上的平均期望雜合度、觀察雜合度、等位基因數、有效等位基因數、香農指數、PIC值,有效種群大小上均為3個保護區中的最高。與中國其余地區東方蜜蜂相比(陳晶等,2008;Jietal.,2011;徐新建等,2013a;徐新建等,2013b;于瀛龍等,2013),佛頂山自然保護區東方蜜蜂在Ac-1位點上的PIC為最高,等位基因數與最高水平持平;在Ac-2位點上的He、PIC、Na為最高;在Ac-5位點上的等位基因數與最高水平持平;在Ac-26位點上的PIC為最高;在Ac-35位點上的等位基因數為最高。本研究一方面豐富了佛頂山保護區內的生物資源研究,一方面體現了自然保護區在蜜蜂遺傳多樣性保護上的積極作用。

佛頂山保護區東方蜜蜂的遺傳多樣性較高,主要原因是蜜蜂以大種群形式存在、保護區內蜜蜂資源保護良好、保護區之間基因交流充分。具體原因包括:(1)佛頂山保護區內東方蜜蜂有效種群大小為825.3,梵凈山、雷公山保護區的有效種群大小分別為561.2和430.8(于瀛龍等,2021),在3個保護區中,佛頂山保護區東方蜜蜂有較高的種群規模,容易形成更高的遺傳多樣性。(2)佛頂山保護區內東方蜜蜂蜂群全部采用非活框的舊式蜂箱飼養,無人為引種操作,避免了人工育王、引種等外界干擾行為對蜜蜂群體遺傳的影響。(3)3個保護區之間維持了明顯的基因交流,佛頂山保護區位于三者的中間,高強度的基因交流也促進了佛頂山保護區東方蜜蜂的遺傳多樣性。基于以上因素,佛頂山保護區內東方蜜蜂得以維持高水平的遺傳多樣性。

3.2 佛頂山保護區在東方蜜蜂上的生態廊道效應

綜合多種遺傳分化分析的結果,佛頂山保護區東方蜜蜂與其北側的梵凈山、南側的雷公山保護區東方蜜蜂沒有產生遺傳分化,三者基因交流現象明顯,本研究結果顯示佛頂山保護區在梵凈山、雷公山兩個保護區之間起到了重要的生態廊道的作用。3個保護區沒有遺傳分化的主要原因為:3個保護區均自然維持了一定的種群規模(430.8～825.3),三者之間無明顯的人為干擾和地理屏障等因素影響基因流,三者距離不超過110 km,處于蜜蜂可以充分基因交流的距離內(郭慧萍等,2016)。

佛頂山保護區與梵凈山、雷公山的距離分別為79 km和108 km,3個自然保護區最北端至最南端約為198 km,佛頂山保護區位于三者中間,該保護區的存在不僅為當地東方蜜蜂遺傳資源提供了良好的棲息地環境,維持了豐富的遺傳多樣性,同時在溝通梵凈山、雷公山東方蜜蜂基因交流上發揮了不可或缺的作用,利于整體的遺傳多樣性保護。本研究的結果揭示在110 km內的多個自然保護區的建立,可以維持東方蜜蜂種群的自然基因交流,避免蜂群的近交衰退,有利于蜜蜂遺傳多樣性的維持,可有效的實現本土蜂種資源的保護。

致謝：感謝貴州佛頂山國家級自然保護區管理局在本研究中提供的幫助,感謝蜜蜂樣本采集中給予協助的陳厚羽同志和各位蜂農朋友。