溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾的亞致死效應

張 勇,寧 旭,謝云茜,王 敏,崔汝強,彭文文,傅小香,石緒根**

(1.江西農業大學農學院,南昌 330045;2. 江西農業大學國土資源與環境學院,南昌 330045)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda,是一種雜食性鱗翅目害蟲,原產于美洲熱帶和亞熱帶地區,具有較強的遷飛性、繁殖能力強,生活周期短,可危害玉米、甘蔗、高粱、大麥和水稻等353種植物,并造成嚴重經濟損失,2018年聯合國糧農組織將其列為全球預警的超級害蟲(FAO, 2018;Liuetal., 2020)。自2019年1月,草地貪夜蛾從云南入侵我國后,不到一年時間迅速蔓延至全國20余省(自治區、直轄市)發生為害(楊學禮等, 2019; 章婉賢等, 2019)。

化學防治具有見效迅速、防效徹底等特點,被廣泛用于爆發性和突發性有害生物的控制(吳孔明, 2018)。目前,在農業生產中,草地貪夜蛾的防治主要以化學防治為主。然而,在農業害蟲防治過程中,抗藥性的產生是降低農藥防治效果的主要原因之一。目前草地貪夜蛾已在全世界范圍內對超過40種殺蟲劑產生了不同程度的抗性,其中既包括有機磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類等傳統殺蟲劑,也包括雙酰胺類、多殺菌素等新型殺蟲劑(Sparksetal., 2020)。入侵我國的草地貪夜蛾同樣對有機磷類等傳統殺蟲劑產生了高水平抗性(Zhangetal., 2021),而對氯蟲苯甲酰胺等雙酰胺類藥劑的抗性處于較低水平(Lvetal., 2021)。但已有證據表明,該蟲對氯蟲苯甲酰胺、乙基多殺菌素等新型殺蟲劑的抗性風險很高(Gutiérrez-Morenoetal., 2018; Boaventuraetal., 2020; Liraetal., 2020)。

溴蟲氟苯雙酰胺是一種新型γ-氨基丁酸(GABA)門控氯離子通道別構調節劑,不同于氯蟲苯甲酰胺(作用于魚尼丁受體)的作用機理,其作用于昆蟲神經細胞中的GABA受體,別構抑制GABA激活的Cl-通道,抑制Cl-向神經細胞傳遞,引起受藥昆蟲過度的興奮和抽搐,最后實現快速的殺蟲作用(柳愛平等, 2020)。

草地貪夜蛾對化學殺蟲劑的代謝抗性機制,主要包括微粒體多功能氧化酶、谷胱甘肽-S-轉移酶和酯酶等相關酶系代謝能力的增強(Amezianetal., 2021; Hilliouetal., 2021)。保護酶與昆蟲防御外來有害物質相關,可以避免害蟲體內膜系統受損,降低蟲體于逆境中所受傷害,其活性增強亦可能增強害蟲對化學殺蟲劑的抵抗力(Bolteretal., 1990)。

在田間施用化學殺蟲劑時往往會存在藥劑低劑量殘留或噴灑不均勻,會對田間害蟲產生亞致死效應(全林發等, 2016; Pérez-Aguilaretal., 2018)。化學殺蟲劑對昆蟲的亞致死效應涉及的學科領域包括害蟲行為學、生物學、生理學及抗藥性發展等很多方面,有關研究可為藥劑的合理使用和抗藥性治理提供一定的理論依據(Dongetal., 2017; 梁煒博等, 2017; Jungetal., 2018)。有關溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾的亞致死效應目前缺乏研究,因此,本研究采用亞致死劑量溴蟲氟苯雙酰胺處理草地貪夜蛾3齡幼蟲,研究其對草地貪夜蛾生物學特性、體內解毒酶和保護酶活性的影響,以期為大田作物生產中合理使用全新殺蟲劑溴蟲氟苯雙酰胺提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試草地貪夜蛾種群幼蟲于2020年6月采自江西省南昌市新建區樂化鎮(115.87° W,28.82° N)前期未施過藥的玉米田。將采集的幼蟲在人工氣候箱內(溫度25±1℃、相對濕度70%±5%、光周期L∶D=16 h∶8 h)用新鮮未施藥的玉米葉片飼養,成蟲以10%蜂蜜水提供營養。以F10代3齡初孵幼蟲作為試驗蟲源。

1.2 供試藥劑

97.0%溴蟲氟苯雙酰胺原藥(Broflanilide)來源于德國巴斯夫公司;乙二胺四乙酸(EDTA)來源于石家莊杰克化工有限公司;苯基硫脲(PTU)來源于上海阿拉丁生化科技有限公司;二硫蘇糖醇(DTT)來源于上海吉至生化科技有限公司;苯甲基硫酰氟(PMSF)、二硝基氯苯(CDNB)均來源于上海恪敏生物科技有限公司;牛血清蛋白(BSA)來源于上海藍季生物有限公司;十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、十二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4·12H2O)均來源于天津市大茂化學制劑廠;多功能氧化酶(MFO)酶活性測定試劑盒(ELISA法)購自江蘇酶免實業有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)及過氧化氫酶(CAT)酶活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;底物和顯色劑混合液:0.2 mol/L pH6.0 PBS與固藍RR鹽與100 mmol/L α-NA乙醇溶液按1∶2∶0.01比例混合(定性濾紙過濾,并現用現配)。

1.3 試驗儀器

人工氣候箱(上海新苗QHX-300BSH-Ⅲ)、萬分之一天平(日本島津ATX224型)、手動微量點滴儀(Burkard PDE0003)、培養皿(直徑9 cm)、酶標儀(SpectraMax190)、高速冷凍離心機(Eppendorf Centrifuge5430R)、渦旋儀(美國SIvortex-genie2)、玻璃勻漿器(5 mL)。

1.4 試驗方法

1.4.1室內毒力測定方法

用點滴法對玉米草地貪夜蛾3齡初孵幼蟲進行毒力測定,蟲重平均3 mg。將原藥用丙酮配置成1×104mg/L的母液,然后用丙酮將母液稀釋成5個系列濃度梯度(10、15、20、25、30 μg/mL),并用丙酮處理作空白對照。用微量點滴器將藥液逐個點滴于3齡初孵幼蟲(長度約0.8 cm)的前胸背板上,每頭0.2 μL,點滴后的幼蟲放入培養皿(9 cm),給予充足的新鮮玉米葉片并每天更換。每濃度4次重復,每重復10頭3齡幼蟲。藥劑處理后的試蟲放在人工氣候箱(溫度25±1℃、相對濕度70%±5%、光周期L∶D=16 h∶8 h)中飼養。48 h后觀察結果,毛筆輕觸無反應或出現畸形、抽搐、停止取食等明顯中毒癥狀,判定為死亡。記錄死亡蟲數、存活蟲數,計算校正死亡率。

1.4.2試蟲處理

1.4.2.1 生物學指標觀察

利用室內生物測定測得的亞致死劑量(LD15和LD30),分別點滴處理草地貪夜蛾3齡幼蟲。每濃度5次重復,每重復20頭幼蟲,并用丙酮處理組做對照,處理好的幼蟲放入培養皿(9 cm),給予新鮮充足玉米葉片。48 h后將對應濃度剩余活蟲單頭飼養于培養皿中,每天定時給予新鮮且充足玉米葉片,每間隔24 h觀察記載不同處理組各生物學指標。在各處理組中隨機選取同日羽化的雌、雄成蟲各1頭配對,每對作為1次重復,每處理至少重復25次。將配對成蟲放入保鮮袋(28 cm×25 cm)內,袋中放已浸泡10%蜂蜜水的脫脂棉,給予成蟲補充營養,并用標簽紙封口。每天更換保鮮袋和含10%蜂蜜水的脫脂棉,直到雌蛾死亡,收集并記錄產于保鮮袋上的蟲卵量,計算單雌產卵量。試蟲的生長在人工氣候箱(溫度25±1℃、相對濕度70%±5%、光周期L∶D=16 h∶8 h)條件下進行。

1.4.2.2 酶活性試驗

分別采用溴蟲氟苯雙酰胺LD15、LD30、LD503個劑量點滴處理草地貪夜蛾3齡初孵幼蟲。每濃度5個重復,每重復30頭幼蟲,并用丙酮處理作對照。48 h后收集仍存活幼蟲,液氮速凍,置于-80℃保存,作為酶活測定的樣本備用。

1.4.3酶活性測定

1.4.3.1 解毒酶酶液制備

用萬分之一電子天平,稱取8～12 mg (3～4頭)的3齡幼蟲為一個樣本,加入1.2 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.6,含1 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,1 mmol/LPTU,1 mmol/L PMSF,20%甘油)冰浴勻漿。放入4℃,13 000 g離心30 min,取上清液到新的1.5 mL離心管中。再次在4℃,13 000 g離心10 min,取上清液到新的1.5 mL離心管中。最后在4℃,13 000 g離心5 min,得到酶粗提液。將其稀釋10倍(用0.1 mmol/L,pH7.6 PBS稀釋),后用于谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)酶活力、羧酸酯酶(EST)酶活力及蛋白濃度測定。

MFO酶源制備:分別隨機稱取8～12 mg(3～4頭)的3齡幼蟲加入適量的預冷pH 7.2～7.4左右的PBS,然后用冰浴研磨器研磨,4℃離心20 min(2 000～3 000 r/min),取上清液作為待測酶液。

1.4.3.2 解毒酶活性測定

(1) GST活性測定

依據Yang等(2004)的方法測定GST活性。分別在96孔酶標板中加入稀釋10倍的酶液10 μL、1.2 mmol/L CDNB 100μL、6 mmol/LGSH 100 μL。用酶標儀在波長340 nm處測定吸光值,溫度設定為30℃,每10 s記錄一次,反應20 min。

(2) EST活性測定

依據Yang等(2004)的方法測定EST活性。在96孔板中依次加入稀釋10倍的酶液20 μL、底物和顯色劑混合液205 μL,然后用酶標儀在450 nm處測定吸光值,溫度設定為27℃,每30 s記錄一次,反應10 min。

(3) MFO活性測定

MFO活性測定用酶聯免疫法。在標準品孔中加入不同濃度的標準品50 μL,樣本孔中先后加入待測樣品10 μL和樣本稀釋液40 μL;兩類孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL,恒溫箱溫育30 min,20倍洗滌液重復洗板5次,于每孔中加入底物A、B各50 μL,震蕩混勻,37℃避光孵育15 min;每孔加入終止液50 μL,以空白孔調0,15 min內在450 nm波長下測定吸光度(OD值),計算酶的比活力。

1.4.3.3 總蛋白測定

參照Bradfold等的考馬斯亮藍(G-250)法(Bradford, 1976)測定。

1.4.3.4 保護酶酶源制備

分別取上述試蟲3～4頭(約8～12 mg),加入適量的預冷勻漿液后冰浴研磨,4℃下12 000 r/min離心10 min,取上清液作為待測酶液。

1.4.3.5 保護酶活性測定

均按照南京建成對應試劑盒說明書進行測定。

(1) SOD活性測定(羥胺法)

SOD活性測定:以SOD抑制率達50%時所對應的酶量為1個SOD活力單位(U)。

SOD抑制率(%)={(對照OD值-對照空白OD值)-(測定OD值-測定空白OD值)}/(對照OD值-對照空白OD值)×100

SOD活性=SOD抑制率/(50%)×反應體系稀釋倍數/待測樣本蛋白濃度

(2) POD活性測定

POD活性測定: 以1 mg組織蛋白在37℃每分鐘催化1 μg底物的酶量定義為1個酶活性單位(U)。

POD活性=(測定OD值-空白OD值)/(12×比色光徑)×反應液總體積/樣本量×1000/(反應時間×待測樣本蛋白濃度)

(3) CAT活性測定(紫外法)

CAT活性測定: 以1 mg組織蛋白每秒分解1 μmol H2O2的量定義為1個酶活性單位(U)。

CAT活性={(對照OD值-測定OD值)×271×[1/(60×取樣量)]}/待測樣本蛋白濃度

蛋白含量測定:

待測樣品蛋白濃度(μg/mL)=(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×樣品測試前稀釋倍數×標準品濃度

1.5 數據處理

利用SPSS 25.0軟件計算溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾3齡初孵幼蟲的致死中量及95%置信限、相關系數等,采用Duncan’s新復極差(DMRT)法分析酶活數據的差異性。

2 結果與分析

2.1 溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾的室內毒力

溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾3齡幼蟲室內毒力結果如表1所示:致死中量為0.50 μg/g,亞致死劑量LD15和LD30分別為0.30 μg/g和0.38 μg/g。

表1 溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾3齡幼蟲的室內毒力

2.2 亞致死劑量溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾生物學特性的影響

在溴蟲氟苯雙酰胺亞致死劑量(LD15和LD30)脅迫下,草地貪夜蛾各生物學指標變化情況如表2所示。與對照相比,LD30處理能顯著延長產卵前期和升高了成蟲畸形率,但LD15處理的產卵前期和成蟲畸形率與對照相比無明顯差異。LD30處理較對照的產卵前期延長了14.9%,成蟲畸形率升高了376%;幼蟲存活率隨處理劑量的增加顯著降低。與對照相比,LD30處理顯著降低蛹重、成蟲重和單雌產卵量,并縮短產卵期,但LD15處理無明顯差異。LD30處理較對照的蛹重、成蟲重和單雌產卵量降低率分別4.5%、13.2%和20.3%,產卵期縮短率為11.8%。各處理間幼蟲期、蛹期、化蛹率、雌雄性比、成蟲羽化率無明顯差異。

表2 溴蟲氟苯雙酰胺亞致死劑量處理對草地貪夜蛾存活和生長發育的影響

2.3 溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾體內解毒酶和保護酶活性的影響

2.3.1溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾體內解毒酶活性影響

不同劑量溴蟲氟苯雙酰胺(LD15、LD30和LD50)處理草地貪夜蛾后,其體內解毒酶活力變化情況如圖1所示。結果表明,草地貪夜蛾體內GST和EST的比活力隨藥劑濃度的升高而增加,呈明顯正相關。高劑量溴蟲氟苯雙酰胺(LD50)處理組GST和EST比活力最高,分別為對照組的1.84倍和1.54倍。LD30和LD50兩個處理顯著誘導草地貪夜蛾3齡幼蟲體內MFO的比活力升高,LD30劑量處理組MFO的比活力最高,為對照組的1.33倍,但LD15處理體內MFO的比活力與對照組無差異。

圖1 溴蟲氟苯雙酰胺各劑量處理后草地貪夜蛾體內解毒酶活性比較

2.3.2溴蟲氟苯雙酰胺各劑量處理對草地貪夜蛾體內保護酶活性影響

不同劑量溴蟲氟苯雙酰胺(LD15、LD30和LD50)處理后,草地貪夜蛾體內保護酶的活性變化情況如圖2所示。結果表明,各處理組SOD活性與對照組相比無顯著性差異,POD和CAT的活性隨藥劑處理劑量的增加呈現先上升后降低的趨勢,LD15和LD30處理能顯著誘導CAT活性升高,LD30處理能顯著提高POD活性,但LD50處理體內3種保護酶活性與對照無差異。其中,LD30處理體內POD和CAT活性最高,分別為對照組的1.34倍和1.35倍。

圖2 溴蟲氟苯雙酰胺各劑量處理后草地貪夜蛾體內保護酶活性比較

3 結論與討論

本研究利用點滴法測定了溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾3齡幼蟲的室內毒力。結果顯示其LD50值為0.50 μg/g,表明溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾具有很高的觸殺活性。亞致死劑量溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾生物學特性的影響研究結果表明,亞致死劑量LD30處理能顯著延長其生長發育歷期,并導致蛹重、成蟲重、幼蟲存活率和單雌產卵量等生物學指標顯著降低。這一結果與斜紋夜蛾Spodopteralitura(桑松等, 2014)、玉米螟Pyraustanubilalis(馮從經等, 2008)和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(宋永輝等, 2021)等害蟲在化學殺蟲劑亞致死劑量脅迫下的反應類似。如溴氰蟲酰胺LC20和LC40劑量處理斜紋夜蛾3齡幼蟲,其幼蟲期延長,單雌產卵量顯著降低;雙氧威和蟲酰肼亞致死劑量處理玉米螟,其幼蟲體重及化蛹率同樣明顯降低;多殺霉素LC25處理棉鈴蟲幼蟲,其幼蟲期顯著延長,蛹重和化蛹率均顯著降低。

解毒酶活性增強可提高昆蟲代謝殺蟲劑的能力,保護酶活性的增強可提高昆蟲對殺蟲劑的防御能力,兩者在昆蟲耐藥性和抗藥性機制中的貢獻均有大量的研究證實。研究表明,不同殺蟲劑對草地貪夜蛾體內各解毒酶活性的誘導作用不同。蔣興川等(2019)通過同樣作用于GABA受體的甲維鹽亞致死劑量(LD20)處理草地貪夜蛾72 h后,其體內EST酶活性明顯高于對照組。王芹芹等人(2020)采用茚蟲威亞致死劑量(LD20)處理草地貪夜蛾后,其體內MFO比活力顯著高于對照組。李浩等(2021)發現,草地貪夜蛾3齡幼蟲體內GST活性與氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量呈正相關,細胞色素單加氧酶CYP450與羧酸酯酶CarE活性則隨處理劑量升高呈現先升高后下降的趨勢。

溴蟲氟苯雙酰胺處理對不同生物體內解毒酶的誘導作用有所差異。齊浩亮等(2017)研究表明,亞致死劑量(LC20和LC40)的溴蟲氟苯雙酰胺可誘導小菜蛾Plutellaxylostella體內CarE活性升高,但對MFO和GST活性沒有顯著影響。本研究發現不同劑量溴蟲氟苯雙酰胺處理草地貪夜蛾后,其體內解毒酶GST和EST的比活力與藥劑處理濃度均呈正相關,LD50脅迫下兩者比活力最高。而解毒酶MFO的比活力以LD30處理組最高。LD50處理組的MFO比活力高于對照,但低于LD30處理,可能是由于溴蟲氟苯雙酰胺在草地貪夜蛾體內的積累抑制了MFO的活性,這與Zhan等人(2021)的研究結果類似。研究結果證明GST、MFO和EST可能都參與了草地貪夜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺的解毒過程,且以GST發揮的作用最大。

外源毒物可使昆蟲體內自由基(O2-、-OH和H2O2)的清除系統出現故障(Allenetal., 1989),對蟲體產生毒害作用,而其體內保護酶(SOD、POD和CAT)可通過清除多余的活性氧自由基,使蟲體不受外源有毒物質的侵害(Bashanetal., 2009)。害蟲體內的保護酶對不同殺蟲劑的反應程度不同。李浩等(2021)研究發現甲維鹽處理草地貪夜蛾3齡幼蟲后,其體內兩種保護酶均呈現下降趨勢,但氯蟲苯甲酰胺處理后其體內SOD和POD均上升,推測以上兩種酶可能是草地貪夜蛾對氯蟲苯甲酰胺敏感性較甲維鹽低的原因。本研究則發現亞致死劑量溴蟲氟苯雙酰胺脅迫下草地貪夜蛾體內保護酶SOD活性無明顯變化,說明SOD在降低溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾的傷害中可能并未發揮作用;CAT和POD活性隨處理劑量增加均明顯上升,且兩者在亞致死劑量LD30處理下的活性顯著高于對照組,說明POD和CAT在降低機體受到溴蟲氟苯雙酰胺脅迫的氧化損傷中發揮了作用,但LD50處理組的活性與空白對照組無差異,可能是高劑量藥劑處理對保護酶活性有明顯抑制作用。因此,POD和CAT活性的增強也有可能成為將來草地貪夜蛾對溴蟲氟苯雙酰胺產生不同水平抗性的原因。

本研究通過生物學特性及酶活性測定,初步明確了溴蟲氟苯雙酰胺對草地貪夜蛾的亞致死效應,而草地貪夜蛾經溴蟲氟苯雙酰胺處理引起GST、MFO和EST活性增加的分子機制,及POD和CAT在該蟲體內清除多余自由基的作用機制均有待進一步研究探明。