基于轉錄組測序的楚雄腮扁葉蜂飛行肌蛋白及飛行能量代謝相關酶挖掘

俞 虹 ,高 波,徐 進*,劉建宏,李永和*

(1. 西南林業大學云南生物多樣性研究院,昆明 650224;2. 西南林業大學云南省高原濕地保護修復與生態服務重點實驗室,昆明 650224;3. 四川輕化工大學生物工程學院,四川自貢 643000)

昆蟲飛行是一個復雜的機械和生化過程,其微觀機制和分子基礎有待進一步闡明(Vigoreaux, 2006; Glaeseretal., 2017)。昆蟲飛行由胸腔中發達的飛行肌驅動(Vigoreaux, 2006)。飛行肌由特化的肌原纖維(Myofibril)組成(Tiegs, 1955)。肌原纖維又由粗肌絲和細肌絲組成,粗肌絲主要由肌球蛋白(Myosin)組成,它與細肌絲的肌動蛋白(Actin)相互作用,完成肌絲的滑動過程。在飛行肌中還發現了其他保守的肌原纖維蛋白,如原肌球蛋白、肌鈣蛋白和肌聯蛋白等。隨著研究的深入,不斷又有新的昆蟲飛行肌特異性蛋白被發現,例如飛行蛋白Flihgtin、肌鈣蛋白-H和谷胱甘肽S-轉移酶(Maughan and Vigoreaux, 1999)。Flightin可以與肌球蛋白結合,維持肌節的完整性和穩定性(Ayer and Vigoreaux, 2003)。谷胱甘肽S-轉移酶可與細肌絲中的肌鈣蛋白-H相互作用,并在昆蟲飛行過程中起到至關重要的作用(Claytonetal., 1998)。通過全基因組RNAi篩選,還在果蠅中發現Spalt major(Salm)是飛行肌發育的重要調控因子(Sch?nbaueretal., 2011)。昆蟲飛行肌發育是很多蛋白質參與的調節和組裝過程,其調控機制仍有待進一步深入闡明(Vigoreaux, 2006; Glaeseretal., 2017)。

昆蟲飛行是一個極其耗能的過程,需要非常高的能量代謝及供給效率(Beenakkersetal., 1984)。昆蟲可以以碳水化合物(主要是海藻糖)、脂肪(主要是二?；视?和脯氨酸為能源物質來為飛行提供能量(Thompson and Suarez, 2009)。在一些長距離遷飛性昆蟲中,例如一些蛾類和蝗蟲,飛行最初以碳水化合物為燃料,而長距離飛行可能激活脂肪酸氧化途徑進行供能(Arrese and Soulages, 2010)。蜜蜂主要使用碳水化合物來為飛行提供能量(Thompson and Suarez, 2009),而一些甲蟲則以脯氨酸作為主要飛行能源物質(Gade and Auerswald, 2002)。相應地,一些飛行能量代謝關鍵酶也得到了鑒定,例如催化海藻糖轉化為葡萄糖的海藻糖酶、催化3-磷酸甘油醛生成丙酮酸的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(Thompson and Suarez, 2009; Arrese and Soulages, 2010)。然而,由于飛行相關研究較少,我們對昆蟲飛行和相關能量代謝機制的了解仍然有限。

近年來一些基于深度測序和生物信息學的相關研究進一步為該領域提供了更深入的見解。例如沙蟋Gryllusfirmus飛行肌轉錄組分析發現了翅型特異性基因表達(Vellichirammaletal., 2014)。

楚雄腮扁葉蜂CephalciachuxiongicaXiao是近年來云南省除松毛蟲以外新發生的重大松科植物食葉害蟲,主要危害云南松Pinusyunnanensis和華山松Pinusarmandii(蕭剛柔, 2002; 李永和, 2010)。在云南,云南松和華山松種植面積最大,為楚雄腮扁葉蜂的大發生提供了較好的條件。此外,該害蟲危害多發生在海拔高、土壤貧瘠的松林內,嚴重破壞本已十分脆弱的生態環境。本研究擬在上述基礎之上,首先通過電鏡觀測對楚雄腮扁葉蜂飛行肌顯微結構有一個初步認識,再通過飛行肌轉錄組測序和生物信息學分析,挖掘楚雄腮扁葉蜂飛行肌結構蛋白及飛行能量代謝相關酶基因,并在此基礎上構建飛行能量代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

楚雄腮扁葉蜂成蟲采自云南省尋甸縣受害云南松林內。該蟲的化蛹和羽化發生在地下,因此直接用上午從土壤中挖出新羽化的成蟲用于實驗(Yanetal., 2018)。為了減小實驗誤差,本研究均選擇雌蟲(較雄蟲大,易于取樣)用于實驗。

1.2 飛行肌電鏡觀測

取3頭新挖出(0日齡)的雌成蟲通過生理解剖獲得飛行肌組織用于電鏡觀測,每頭雌蟲為 1個重復,因此共有3個重復。

飛行肌樣品通過3.5%戊二醛溶液前固定,1%鋨酸后固定,酒精、丙酮逐級梯度脫水,環氧樹脂618滲透、包埋,半薄切片,光鏡定位,修切,LEICA-R型超薄切片機切片,檸檬酸鉛-醋酸鈾雙染色后,用JEM-1011透射電鏡進行觀察。

1.3 飛行肌轉錄組測序及分析

1.3.1cDNA文庫的構建和測序

取45頭0日齡雌蟲的飛行肌組織,每15頭雌蟲的飛行肌組織合并為一個重復用于轉錄組測序,因此共有3個轉錄組樣品。

采用Trizol reagent (Invitrogen, USA)從3個組織樣品中提取總RNA。利用帶有Oligo(dT)的磁珠從總RNA中分離出mRNA。采用RNA Fragmentation Reagents (ABI, USA)將mRNA隨機打斷,通過磁珠篩選分離出300 bp左右的小片段。在逆轉錄酶的作用下,加入六堿基隨機引物(Random hexamers),以這些片段為模板反轉合成一鏈cDNA,隨后進行二鏈合成,形成穩定的雙鏈結構。采用NEBnext Ultra RNA Library Prep Kit (NEB, USA)制備測序cDNA文庫。采用AMPure XP system (Beckman Coulter, USA)純化系統獲得150～200 bp的cDNA文庫片段。最后采用Illumina Hiseq4000平臺對合格的文庫進行測序。

1.3.2測序數據的組裝、質控及基因功能注釋

對獲得的Raw Reads進行過濾處理,獲得能夠用于后續數據分析的Clean Reads。使用Trinity 2.5.1對獲得的Clean Reads進行組裝,獲得轉錄本數據。然后,使用TGICL 2.1對Trinity轉錄本進行聚類,獲得無冗余的unigenes數據。

使用ExPASy-Translate tool確定每個單基因的ORF。通過對NCBI NR數據庫進行BLASTX比對,以閾值E <1e-5,完成單基因功能注釋。

1.3.3飛行肌結構蛋白及飛行能量代謝相關酶挖掘及生信分析

基于基因功能注釋及文獻報道,從楚雄腮扁葉蜂飛行肌轉錄組測序數據中篩選飛行肌結構蛋白。基于前人報道的昆蟲能源物質利用類型和推導的主要反應步驟,通過對昆蟲及其他物種相關研究文獻檢索以及生化和生物信息學比較分析,從楚雄腮扁葉蜂飛行肌轉錄組測序數據中篩選飛行能量代謝三條途徑可能涉及的關鍵酶。

所選蛋白序列的系統發育分析通過MEGA 7.0軟件采用最大似然法(ML)基于Poisson correction模型構建,Bootstrap重復次數為1 000次。飛行蛋白Flightin模體結構(Motif)分析采用MEME軟件進行。采用NCBI結構域數據庫預測蛋白質保守結構域。采用Swiss model和UCSF ChimeraX 1.13進行蛋白質三維結構分析。

1.3.4基于關鍵酶的飛行能量代謝途徑構建

將上述篩選到的飛行能量代謝關鍵酶構建到前人報道的基于代謝底物及產物的代謝途徑基礎骨架上(Thompson and Suarez, 2009),獲得較為完整(有代謝物及反應關鍵酶)的飛行能量代謝途徑。

2 結果與分析

2.1 飛行肌顯微結構

電鏡觀測表明,肌原纖維是組成飛行肌的基本成分(圖1)。肌原纖維橫切面為橢圓形,其間每條粗絲被六根細絲包圍,這些細絲以六邊形等距排列,粗絲與細絲數量的比例為1∶3,一般粗絲有1 000根,細絲有3 000根(圖1-a～c)。粗絲和細絲都附著在稱為Z線或Z盤的結構上,該結構垂直于纖維的長軸,從一個Z線到另一個Z線為一個肌節長度(圖1-d～f)。肌節的中間有一條窄帶,稱為M帶,M帶兩邊與Z線之間的區域稱為A帶(圖1-f)。線粒體呈不規則形狀。在線粒體和肌原纖維之間,有水平或垂直排列的氣管。肌原纖維被線粒體和氣管包圍。顯微測量表明,肌原纖維橫切面平均面積為0.771 ± 0.042 μm2,肌節平均長度為2.698 ± 0.116 μm。

圖1 楚雄腮扁葉蜂飛行肌顯微結構

2.2 飛行肌轉錄組測序和組裝

通過轉錄組測序并對原始數據進行過濾處理,樣品的平均clean reads數約為52 000 000個,單個read平均長度為148 bp。各樣品clean reads的Q20和Q30值分別為98.58%～98.67%和95.37%～95.63%,表明本研究RNA測序質量較好。

2.3 飛行肌結構蛋白篩查

基于基因功能注釋及文獻報道,從楚雄腮扁葉蜂飛行肌轉錄組測序所獲得的unigenes中共篩選到11大類飛行肌結構蛋白(表1),其中肌球蛋白(Myosin)和肌動蛋白(Actin)的unigenes數較多,分別為127個和54個。

表1 楚雄腮扁葉蜂飛行肌結構蛋白編碼基因

2.4 飛行蛋白fightin序列及系統發育分析

最新研究表明飛行蛋白Fightin具有較高的保守性,但其功能可能存在多樣性,值得進一步研究。楚雄腮扁葉蜂Flightin mRNA可編碼一個長152 aa的蛋白質。基于Flightin蛋白序列的系統發育分析表明,膜翅目昆蟲以自展支持率99%形成一個單系分支,表明該系統發育樹與傳統分類學吻合(圖2)。

圖2 基于Flightin蛋白序列構建的系統發育樹

在Flightin序列中沒有發現保守的結構域,因此進一步對其模體結構(Motif;是指序列中局部的保守區域)進行了分析。共檢測到6個Motifs(圖3),其中Motif 1、2和5在所有物種中存在。Motif 1多序列比對發現,多數氨基酸呈現較高的保守性(圖4)。在膜翅目昆蟲中,一些位置上的氨基酸表現出明顯的特異性(圖4)。

圖4 飛行蛋白Flightin同源序列Motif 1的多序列比對

2.5 飛行能量代謝相關酶篩查

基于已知昆蟲能源物質利用類型及主要代謝步驟,對昆蟲及其他物種相關生化和生物信息學研究結果進行比較分析,初步確定了昆蟲飛行能量代謝三條途徑可能涉及的27個關鍵酶(表2)。進一步基于本研究轉錄組測序及基因功能注釋,在楚雄腮扁葉蜂中找到了25個關鍵酶的同源序列(表2),未找到的兩個酶為α-1,6-葡萄糖苷酶和甘油二酯脂肪酶。這些關鍵酶一般都有多個同源異構體(不同基因編碼)或剪接異構體(同一基因通過可變剪接獲得)。

表2 昆蟲飛行能量代謝關鍵酶和代謝物(全稱、縮寫及功能)

2.6 飛行能量代謝關鍵酶序列及系統發育分析

首先選取糖原磷酸化酶(GP)及脯氨酸脫氫酶(PRODH)進行了系統發育分析。結果顯示,來自不同物種的同源序列聚集在一起,所得到的系統發育樹與傳統分類學結果完全一致(圖5)。

圖5 基于糖原磷酸化酶(GP)及脯氨酸脫氫酶(PRODH)蛋白序列構建的系統發育樹

通過文獻查閱及比對,發現黑腹果蠅DrosophilamelanogasterGPDH可分為細胞質GPDH和線粒體GPDH兩大類(圖6)。細胞質GPDH有3個編碼基因,所得異構體分別為X1、X2和X3型,每一型經可變剪接又可得到多個剪接異構體;線粒體特異性GPDH有1個編碼基因,可產生1～2個剪接異構體。基因篩查表明楚雄腮扁葉蜂及其他膜翅目昆蟲中可能只有1個細胞質GPDH(可形成多個剪接異構體)和1個線粒體GPDH(可產生1～2個剪接異構體)編碼基因(圖6)。前人在黑腹果蠅中的研究表明GPDH-X1有3個剪接異構體(圖7),其中X1-1可能為飛行肌特異GPDH,其C端的特異三聯肽(QNL)可能與GPDH定位到肌原纖維上有關。然而本研究在楚雄腮扁葉蜂及其他膜翅目昆蟲的GPDH中并未發現類似C端三聯肽(圖7)。黑腹果蠅和楚雄腮扁葉蜂的GPDH-X1均含有1個glycerol 3P_DH結構域(圖7-a～b),并具有相似的蛋白質三維結構(圖7-c～d)。

圖6 雙翅目和膜翅目3-磷酸甘油脫氫酶X1 (GPDH-X1) C末端序列比較

圖7 3-磷酸甘油脫氫酶X1 (GPDH-X1)結構域及蛋白質三維結構

2.7 基于關鍵酶的飛行能量代謝途徑構建

基于上述篩選到的關鍵酶構建了楚雄腮扁葉蜂飛行能量代謝的三條途徑(圖8)。第一條是糖酵解途徑,其初始能源物是飛行肌中的糖原和脂肪體中的海藻糖,其反應涉及15種酶,所產生的乙酰輔酶A進入三羧酸循環最終產生能量。第二條是脂肪氧化途徑,其初始能源物是來自脂肪體的甘油二酯,涉及6種酶,所得到的乙酰輔酶A進入三羧酸循環產生能量。第三條是脯氨酸氧化途徑,其初始能源物是來自脂肪體的脯氨酸,涉及4種酶,所得到的α-酮戊二酸進入三羧酸循環產生能量。

圖8 飛行能量代謝途徑和關鍵酶

3 結論與討論

楚雄腮扁葉蜂飛行肌主要由肌原纖維、線粒體和微氣管系統組成(圖1)。昆蟲飛行肌肌原纖維與節肢動物和脊椎動物的常見骨骼肌纖維相比,其長度更長并較易解離(Tiegs, 1955)。每個肌原纖維由約1 000根粗絲和3 000根細絲組成,組裝成稱為肌節的結構(圖1)。粗絲主要由運動分子肌球蛋白組成,肌球蛋白與細絲的肌動蛋白相互作用,在肌絲的滑動過程中起作用(Vigoreaux, 2006)。豐富的氣管系統和巨大的線粒體是昆蟲飛行肌的兩個最突出的特征,這些結構在生理上可以很好地適應昆蟲飛行的特殊要求(Vigoreaux, 2006)。每個線粒體都與末端氣管接觸或被末端氣管包圍,增加了飛行肌的呼吸效率(Wigglesworth and Lee, 1982)。

通過飛行肌轉錄組分析,從所獲得的unigenes中共篩選到11大類飛行肌結構蛋白(表2),其中肌球蛋白的unigenes數最多,達到了127個。肌球蛋白占肌原纖維總蛋白質含量的60%,是一類可沿著肌動蛋白絲軌道運動的分子馬達超大家族,在肌肉收縮方面發揮作用(Ojima, 2019)。本研究也找到了一個楚雄腮扁葉蜂飛行蛋白Flightin。在果蠅中,Flightin是間接飛行肌中一種多磷酸化的肌原纖維蛋白(Vigoreauxetal., 1993),對粗肌絲的長度和穩定性有重要影響,也是飛行肌收縮、拉伸、增強延遲力的關鍵決定因素(Reedyetal., 2000; Contompasisetal., 2010)。Flightin同源物不僅在有翅昆蟲目中發現,而且還在虱目和纓尾目等無翅目昆蟲目中發現(Giribetetal., 2001; Xueetal., 2013; Soto-Adamesetal., 2014)。有趣的是,該蛋白在非昆蟲的六足動物中也有發現,例如彈尾目和雙足目,甚至在一些甲殼類中也有發現,如背甲目和雙甲目(Soto-Adamesetal., 2014)。因此,飛行蛋白可能是一種具有豐富進化血統的蛋白質,并且在飛行肌之外發揮作用(Soto-Adamesetal., 2014)。在褐飛虱Nilaparvatalugens中,Flightin不僅在飛行肌中表達,而且在雄蟲的兩個腹未體節的背縱肌(DLM)中表達,還可能在DLM驅動褐飛虱雄性特異性鼓膜結構振動中起到重要作用(Chenetal., 2019)。

基于生物信息學和文獻檢索,在楚雄腮扁葉蜂中找到了25種飛行能量代謝關鍵酶(表1)?；谶@些酶在楚雄腮扁葉蜂中構建了三條可能的飛行能量代謝途徑(圖8)。楚雄腮扁葉蜂屬膜翅目(蕭剛柔, 2002)。在大多數膜翅目和雙翅目昆蟲中,碳水化合物構成飛行的主要能源物質(Martin and Lieb, 1979; Beenakkersetal., 1984)。近年研究發現,一些膜翅目的蜜蜂和黃蜂也可以使用脯氨酸作為飛行能源物質(Teulieretal., 2016)。然而,膜翅目昆蟲是否以及在多大程度上使用脂肪來為飛行提供能量仍然不清楚,值得進一步研究。

飛行中的昆蟲達到了已知的所有動物最高代謝率,但他們如何做到這一點仍然知之甚少(Glaeseretal., 2017)。生化研究表明,昆蟲飛行肌中與能量代謝有關的大多數酶的活性遠高于脊椎動物骨骼肌(Crabtree and Newsholme, 1972; Crabtree and Newsholme, 1975)。昆蟲飛行能量代謝酶對肌原纖維具有高親和力,并多以復合物的形式存在,有助于局部生成ATP(Wojtasetal., 1997; Sullivanetal., 2003)。這些顯著的生理生化特征確保昆蟲能夠以高頻率和高超的技巧進行飛行。截至目前,在作用機制方面研究較為深入的是果蠅GPDH。果蠅肌原纖維M-線中GPDH的濃度相對高于Z-線,而GPDH與后者的結合比前者更穩定(Sullivanetal., 2003)。果蠅GPDH X1型存在3種剪接異構體(圖7),其中GPDH-X1-1可能是飛行肌特異性異構體,其特有的C端的三聯肽(QNL)可能與GPDH定位到肌原纖維上有關(Sullivanetal., 2003)。本研究中,我們確實在楚雄腮扁葉蜂和其他膜翅目昆蟲中發現了多個GPDH同源異構體(圖6),但并沒有發現類似果蠅的這種C端特異三聯肽。數據庫比對搜索也沒能在果蠅以外的昆蟲物中發現類似的C端三肽,表明GPDH的進化可能存在物種特異性。