黑水虻幼蟲抗菌肽HI-3對結腸癌HCT-8細胞凋亡影響及其機制研究

馮 群,徐晨露,崔會程,孫虹霞,夏 嬙*

(1. 遵義醫科大學珠海校區,廣東珠海 519041;2. 遵義醫科大學第三附屬醫院,貴州遵義 563000)

黑水虻HermetiaillucensL. (Black soldier fly)是近年來備受關注的資源昆蟲,主要用于有機廢棄物的無害化處理(Priyambadaetal., 2021)、禽畜和水產飼料添加劑的使用(Daszkiewiczetal., 2022; Shangetal., 2022)以及抗菌肽的研究與開發,尤其在抗菌肽的研發領域成為新的關注點(Zhangetal., 2022)。研究表明,黑水虻抗菌肽具有良好的抑菌活性,可以有效抑制大腸桿菌、耐甲氧西林的葡萄球菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌等的生長(Leeetal., 2020; van Molletal., 2022),在未來醫藥研發方面具有重要潛能。然而,關于黑水虻抗菌肽的研究還多停留在抑菌方面,其抗癌作用及機制的研究還較少。

結腸癌是全球五大惡性腫瘤之一,2020年發病率占所有惡性腫瘤新發病例的10%,死亡率占所有惡性腫瘤死亡病例的9.4%(Caoetal., 2021),且具有多藥耐藥性現象(Raúletal., 2021),嚴重威脅人類的生命安全。如何提高結腸癌藥物靶向性及緩解耐藥性已成為當今研究的熱點和難點。

課題組前期研究表明,黑水虻幼蟲抗菌肽HI-3對豚鼠正常紅細胞及HEK293正常細胞無顯著影響,但可以顯著抑制HCT-8細胞的增殖(馮群等,2022),其抑制增殖與谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路抑制顯著相關(高嘉敏等,2021),但與凋亡是否相關及其具體機制尚不清楚。

本研究在課題組前期研究基礎上,利用流式細胞儀、熒光定量PCR和蛋白芯片技術探究抗菌肽HI-3對HCT-8細胞凋亡相關基因和蛋白表達影響,旨在揭示黑水虻抗菌肽HI-3對HCT-8細胞凋亡影響的可能機制,為結腸癌治療研究提供新的可選擇藥物及作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

抗菌肽HI-3由課題組通過誘導黑水虻幼蟲后提取,并利用RP-HPLC技術分離純化所得,分子量為5.98 kDa,純度大于95%;結腸癌細胞(HCT-8)標準株購于中國科學院上海ATCC細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1凋亡率檢測

將HCT-8細胞培養于含10% FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司,杭州)和1%氨芐青霉素和鏈霉素雙抗(Gibco,美國)的RPM1640(Gibco,美國)培養基中,培養環境濕度95%、溫度37℃、CO2為5%。培養24 h后將其分為4組,前3組分別加入100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL的抗菌肽HI-3溶液,加樣量均為600 μL;第4組則加入等量常規培養基作為陰性對照組,每個處理3個重復。繼續培養48 h,吸出原培養液,PBS洗滌細胞,胰蛋白酶(杭州基諾公司,杭州)消化細胞,179 g離心5 min,棄上清。再加入1 mL PBS重懸細胞,179 g繼續離心5 min,最后制成濃度為5～10×106個/mL的細胞懸液,向各組分別加入5 μL AnnexinV-FITC和PI(日本同仁化學研究所,日本)混勻,于室溫避光反應15 min,上流式細胞儀(Partec,德國)檢測。

1.2.2線粒體膜電位測定

細胞接種及加藥方式同1.2.1。干預48 h后,離心收集各濃度的HCT-8細胞,去上清,重懸各處理組細胞,向每管加入0.5 mL JC-1染色工作液(碧云天生物技術有限公司,上海),混勻后采用錫箔紙包裹避光,放回培養箱(力康生物醫療科技控股有限公司,上海)孵育30 min,用預冷的1×染色緩沖液洗滌細胞3次,再利用200 μL 1×染色緩沖液重懸細胞,上流式細胞儀檢測膜電位。

1.2.3鈣離子濃度及ROS檢測

細胞接種及加藥方式同1.2.1。干預48 h后,離心收集各濃度組HCT-8細胞,去上清,每管細胞加入鈣離子濃度檢測熒光探針Fluo-3 AM工作液(碧云天生物技術有限公司,上海),具體操作按照試劑盒說明書進行。然后離心去除殘留的染液,并用完全培養基洗滌各處理組細胞3次,分別取200 μL PBS至每管細胞,制成細胞懸液,上流式細胞儀檢測鈣離子濃度。活性氧(Reactive oxyqen species,ROS)的檢測按試劑盒(碧云天生物技術有限公司,上海)進行。

1.2.4凋亡蛋白酶Caspase活力檢測

HCT-8細胞接種及加藥方式同1.2.1。干預48 h后,吸出原培養液,PBS洗滌細胞。并加入裂解液于冰上裂解20 min,刮取細胞裂解產物至預冷的離心管中,4℃、18001 g離心15 min,收集上清液并根據BCA試劑盒(南京建成生物工程研究所,南京)說明書測定樣品蛋白濃度。取樣品與Caspase-3、Caspase-9試劑盒(碧云天生物技術有限公司,上海)中的工作液并按照試劑盒說明書混合(Caspase-3催化底物為Ac-DEVD-ρNA;Caspase-9催化底物為Ac-LEHD-ρNA),于37℃培養箱中孵育過夜,采用酶標儀(Thermo,美國)于波長405 nm處測定A值,根據ρNA標準曲線公式計算出各酶的活力。

1.2.5凋亡相關基因檢測

將處于對數生長期的HCT-8細胞培養24 h,實驗組加入1 mL濃度為200 μg/mL的抗菌肽HI-3溶液,陰性對照組加入等量培養基,放入培養箱繼續培養48 h,PBS洗滌細胞,利用RNA提取試劑盒(寶日生物技術有限公司,北京)提取細胞總RNA、RNA反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA,以cDNA為模板進行RT-RCR(Agilent,美國)擴增反應。所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,具體如表1。

表1 引物序列

反應體系:總體積25 μL。其中,2×SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL,上下游引物各0.5 μL, Rox Reference Dye II 0.5 μL,cDNA模板2 μL, ddH2O 9.0 μL。反應條件:95℃預變性30 s、變性5 s,60℃退火30 s,40個循環。擴增得Ct值,并采用2-△△Ct計算各的基因相對表達量。

1.2.6凋亡相關蛋白檢測

該實驗委托廣州駟拓柏騰生物科技有限公司完成。

調節處于對數生長期的HCT-8細胞濃度為8×105個/mL,取2 mL細胞懸液接種至加有4 mL常規培養基的培養皿(100 mm)中,培養24 h后隨機分為實驗組、陽性對照組及陰性對照組。其中實驗組加入2.5 mL濃度為200 μg/mL的抗菌肽HI-3,陽性對照組加入25 μg/mL的5-FU(Sigma,德國),陰性對照組加入等量常規培養基,繼續培養48 h。取10 μL蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail)加至990 μL 1×細胞裂解緩沖液混勻。用預冷的PBS洗滌細胞3次,向每個培養皿加入200 μL預冷的細胞裂解液,收集細胞至新的EP管于冰上放置,每隔8 min旋轉30 s混勻,共計30 min。4℃ 18001 g離心10 min,取上清。取出玻片芯片,干燥后向每個芯片(廣州瑞博奧生物科技有限公司,廣州)孔加入100 μL 1×封閉液,平放于搖床孵育1 h,吸出封閉液,分別取100 μL樣品加至芯片各點樣孔,確保陣列和樣品相對應,4℃振蕩孵育過夜,芯片洗板機(Thermo,美國)清洗玻片5次,利用熒光劑-鏈霉親和素標記P21、Caspase-3、P53、XIAP、Bax、Bcl-2、Fas、FasL抗體,利用MaPix Microarray Scanner(MoLecu Lar Devices,美國)熒光檢測信號進行檢測,激發頻率為532 nm,分辨率為10 μm。在IncuCyte ZOOM Plate Map Editor(Essen BioScience,美國)上導出芯片結果,并用自帶的軟件進行數據分析。

1.3 統計學分析

2 結果與分析

2.1 抗菌肽HI-3對細胞凋亡率的影響

不同濃度(100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)的抗菌肽HI-3均能誘導HCT-8細胞發生不同程度的凋亡,并隨著抗菌肽HI-3處理濃度的增加,HCT-8細胞凋亡率也逐漸增加,與陰性對照組相比差異顯著(P<0.01);當抗菌肽HI-3濃度為400 μg/mL時,HCT-8細胞的凋亡率達22.32%±2.09%,與陰性對照(0 μg/mL) 1.15%±0.27%以及各濃度處理組間相比均差異顯著(P<0.05;圖1)。

圖1 不同濃度的抗菌肽HI-3對HCT-8細胞凋亡率的影響

2.2 抗菌肽HI-3對細胞膜電位的影響

不同濃度的抗菌肽HI-3作用后,HCT-8細胞線粒體膜電位的變化與陰性對照組相比(圖2-A),抗菌肽HI-3處理組HCT-8細胞中JC-1單體(Q4區)增加,且具有濃度依賴性(圖2-B,C,D),即表明HCT-8細胞內的線粒體膜電位隨抗菌肽HI-3處理濃度的增加呈下降趨勢,其結果依次為:11.57%±1.04%、20.36%±0.35%、29.24%±1.05%,與陰性對照組4.48%±0.27%相比差異極其顯著(P<0.01),且各處理濃度間存在顯著差異(P<0.05;圖3)。

圖2 不同濃度的抗菌肽HI-3 對HCT-8細胞線粒體膜的影響

圖3 不同濃度的HI-3對HCT-8細胞線粒體膜電位的影響

2.3 抗菌肽HI-3對細胞鈣離子濃度的影響

HCT-8細胞內鈣離子濃度的變化顯示,各濃度抗菌肽HI-3處理組HCT-8細胞內鈣離子的平均熒光強度均較對照組高,且隨著處理濃度的增加,出現鈣離子峰右移,即熒光強度增強(圖4)。經統計分析,200 μg/mL及以上處理濃度下,HCT-8細胞內鈣離子平均熒光值與對照組相比均具有顯著差異(P<0.01;圖5),說明抗菌肽HI-3能夠選擇性的影響HCT-8細胞內鈣離子濃度的變化。

圖4 抗菌肽HI-3處理后 HCT-8 細胞內鈣離子的熒光強度變化

圖5 抗菌肽HI-3對HCT-8細胞內鈣離子平均熒光值的影響

2.4 抗菌肽HI-3對細胞內ROS的影響

不同濃度抗菌肽HI-3對HCT-8細胞內ROS的影響顯示(圖6-B),HCT-8細胞內的ROS的熒光強度隨著抗菌肽HI-3處理濃度的增加而增強,各處理組HCT-8細胞內ROS的平均熒光強度分別為:865.06±22.91、1119.65±326.41、1350.38±338.19,與陰性對照組475.13±17.51 ROS水平相比較差異顯著(P<0.05;圖6-B),但各處理濃度間比較差異不顯著(P>0.05;圖7),表明黑水虻抗菌肽HI-3能促進HCT-8細胞內ROS的釋放,但不具備濃度依賴性。

圖6 抗菌肽HI-3對HCT-8細胞ROS的影響

2.6 抗菌肽HI-3對凋亡相關基因表達的影響

200 μg/mL抗菌肽HI-3作用對HCT-8細胞凋亡分子的基因表達所示(圖8):P53、XIAP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、P21、Fas和FasL的2-△△Ct分別是0.44、0.13、1.27、4.9、1.59、0.59,0.57、0.17、1.09、0.56。與陰性對照組相比較并通過-△△Ct值判斷基因下調情況,結果顯示,P53、XIAP、Bax、Bcl-2、P21、和FasL的基因表達下調,而Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Fas的基因表達上調。

圖8 抗菌肽HI-3對HCT-8細胞凋亡因子基因表達的影響

2.7 抗菌肽HI-3對細胞凋亡因子蛋白表達的影響

200 μg/mL抗菌肽HI-3作用后,HCT-8細胞的蛋白芯片檢測結果表明,抗菌肽HI-3能影響HCT-8細胞凋亡因子相關蛋白的表達(圖9;圖10),與陰性對照組相比抗菌肽HI-3能上調HCT-8細胞凋亡因子P21和Caspase-3的蛋白表達(圖9-B);下調因子Bax、Bcl-2、Fas、FasL、P53和XIAP的蛋白表達(圖10-B);但因子Caspase-8的蛋白表達在處理前后均無變化。

圖9 抗菌肽HI-3上調HCT-8細胞凋亡分子的蛋白表達

圖10 抗菌肽HI-3下調HCT-8細胞凋亡分子的蛋白表達

3 結論與討論

隨著人民生活水平的提高,結腸癌發病率在逐年上升,且大部分結腸癌患者確診時已發生局部轉移,目前單獨的手術治療已無法清除體內的腫瘤細胞。既往研究認為,人類惡性腫瘤不僅是細胞增殖失控的疾病,而且是細胞死亡異常的疾病(Snaketal., 2018),所以細胞凋亡與腫瘤發生發展息息關聯。Hickman(1992)首次提出以誘導腫瘤細胞凋亡作為腫瘤治療手段,如今已成為大部分腫瘤治療的主要方法。細胞凋亡受多條通路的調節,包括內源性線粒體細胞色素(Cytochrome, Cyt)-C釋放通路、外源性死亡受體轉導通路及凋亡誘導因子(AIF)途徑,其中Caspase-9是內源性線粒體途徑的執行者,而 Caspase-8 是外源性凋亡途徑的執行者。研究表明,羅非魚抗菌肽TP3通過誘導線粒體過度產生ROS,從而激活Caspase-3/9,進而誘導人骨肉瘤MG63細胞凋亡(Yuanetal., 2020);抗菌肽PaDef依賴Caspase-8/9誘導急性淋巴白血病細胞凋亡,其凋亡也與ROS增加和線粒體膜電位喪失有關(Paolaetal., 2022)。本研究結果表明,隨著抗菌肽HI-3處理濃度的增加,HCT-8細胞凋亡率增加、線粒體膜電位下降、鈣離子及ROS含量增加,這與Vakifahmetoglu等(2017)研究結果相一致,即隨著線粒體膜通透性轉換孔開放,導致線粒體膜電位下降,鈣離子內流和ROS釋放。當抗菌肽HI-3處理濃度為200 μg/mL時,Caspase-9的酶活力最強,且基因及蛋白表達均上調;同時,此濃度下凋亡執行分子Caspase-3的酶活力、基因和蛋白表達一致。由于未檢測Cyt-c,所以無法確定是否通過Cyt-c依賴的線粒體凋亡途徑。但是結合細胞內ROS的增加和XIAP的表達下調,提示抗菌肽HI-3可能是通過線粒體-ROS途徑誘導HCT-8細胞凋亡,這與衍生肽B11引起線粒體功能障礙誘導Hela細胞凋亡的報道相一致(Liuetal., 2018)。

另外,細胞漿內高游離鈣可引起胞漿內的磷脂酸和內切核酸酶等活化,從而參與凋亡早期的信號轉導和凋亡的執行階段,其中更重要的是在凋亡的早期階段。本研究HI-3處理后HCT-8細胞內鈣離子濃度明顯增大,綜合下游分子Caspase-3的表達,推測抗菌肽HI-3還可能通過鈣離子信號通路誘導細胞凋亡。這與Chu等(2007)報道蜂毒素使細胞內Ca2+濃度升高,導致細胞裂解,從而引起人骨肉瘤MG63細胞凋亡的結果一致。此外,本研究中Fas、Caspase-8的基因表達上調,FasL表達下調,結果與Chen等(2014)研究α-螺旋短肽G(IIKK)3I-NH2誘導Hela細胞凋亡結果較一致。然而,蛋白芯片結果顯示Fas/FasL蛋白表達下調,Caspase-8蛋白未表達,因此,針對HI-3是否經過Fas/FasL-Caspase-8死亡受體通路誘導凋亡,還需進一步研究。綜上所述,黑水虻幼蟲抗菌肽HI-3可能通過線粒體和鈣離子信號途徑誘導結腸癌HCT-8細胞發生凋亡,在一定程度上為黑水虻抗菌肽用于抗癌治療方面奠定了實驗基礎,但關于其具體的作用機制值得后續深入探究。